Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Описание заболевания 11
2.2. Общая характеристика вируса гриппа 13
2.3. Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N1 19
Передача вируса 19
Клинические проявления 20
Патогенез 23
2.4. Способы диагностики вируса гриппа 27
2.4.3. Иммуноферментный анализ 30
2.4.4. Молекулярные методы 32
2.4.4.1. Полимеразная цепная реакция 32
2.4.4.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 38
3. Материалы и методы 44
3.1. Материалы 44
3.2. Методы 50
4. Результаты 60
4.1. Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР 60
4.1.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР 60
4.1.2. Определение специфичности ПЦР тест-системы 62
4.1.3. Определение чувствительности ПЦР тест-системы 66
4.1.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для ПЦР тест-системы 68
4.2. Разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени 72
4.2.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР 72
4.2.2. Определение специфичности тест-системы на основе ПЦР в реальном времени 75
4.2.3. Определение чувствительности разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени 78
4.2.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени 81
4.3. Разработка теста для количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N1 82
4.3.1. Использование количественного теста для определения накопления рекомбинантного вируса гриппа A/ H5N1, полученного методом обратной генетики 86
4.4. Участие в международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP) 88
4.5. Использование разработанных тест-систем для выявления вируса гриппа А подтипа H5N1 89
4.6. Разработка тест-системы на основе непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку вируса гриппа NS1 94
4.6.1. Создание рекомбинантного белка NS1 вируса гриппа 94
4.6.2. Проведение непрямого ИФА с рекомбинантным белком NS1 99
5. Обсуждение результатов 102
6. Выводы 112
7. Библиография 114
- Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N1
- Полимеразная цепная реакция
- Разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени
- Использование разработанных тест-систем для выявления вируса гриппа А подтипа H5N1
Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N1
Вирус гриппа А широко распространен в природе и способен вызывать эпидемии, пандемии и эпизоотии (Слёпушкин А.Н., 2001). Вирус гриппа А отличается высокой степенью вариабельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Известно 15 антигенных подтипов гемагглютинина (HI-HI5) и 9 подтипов нейраминидазы (N1-N9). От диких птиц изолированы вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков, при этом инфекция у диких птиц протекает в виде энтерита, без видимых признаков заболевания. Это указывает на высокую степень адаптации вирусов гриппа А к диким птицам, которые являются естественными хозяевами вирусов гриппа (Zambon М. С, 1999). Вирус сохраняется в воде в течение длительного времени (6-8 месяцев), а водно-фекальный путь инфицирования является основным механизмом поддержания персистенции вируса гриппа в природе (WHO,2005).
В 20 веке отмечены четыре пандемии: 1918 (H1N1), 1957 (H2N2), 1968 (H3N2) и 1977 (H1N1), причем две (1957 и 1968 гг.) как и пандемия 2009-2010 годов вируса гриппа свиней H1N1 были обусловлены новыми реассортантными вирусами (ВОЗ, 2005; Львов Д.К., 2010; Даниленко Д.М., 2011; Игнатьева А.В., 2011).
За последние 45 лет описано свыше 50 эпизодов возникновения эпизоотии среди домашних животных в ряде случаев сопровождающихся заболеванием людей, подчас с высокой смертностью. Вирусы H5N1 периодически выделялись от кур и других видов птиц. В 1997 году в Гонконге отмечена вспышка заболевания, обусловленная прямой передачей вируса гриппа птиц H5N1 от кур человеку (Subbarao К., 1998; Claas КС, 1998; de Jong J.C., 1997.). Это был первый подтвержденный случай передачи вируса гриппа от птиц человеку. В результате заболело 18 человек, 6 из которых умерли. Второй подобный эпизод отметили в 2003 г. в Гонконге, когда из пяти инфицированных людей двое умерло.
Начиная с 2003 года высокопатогенный вирус гриппа А подтипа H5N1 начинает распространяться благодаря диким и домашним птицам через Азию по Европе и Африке и заражать людей, контактировавших с домашними птицами (Webster R.G., 2006; Gambotto А., 2008; Maines T.R., 2005.).
С 2005 года вспышки заболевания гриппом птиц H5N1 фиксировались во многих странах Азии и ближнего востока. На сегодняшний день в Индонезии произошел, в общей сложности, 191 случай заболевания людей птичьим гриппом A(H5N1), из которых 159 случаев закончились смертельным исходом. Из этого числа 8 случаев (все смертельные) произошли в 2012 году. По данным на конец мая 2012 года в Камбодже отмечен 21 случай заражения людей вирусом птичьего гриппа, 19 из которых с летальным исходом. Из 168 подтвержденных случаев заболевания в Египте, 60 закончились смертельным исходом (ВОЗ, 2013).
Отмечается также заражение людей вирусом гриппа H7N7 (Belser J.А., 2009). Так, в 1996 году, вирус гриппа птиц H7N7 был изолирован в Канаде от женщины с конъюнктивитом. Отмечено инфицирование людей вирусом гриппа H7N7 во время вспышки гриппа птиц в Нидерландах (Koopmans М., 2004; Fouchier R.A., 2004.).
Для вируса гриппа птиц и его реассортантов отмечали частые случаи преодоления видового барьера (Brown I.H., 2008; Yassine Н.М., 2013). Зарегистрированы вспышки заболевания свиней, обусловленные вирусами гриппа птиц H1N1, лошадей H3N8, китов (H7N7, H5N5 и H4N6, H13N2 и H13N9), норок (H10N4). Отмечены случаи инфицирования домашних птиц (кур, индюков) вирусами гриппа, циркулирующими среди диких птиц, особенно водоплавающих. 2.2. Общая характеристика вируса гриппа
Возбудители вируса гриппа - РНК-содержащие вирусы, относящиеся к роду вирусов гриппа А и В, семейства Orthomyxoviridae. Высокая контагиозность и исключительная изменчивость поверхностных белков вирусов гриппа явились причинами их повсеместного распространения (de Jong M.D., 2006). На данный момент вирусы представлены согласно номенклатуре 16 подтипами гемагглютинина и 9 нейраминидазы (Поздеев O.K., 2009).
Вирусы семейства Orthomyxoviridae имеют особое сродство к мукополисахаридам и гликопротеидам (в частности, с клеточными рецепторами, содержащими сиаловую кислоту) (Webster R.G., 1992). Кроме того, имеют сходные биологические свойства, а именно: способность агглютинировать эритроциты, наличие нейраминидазы, легкость культивирования в КЭ и тропизм к органам дыхания. Вирусы имеют принципиальные различия по внутриклеточной локализации АГ, по чувствительности к препаратам, затрагивающим синтез белков и нуклеиновых кислот и по генетическим свойствам.
Согласно Международной номенклатуре, любой штамм вируса гриппа рода А обозначается по следующей схеме: род/источник изоляции/место изоляции/собственный номер изолята /год изоляции/формула вида -серотипы гемагглютинина и нейраминидазы. Для штаммов, изолированных от человека, источник изоляции не пишется; для всех других штаммов год изоляции обозначается 2-мя последними цифрами.
Семейство ортомиксовирусов (от греч. Orthos - правильный, прямой и туха - слизь) включает три рода: вирусы гриппа А и В, вирусы гриппа С и подобные вирусы. Ионный канал
Число нуклеотидов колеблется у разных штаммов вируса гриппа А. Указанные белки имеют молекулярную массу: 96 ОООД (РВ1), 87 ОООД (РВ2), 85 ОООД (РА), 50 000-60 000Д (NP), 48 000-63 000Д (NA), 63 000Д (НА). Два гена кодируют по два белка: Ml (27 000Д) и М2 (15 000Д), NS1 (25 000Д) и NS2 (12 000Д). Естественно, что у разных вирусов эти величины варьируют. Таким образом, 8 фрагментов РНК кодируют синтез 10 белков (Stamboulian D., 2000). Каждый фрагмент РНК вируса содержит одинаковую последовательность из 13 нуклеотидов на 5 -конце и 11-12 нуклеотидов на З -конце. Установлена кодирующая функция каждого фрагмента РНК. У вируса гриппа А три больших фрагмента РНК (1-й, 2-й, 3-й) кодируют белки полимеразного комплекса (РВ1, РВ2, РА), 3 промежуточных по размеру фрагмента РНК (4-й, 5-й и 6-й) кодируют нуклеопротеин и поверхностные гликопротеины и 2 малых фрагмента РНК (7-й и 8-й) - матриксные белки и 2 неструктурных белка. Кодирующие зоны генов на каждом малом фрагменте РНК частично перекрываются (Steinhauer D. А., 2002). Вирионная РНК ортомиксовирусов не является инфекционной. В вирионах обнаружено 7 белков, 4 из которых (РВ1, РВ2, PA, NP) связаны с нуклеокапсидом, а 3 (НА, NA, Ml) входят в состав липопротеидной оболочки, причем 2 из них (НА и NA) являются гликопротеинами. Гликопротеины образуют 2 вида выступов наружной оболочки вирионов. Выступы 1 -го вида образованы гемагглютинином (НА) с молекулярной массой 75-80 кД (около 500 аминокислот). Каждый выступ состоит из 3-х молекул НА, которые организованы в палочкообразную структуру. НА ответственен за адсорбцию и проникновение вирионов в клетку и гемагглютинирующую активность (ГА-активность) вируса (Velkov Т., 2013). AT к НА нейтрализуют инфекционность вируса и подавляют его ГА-активность. Выступы 2-го типа образованы нейраминидазой (NA) с молекулярной массой 60-70 кД (450-470 аминокислот). Каждый выступ состоит из 4-х молекул NA, которые организованы в грибообразную структуру. На поверхности вириона имеется примерно 500 выступов, из которых около 100 образованы нейраминидазой и 400 - гемагглютинином. В вирионах содержится 70% белка, 18-37% липидов, 5% углеводов и 1% РНК. Углеводы и липиды имеют клеточное происхождение.
Вирус связывается с поверхностным белком или липидом, обладающим сродством к сиаловой кислоте и с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза проникает в клетку (1). Везикула подвергается ацидификации и мембрана вируса сплавляется с мембраной везикулы (вакуоли). При этом в цитоплазму выходят вирусные нуклеокапсиды (2). Вирусные нуклеокапсиды, содержащие отрицательно полярную геномную РНК увеличивают копии белка NP и белки Р транспортируются в ядро (3). Отрицательно полярная РНК копируется с помощью РНК полимеразы вириона в вирусную мРНК, используя 5,-концы пре-мРНК и РНК как праймеры для инициации синтеза (4). Матричная РНК транспортируется в цитоплазму (5), в то же время происходит транскрипция участка мРНК, кодирующего NS2 и М2 (6), в рибосоме, прикрепленной к эндоплазматическому ретикулуму (ЕР) транслируются с мРНК вирусные мембранные белки (НА ,NA, М2) (7), далее эти белки участвуют в процессе секреции клетки хозяина, подвергаясь гликолизу (8). Остальная мРНК транслируется в рибосомах, находящихся в цитоплазме (9).
Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция в реальном времени на сегодняшний день является одной из самых современных модификаций данной реакции.
Отличительной чертой ПЦР в реальном времени является возможность детекции накопления продуктов амплификации непосредственно во время проведения амплификации. Так как кинетика накопления ампликонов напрямую зависит от числа копий исследуемой матрицы, это позволяет проводить количественные измерения ДНК и РНК инфекционных агентов (Lee С. W., 2004).
Полученная информация может быть использована для проведения мониторинга эффективности проводимой терапии, оценки клинического прогноза. В отличие от других методов количественного определения ДНК матрицы в пробе, ПНР в реальном времени не требует дополнительных манипуляций, связанных с раститровкой ДНК исследуемой пробы или полученных в ходе ПЦР ампликонов, которые усложняют постановку анализа и могут приводить к появлению ложноположительных результатов (Freeman W.M., 1999; Bustin S.A., 2002). Подобный подход позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории (HeidC.A., 1996).
Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный амплификатор, отличительной особенностью которого является возможность возбуждать и детектировать флуоресценцию, отражающую накопление ампликонов, на каждом цикле амплификации. На сегодня существует немного моделей приборов для ПНР в реальном времени: это "iQ iCycler" ("Bio-Rad"), несколько типов "ABI Prism" ("Applied Biosystems"), "LightCycler" ("Roche"), "SmartCycler" ("Cepheid"), различные модели "DTprime" (ДНК-технология) и другие. Рисунок 7. Прибор для постановки ПЦР в реальном времени
На рисунке 7 представлен прибор ABI Prism 7000 (Applied Biosystems) для выполнения анализов методом полимеразной цепной реакции «в реальном времени».
Интенсивность флуоресценции измеряется, и результат реакции выносится на экран монитора прибора в виде графика зависимости флуоресценции от количества циклов в реакции. Таким образом, за ходом реакции можно следить уже через несколько минут после её начала.
Регистрация флуоресценции В процессе ПЦР свет от вольфрамово-галогеновой лампы фокусируется одновременно в каждой лунке планшета. Проходя через лунки, свет возбуждает флуоресцентные красители, содержащиеся в образцах. В процессе ПЦР на стадии наращивания цепи в каждой лунке регистрируется сигнал флуоресценции в диапазоне длин волн между 500 и 660 нм.
Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют методику основанную на 5 -экзонуклеазной активности полимеразы (TaqMan Assay). В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5 -положении и гаситель флуоресценции в 3 - положении, а также фосфатная группа в 3 - положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3 - положении блокирует полимеразу.
В ходе ПЦР во время стадии отжига праимеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, при этом, чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПНР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5 -экзонуклеазной активности. Таким образом, происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение (Bustin, 2004).
Преимуществами данного метода, в отличие от классической ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале и возможность создания мультиплексных систем, позволяющих детектировать несколько возбудителей в одном образце.
Существенно повышается специфичность метода, обусловленная применением гибридизационной схемы с использованием высокоспецифичных олигонуклеотидных зондов (Stone В., 2004). Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории и нет необходимости в отдельном помещении для детекции продуктов реакции (Smith C.J., 2009).
Использование компьютерных программ позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм и значительно сокращает время проведения анализа.
Разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени
Клеточную массу лизировали охлажденным буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис-HCL + 300 мМ NaCl + ЮмМ имидазол + 0,1% тритон Х100 + 1мМ PMSF, рН 8,0 из расчета 20 мл на 1 г сырой биомассы. Лизат дезинтегрировали ультразвуком, 6 раз по 10 сек с интервалом 10 сек (на ультразвуковом гомогенизаторе Sonifier Model 250/450, США), и центрифугировали 60 мин при 10 000 об/мин. Супернатант смешивали с Ni-NTA агарозой, уравновешенной фосфатно-солевым буферным раствором [ФСБ: (20 мМ Na2HP04-NaH2P04)+ 150 мМ NaCl], рН 8,0). Смесь инкубировали при 4С и перемешивании в течение 16 часов.
Очистку белков проводили после перенесения Ni-NTA агарозы в хроматографическую колонку размером (01х1О)см. Агарозу последовательно отмывали от избытка белка трис-буферным раствором (ТБР: 20 мМ трис-НС1 + 300 мМ NaCl + 1 мМ PMSF), рН 8,0; содержащим 10, 20 и 50 мМ имидазола, контролируя процесс по оптической плотности элюатов (к= 280 нм), регистрируемой самописцем. Продукт элюировали в одну пробирку трис-буферным раствором, содержащим 250мМ имидазола.
Денатурирующие условия очистки Клеточную массу лизировали охлажденным буферным раствором [20 мМ трис-НС1 + 300 мМ NaCl + 6 М Gu-HCL + 10 мМ имидазол + 1 мМ PMSF, рН 8,0] из расчета 20 мл на 1 г сырой биомассы. Далее производили те же операции, что и при очистке белков в нативных условиях, но во все буферные растворы добавляли 6М мочевину (Johnson R.D., 1995). Иммунохимическую активность в каждой фракции определяли методом непрямого ИФА и иммуноблоттинга со специфическими моноклональными антителами (мкАТ).
Степень чистоты полученных препаратов проверяли методом SDS-электрофореза в 12% полиакриламидном геле (ПААГ). Концентрацию белка в растворах определяли с использованием коммерческого набора "Micro ВСА Protein Assay Kit" фирмы "PIERCE" (США).
Непрямой иммуноферментный анализ (ИФЛ). В лунки иммунологического планшета (Greiner, Германия) вносили 0,1 мл очищенного рекомбинантного белка, разведенного 0,1 М карбонатно-бикарбонатным буфером (КББ) рН 9.5. Планшет инкубировали 18 час при 4С, после чего удаляли избыток антигена пятикратной отмывкой ФСБТ (0,01 М фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, 0,1% твин-20, рН 7,4). Свободные участки пластика блокировали 1% Top Block (Yuro, Швейцария) в ФСБТ (1 час при 37С), удаляли блокирующий раствор и вносили в лунки 0,1 мл мкАТ в растворе ФСБТ + 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Планшет инкубировали 1 час при 37С, промывали ФСБТ и добавляли 0,1 мл меченых пероксидазой антител к иммуноглобулину G человека в растворе ФСБТ + 0,5% бычьего сывороточного альбумина ("Sigma", США). Через 1 час инкубации при 37С отмывали планшет ФСБТ и вносили в лунки 0,1 мл субстратного раствора перекиси водорода с 3,3 ,5,5 -тетраметилбензидином (ТМВ, "МДЛ", Россия). Инкубировали 20 мин при комнатной температуре и останавливали реакцию добавлением 0,1 мл 1М H2SO4. Интенсивность окраски в лунках определяли на спектрофотометре с вертикальным лучом (Multiscan МСС, Flow, Англия) при 450 нм (А450).
Учитывая большую вариабельность генома вируса гриппа типа А, при его обнаружении необходимо использовать праймеры, соответствующие наиболее консервативным участкам вирусного генома. Основой для поиска мест посадок праймеров стало сопоставление нуклеотидных последовательностей гена гемагглютинина и нейраминидазы всех вирусов гриппа, находящихся в базе данных. Всего использовали более 10000 нуклеотидных последовательностей геномов вирусов гриппа.
При выборе мест посадки праймеров учитывались следующие требования: специфичность праймеров для всех последовательностей вирусов подтипа H5N1, отсутствие мест посадки праймеров на последовательности вирусов других подтипов. В качестве дополнительных критериев, определяющих пригодность праймеров, учитывались следующие: отсутствие дупликсов праймеров и отжига их друг на друга, отсутствие мест ложной посадки на матрицы геномов различных штаммов вируса гриппа А и родственных вирусов. Этим критериям удовлетворяют все отобранные праймеры.
Эффективность и специфичность тест-системы проверена на референтных штаммах вируса гриппа, полученных из коллекции ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д. И, Ивановского» Минздрава РФ (таблица 1). Штаммы имели различную специфичность поверхностных белков. Результаты проведения ПНР с использованием разработанной тест-системы представлены на рисунке 12. Результаты исследования эпидемических штаммов вируса гриппа, выделенных от людей, показали, что с помощью разработанной тест-системы можно выявить геном вируса гриппа А подтипа N1. Специфичность тест-системы также была проверена с эпидемическими и эталонными штаммами вируса гриппа А, выделенными от животных, в том числе и от птиц. Показано наличие РНК вируса гриппа А подтипа Н5 в эталонных штаммах A/Mallard/Pensylvania/10218/84 и A/Grebe/Novosibirsk/29/05, а также РНК вируса гриппа А подтипа N1 в эталонных штаммах A/WSN/33, A/FPV/Росток И A/Grebe/Novosibirsk/29/05. При обнаружении РНК вируса гриппа А подтипа N1 положительные результаты были получены с эпидемическими штаммами А/СССР/90/77 (H1N1) и A/WSN/33 (H1N1), хранившимися в замороженном состоянии длительное время (несколько лет при -70С). Показано, что нет перекрестных реакций с вирусами других семейств (Р агатуxoviridae, Coronaviridae, Birna Viridae).
Использование разработанных тест-систем для выявления вируса гриппа А подтипа H5N1
В настоящее время грипп является одним из самых распространённых заболеваний на планете (Newmann G., 2011, Слёпушкин, 2001).
Постоянно существует серьезная угроза возникновения новой пандемии среди людей, которая может быть вызвана вирусом гриппа А подтипа H5N1 (Dawood F.S., 2009; Fraser С, 2009; Tumpey Т.М., 2009). Первый подтверждённый случай передачи вируса гриппа птиц H5N1 человеку был зафиксирован в Гонконге в 1997 году. В результате заболело 18 человек, 6 из которых умерли.
В такой ситуации очень важен мониторинг вируса гриппа среди людей и птиц, быстрое и надежное выявление возбудителя у людей с симптомами острого респираторного заболевания для принятия эффективных мер по лечению и предотвращению дальнейшего распространения вируса (Львов Д.К., 2010; Коновалова Н.И., 2010).
Сейчас традиционными методами диагностики вируса гриппа А являются вирусологические методы. Это надежные и чувствительные методы, однако, они трудоемки и на их выполнение требуется от 1 до 2 недель. В последнее время широкое распространение получили молекулярные методы диагностики. Время анализа инфекционного материала сокращается до одного дня, их чувствительность не уступает чувствительности традиционных методов.
Всемирная организация здравоохранения рекомендует использовать метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), реакцию ингибирования гемагглютинации (HI) и реакцию ингибирования нейраминидазы (N1), выделение вируса с помощью куриных эмбрионов и культур клеток (Quilivan М., 2000), иммунодиффузии в агарозном геле (AGID), а также ПЦР и ПЦР в реальном времени для диагностики вируса гриппа A (World Health Organ. 1980; Schild G.C., 1980). Золотым стандартом в диагностике вируса гриппа птиц является метод ELISA (Takimoto S., 1991.). Однако ни данный метод, ни реакции ингибирования не могут быть пригодны для идентификации вновь возникших штаммов, т.к. зависят от специфических антител. Наращивание вируса на куриных эмбрионах или культурах тканей позволяет получить большое количество вируса для последующей диагностики и типирования (Соминина А.А., 2006; Бурцева Е.И., 2001), однако это занимает от 3 до 7 дней.(\Уап R., 2010.) Метод иммунодиффузии в агарозном геле требует большого количества антигена, что предполагает его предварительное пассирование на куриных эмбрионах.
В отличие от традиционных методов современные молекулярные методы диагностики вируса гриппа не имеют таких ограничений. Их отличают такие преимущества как быстрота, надёжность и экономичность (SakuraiA.,2012.).
Для молекулярной диагностики и типирования вируса гриппа А в настоящее время применяются такие методы как ОТ-ПЦР (Herrmann В., 2001.) и ПНР в реальном времени (van Elden L.J., 2008, Лободанов С.А., 2012), также её модификации, такие как высокоскоростная ПНР в реальном времени (Sakurai А., 2011.) и количественная ПЦР в реальном времени (Aguero М., 2007; Ellis J.S., 2007.), лигазная цепная реакция, реакция транскрипционной амплификации (Lau L. Т., 2004; Moore С, 2004.), изотермальная петлевая реакция (Poon L. L. М., 2005; Imai М., 2006; Ito М., 2006.) и микрочипы (KesslerN., 2004; Li J., 2001; Lodes M. J., 2006; Townsend M. В., 2006, Fesenko E.E. 2007).
Исходя из вышеизложенного, актуальной проблемой данного исследования стало создание комплекса методов молекулярной диагностики, позволяющего определить наличие вируса гриппа А подтипа H5N1 в пробе. Данный комплекс включает создание тестов для диагностики и типирования высокопатогенного вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР и ПНР в реальном времена, а также количественной модификации ПЦР в реальном времени.
Первой разработкой в рамках данного исследования стало создание теста для определения высокопатогенного вируса гриппа А подтипа H5N1 методом одностадийной ПЦР.
Среди опубликованных работ по разработке праймеров для амплификации РНК вирусов гриппа А есть работы, описывающие как одностадийные (Fouchier R. А. М., 2000; Vabred А., 2000; Wright К. Е., 1995), так и "гнездовые" ПНР (Oxburgh L., 1999). Причем заявленная авторами чувствительность одностадийной ПНР не уступает чувствительности гнездового варианта ПЦР (Qiu B.F., 2009).
В начале данного исследования не было отечественных тест-систем для определения высокопатогенного вируса гриппа А подтипа H5N1. Праймеры для данного теста подбирались на основании известных последовательностей, размещенных в банках данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) и ISD (www.flu.lanl.gov). Всего для анализа было использовано порядка четырёхсот последовательностей генов гемагглютинина пятого подтипа и нейраминидазы первого подтипа, учитывались исследования относительно циркулирующих в Российской Федерации штаммов вируса гриппа А подтипа H5N1. Разработанные праймеры были копмлементарны консервативным областям генов НА пятого подтипа и NA первого подтипа и теоретически с их помощью можно было детектировать наличие РНК вируса гриппа А подтипа H5N1. Для проверки этого на практике нами была использована панель, состоящая из 26 референтных штаммов вируса гриппа, включающих эпидемические штаммы вируса гриппа В и вируса гриппа А, относящиеся к 9 различным подтипам по гену гемагглютинина и 7 - по гену нейраминидазы. Специфичность разработанных праймеров была проверена анализом ряда штаммов вируса гриппа В и вирусов гриппа А других подтипов и теоретически с помощью программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Были
обнаружены все вирусы гриппа А подтипов Н5 и N1 и не было выявлено ни одного ложно положительного результата при тестировании вирусов гриппа типа В или вирусов гриппа других подтипов. Показано, что нет перекрестных реакций с вирусами других семейств (Paramyxoviridae, Coronaviridae, Birna Viridae).
Минимальное количество вируса, обнаруженное с помощью разработанного теста, равнялось 102 - 103 ЭИД5о/мл. Данные результаты аналитической чувствительности кореллируют с чувствительностью одностадийных ПЦР тест-систем для диагностики вируса гриппа А подтипа H5N1, разработанными рядом исследователей (Boonsuk Р, 2008, Шипулин Г.А., 2006).
При проведении диагностики с помощью тест-систем на основе ПЦР важным условием является контроль диагностики. Для этой цели служат «положительный» и «отрицательный» контроли (К wok S., 1989). «Отрицательный» контроль подразумевает отсутствие матрицы для синтеза специфичного фрагмента кДНК. Отрицательным контролем может служить бидистиллированная вода. С помощью данного контроля можно проверить аккуратность выполнения анализа и наличие контаминации. Для правильной интерпретации результатов ПЦР служит «положительный» контроль. Если на электрофореграмме не будет выявлено светящейся полосы, соответствующей «положительному» контролю, то, вероятно, вирус был потерян во время проведения анализа. Это может быть связано с тем, что нарушился технологический процесс проведения анализа или образцы для анализа могли хранить не надлежащим образом. Чаще всего, в качестве положительного контроля используется референтный штамм вируса параллельно с исследуемыми пробами.