Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 16
1.1. Диагностика ортопоксвирусных инфекций человека 16
1.1.1. Классические методы родоспецифичной и видоспецифичной диагностики ортопоксвирусных инфекций человека 18
1.1.2. Молекулярно-диагностические методы в видоспецифичной диагностике ортопоксвирусных инфекций человека
1.1.2.1. Полимеразная цепная реакция 19
1.1.2.2. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов 21
1.1.2.3. Олигонуклеотидные микрочипы 25
1.1.2.4. ПЦР в реальном времени 29
1.1.2.5. Секвенирование 38
1.1.3. Заключение 43
1.2. Противооспенные вакцины 45
1.2.1. Первые противооспенные вакцинные препараты: источники и способы получения 45
1.2.2. К вопросу о происхождении вируса осповакцины 46
1.2.3. Противооспенные вакцины первого поколения: иммуногенность и реактогенность 51
1.2.4. Противооспенные вакцины второго поколения
1.2.4.1. Гетерогенность препаратов противооспенных вакцин первого поколения 57
1.2.4.2. Выбор клоновых вариантов для противооспенных вакцин второго поколения
1.2.5. Противооспенные вакцины третьего поколения 60
1.2.6. Противооспенные вакцины четвертого поколения 63
1.2.7. Субъединичные противооспенные вакцины 73
1.2.8. Заключение 86
2. Материалы и методы 88
2.1. Материалы 88
2.2. Методы 92
Результаты и обсуждение 107
3. Разработка методов индикации и дифференциации патогенных для человека ортопоксвирусов 107
3.1. Разработка метода детекции и дифференциации вирусов натуральной оспы и оспы обезьян с одновременной дифференциацией от вируса ветряной оспы на основе ПЦР в реальном времени в мультиплексном формате 107
3.1.1. Дизайн олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых гибридизационных зондов 107
3.1.2. Конструирование внутреннего контрольного образца 116
3.1.3. Конструирование положительных контрольных образцов 121
3.1.4. Оптимизация параметров метода МПЦР в реальном времени 122
3.1.5. Определение основных аналитических и диагностических характеристик разработанного метода 125
3.1.6. Апробация разработанного метода на клинических образцах 128
3.2. Разработка методов родо- и видоспецифичной детекции ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе ПЦР в реальном времени в мультиплексном формате 130
3.2.1. Разработка метода видоспецифичной детекции ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе ПЦР в реальном времени в мультиплексном формате 130
3.2.2. Поиск подходов к видоспецифичной детекции вируса оспы коров с помощью ПЦР в реальном времени 131
3.2.3. Оптимизация метода видоспецифичной детекции ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе ПЦР в реальном времени в мультиплексном формате 147
3.3. Регистрация набора реагентов для амплификации ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени «Вектор-МПЦРРВ-Оспа» 153
3.4. Мониторинг поксвирусных инфекций 164
4. Разработка и изучение противооспенных вакцин 181
4.1. Создание и изучение свойств высокоаттенуированного штамма вируса осповакцины с направленным нарушением шести индивидуальных генов вирулентности 181
4.1.1. Создание высокоаттенуированного штамма VAC5 вируса осповакцины с направленным нарушением пяти индивидуальных генов вирулентности 182
4.1.2. Изучение биологических свойств высокоаттенуированного штамма VAC5 вируса осповакцины 196
4.1.3. Создание и изучение биологических свойств высокоаттенуированного и высокоиммуногенного штамма VAC6 вируса осповакцины с направленным нарушением шести индивидуальных генов вирулентности 203
4.1.4. Анализ полной нуклеотидной последовательности генома вируса осповакцины штамм VAC6 206
4.2. Аттестация вакцинного и производственного штаммов VAC6
вируса осповакцины 216
4.2.1. Наработка вакцинного и производственного штаммов VAC6 вируса осповакцины 216
4.2.2. Изучение стабильности вакцинного и производственного штаммов VAC6 вируса осповакцины 219
4.2.3. Изучение подлинности вакцинного и производственного штаммов VAC6 вируса осповакцины 222
4.2.4. Изучение термостабильности вакцинного и производственного штаммов VAC6 вируса осповакцины 223
4.2.5. Оценка специфической активности вакцинного и производственного штаммов VAC6 вируса осповакцины 224
4.2.6. Изучение нейровирулентности вакцинного штамма VAC6 вируса осповакцины 227
4.2.7. Изучение остаточной вирулентности вакцинного штамма VAC6 вируса осповакцины 229
4.2.8. Изучение воспалительно-некротической активности вакцинного и производственного штаммов VAC6 вируса осповакцины 230
4.2.9. Изучение аномальной токсичности вакцинного и производственного штаммов VAC6 вируса осповакцины 2 4.2.10. Изучение стерильности вакцинного и производственного штаммов VAC6 вируса осповакцины 233
4.2.11. Исследование на отсутствие контаминации микоплазмами вакцинного и производственного штаммов VAC6 вируса осповакцины 234
4.2.12. Исследование пирогенности вакцинного и производственного штаммов VAC6 вируса осповакцины 235
4.2.13. Изучение стабильности при хранении вакцинного и производственного штаммов VAC6 вируса осповакцины 236
Заключение 239
Выводы 250
Список сокращений и условных обозначений 253
Список литературы
- Классические методы родоспецифичной и видоспецифичной диагностики ортопоксвирусных инфекций человека
- К вопросу о происхождении вируса осповакцины
- Дизайн олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых гибридизационных зондов
- Создание и изучение биологических свойств высокоаттенуированного и высокоиммуногенного штамма VAC6 вируса осповакцины с направленным нарушением шести индивидуальных генов вирулентности
Введение к работе
Актуальность темы исследования. На протяжении истории
человечества натуральная оспа занимала одно из первых мест среди всех
инфекционных заболеваний из-за своей опустошительности, высокой
смертности и инвалидизации переболевших. В 1980 г. на 33-й сессии
Всемирной ассамблеи здравоохранения, учитывая тяжелые
поствакцинальные осложнения при использовании классической живой вакцины и подтверждение ликвидации оспы, повсеместную рутинную вакцинацию против данной инфекции было рекомендовано прекратить. Как следствие, к настоящему времени человеческая популяция практически не имеет коллективного противооспенного иммунитета и является беззащитной не только перед возможным инфицированием другими близкородственными ортопоксвирусами (ОПВ, OPV), такими как вирус оспы обезьян (ВОО, MPXV) или оспы коров (ВОК, CPXV), природным резервуаром которых являются мелкие грызуны, но и перед заражением вирусом натуральной оспы (ВНО, VARV) в результате теракта, возникновения вируса в природе путем эволюции зоонозных ортопоксвирусов или при нарушении «случайных» захоронений во время археологических раскопок или промышленного освоения в районах вечной мерзлоты [Shchelkunov, 2011, 2013].
В последние годы отмечается увеличение числа
зарегистрированных случаев заболевания людей оспой коров [Campe et al., 2009; Carletti et al., 2009; Ninove et al., 2009; Ducournau et al., 2013; Hobi et al., 2015; Kinnunen et al., 2015], вакцино-подобным заболеванием [Zafar et al., 2007; Silva-Fernandes et al., 2009; Trindade et al., 2009; Bhanuprakash et al., 2010; Singh et al., 2012; Riyesh et al., 2014] и оспой обезьян [Levine et al., 2007; Parker et al., 2007; Rimoin et al., 2007; Rimoin et al., 2010; Nolen et al., 2015, 2016].
Опыт кампании по ликвидации оспы показывает, что эффективная
система мониторинга случаев оспы, быстрые и тщательные действия по
ограничению распространения инфекции могут прервать цепь передачи и
остановить вспышки оспы в течение короткого времени. Поэтому
своевременная надежная видоспецифичная диагностика и
вакцинопрофилактика являются наиболее важными элементами
противоэпидемических мероприятий и эффективными инструментами сдерживания возрастающей угрозы ортопоксвирусных инфекций человека. Использование традиционной противооспенной вакцины для массовой вакцинации в настоящее время недопустимо по причине относительно большого числа тяжелых поствакцинальных осложнений, что, в том числе, объясняется возросшим в последние годы количеством категорий людей с супрессивным иммунитетом.
Все это определяет актуальность и необходимость разработки
быстрых и надежных методов детекции и дифференциации патогенных
для человека ортопоксвирусов и безопасных и эффективных
противооспенных вакцин.
Степень ее разработанности. В настоящее время для лабораторной
детекции ортопоксвирусов применяют несколько молекулярно-
диагностических подходов. Недостатками методов на основе классической
ПЦР и ПЦР-ПДРФ анализа являются низкая специфичность, необходимый
этап электрофоретического разделения продуктов реакции и, как
следствие, высокий риск контаминации и продолжительное время,
необходимое для получения результата. Методы детекции
ортопоксвирусов на основе ПЦР в реальном времени и
олигонуклеотидных микрочипов характеризуются быстротой получения
результата, высокой чувствительностью, специфичностью и
возможностью проведения анализа в мультиплексном формате. При этом
олигонуклеотидные микрочипы не лишены таких недостатков как риск
контаминации за счет этапа гибридизации ПЦР-продукта со
специфичными олигонуклеотидами и необходимость дорогостоящего оборудования, что ограничивает возможность их применения в клинических лабораториях и полевых условиях. Не имеющий данных недостатков метод на основе ПЦР в реальном времени широко применяется для разработки средств родо- и видоспецифичной детекции ортопоксвирусов. Однако накопленные современные данные по геномным последовательностям, выявившие изменения в видоспецифичных районах ортопоксвирусов и высокую внутривидовую гетерогенность ВОК, показывают необходимость оптимизации существующих и/или разработки новых методов, что актуально при оценке эпидемической значимости исследуемого штамма ортопоксвируса. Кроме того, существующие в настоящее время методы на основе ПЦР в реальном времени не позволяют проводить одновременную дифференциацию всех патогенных для человека ортопоксвирусов. Данную задачу можно решить, используя ПЦР в реальном времени в мультиплексном и/или мультилокусном форматах. Такой подход позволяет в одной пробирке одновременно определить все патогенные для человека ортопоксвирусы и дифференцировать от возбудителей других экзантемных заболеваний, таких как ветряная оспа, которая представляла собой наиболее частую причину ошибочной диагностики во время борьбы с завозными вспышками натуральной оспы в прошлом и оспы обезьян сегодня [Jezek et al., 1988; MacNeil et al., 2009].
В настоящее время в мире используют противооспенные вакцины первых трех поколений, имеющие свои преимущества и недостатки. Использование классической живой вакцины первого поколения, получаемой размножением вируса на коже телят, или вакцины второго поколения, продуцируемой на культурах клеток млекопитающих или
развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), для массовой вакцинации в
настоящее время недопустимо из-за значительного увеличения в
последние десятилетия частоты встречаемости иммунодефицитных
состояний в человеческой популяции. Аттенуированные
нереплицирующиеся противооспенные вакцины третьего поколения, создаваемые в процессе множественных пассажей вируса осповакцины (ВОВ, VACV) на культуре клеток гетерологичного хозяина, индуцируют более низкий противооспенный иммунитет в сравнении с классической вакциной [Fenner et al., 1988]. Наиболее перспективным подходом является получение противооспенной вакцины четвертого поколения путем направленного нарушения генов ВОВ, контролирующих защитные реакции организма против вирусной инфекции, не затрагивая гены, контролирующие размножение вируса.
Цели и задачи. Целью настоящего исследования являлась
разработка современных средств видоспецифичной диагностики и
безопасной и эффективной профилактики ортопоксвирусных инфекций
человека. Исследование проводили по двум основным направлениям.
Первое направление включало в себя разработку методов
видоспецифичной детекции ортопоксвирусов на основе ПЦР в реальном
времени и применение их при изучении клинических образцов в рамках
работы Сотрудничающего центра Всемирной организации
здравоохранения (ВОЗ) по диагностике ортопоксвирусных инфекций и музея штаммов и ДНК вируса оспы. Вторым направлением работы являлось создание высокоаттенуированного штамма вируса осповакцины, изучение его специфической активности и безвредности для получения профилактической вакцины против ортопоксвирусных инфекций человека.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Разработать комплекс методов детекции и дифференциации эпидемически значимых высокопатогенных для человека вирусов натуральной оспы и оспы обезьян с одновременной дифференциацией от вирусов оспы коров, осповакцины и ветряной оспы, на основе ПЦР в реальном времени в мультиплексном формате;
-
Создать высокоаттенуированный штамм вируса осповакцины с направленным нарушением индивидуальных генов вирулентности и исследовать его свойства;
-
Получить и провести аттестацию вакцинного и производственного штаммов высокоаттенуированного варианта вируса осповакцины.
Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы:
1. Впервые разработан метод видоспецифичной детекции вирусов
натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины на
основе ПЦР в реальном времени в мультиплексном формате. На основе разработанного метода зарегистрировано медицинское изделие Набор реагентов «Вектор-МПЦРРВ-Оспа» (регистрационное удостоверение №РЗН 2016/3685).
-
Впервые разработан метод детекции и дифференциации вирусов натуральной оспы и оспы обезьян с одновременной дифференциацией от вируса ветряной оспы на основе ПЦР в реальном времени в мультиплексном формате. Метод может быть использован в странах Африки, эндемичных по оспе обезьян, для которых ошибочная диагностика оспы обезьян и ветряной оспы является значительной проблемой национального здравоохранения.
-
Впервые реализован комплексный подход к видоспецифичной детекции вируса оспы коров на основе мультиплексного и мультилокусного ПЦР в реальном времени, учитывающий все актуальные данные по геномам ортопоксвирусов и проверенный на ДНК 47 штаммов ВОК.
-
Впервые с 1991 г. исследован случай заболевания человека оспой коров в Российской Федерации. Определена полная нуклеотидная последовательность генома выделенного штамма Kostroma/2015 ВОК (GenBank: KY369926). Показана генетическая близость ВОК штамм Kostroma/2015 к двум штаммам GRI-90 и Finland_2000_MAN, выделенных ранее на территории СССР и Финляндии, соответственно, и принадлежность к группе «вакцино-подобных» ВОК.
-
Впервые показано, что инактивация в геноме вируса осповакцины пяти генов вирулентности, кодирующих гемагглютинин, -интерферонсвязывающий белок, тимидинкиназу, комплементсвязывающий белок и Bcl-2-подобный ингибитор апоптоза, не влияет на репродуктивные свойства ВОВ на культурах клеток млекопитающих, приводит к значительному снижению реактогенности и нейровирулентности, не оказывая влияние на иммуногенные и протективные свойства ВОВ. Дополнительная инактивация шестого гена вирулентности, продукт которого ингибирует презентацию антигенов главным комплексом гистосовместимости класса II, приводит к усилению иммуногенных и протективных свойств рекомбинантного ВОВ. Показана высокая генетическая стабильность штаммов ВОВ с нарушением от одного до шести генов вирулентности при длительной пассажной истории на культуре клеток CV-1 при использовании методики временной доминантной селекции.
-
Наработаны, аттестованы и заложены на хранение вакцинный и производственный штаммы VAC6 ВОВ, которые в дальнейшем
будут использованы для производства безопасной и эффективной
противооспенной вакцины четвертого поколения.
Методология и методы исследования. При поиске видоспецифичных районов и дизайне олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых гибридизационных зондов применяли пакет специализированных компьютерных программ. Для определения полных нуклеотидных последовательностей генома ортопоксвирусов применяли технологии секвенирования следующего поколения (NGS) на платформе Illumina с биоинформационным анализом результатов секвенирования и последующим филогенетическим анализом полученных данных. Рекомбинантные варианты вирусов осповакцины получали с помощью методики временной доминантной селекции. В работе также были применены стандартные вирусологические, молекулярно-биологические, иммунологические, электронно-микроскопические и статистические методы исследования.
Положения, выносимые на защиту:
1. Комплекс методов позволяет детектировать и дифференцировать
эпидемически значимые высокопатогенные для человека вирусы
натуральной оспы и оспы обезьян с одновременной
дифференциацией от вирусов оспы коров, осповакцины и ветряной
оспы, на основе ПЦР в реальном времени в мультиплексном
формате:
Медицинское изделие «Набор реагентов для амплификации ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени «Вектор-МПЦРРВ-Оспа» (регистрационное удостоверение №РЗН 2016/3685);
Комплексный подход к видоспецифичной детекции вируса оспы коров на основе мультиплексного ПЦР в реальном времени для одновременной мультилокусной детекции на основе трех независимых генов-мишеней ВОК, родоспецифичной детекции и видоспецифичной детекции вируса эктромелии;
Метод на основе ПЦР в реальном времени в мультиплексном формате, позволяющий детектировать и дифференцировать вирусы натуральной оспы и оспы обезьян с одновременной дифференциацией от вируса ветряной оспы.
-
Штамм Kostroma/2015 вируса оспы коров, выделенный от человека в Российской Федерации, генетически близок к двум штаммам GRI-90 и Finland_2000_MAN, выделенных ранее на территории СССР и Финляндии, и относится к группе «вакцино-подобных» ВОК.
-
Высокоаттенуированный штамм VAC6 ВОВ с нарушением шести генов вирулентности, кодирующих гемагглютинин (A56R), -
интерферонсвязывающий белок (B8R), тимидинкиназу (J2R),
комплементсвязывающий белок (C3L), Bcl-2-подобный ингибитор
апоптоза (N1L) и ингибитор презентации антигенов главным
комплексом гистосовместимости класса II (A35R), со сниженной
реактогенностью и нейровирулентностью по сравнению со
штаммом Л-ИВП вируса осповакцины, способен вызывать
формирование высокого уровня вируснейтрализующих антител и
обеспечивать протективный иммунитет.
4. Вакцинный и производственный штаммы высокоаттенуированного
варианта VAC6 ВОВ с делецией шести генов вирулентности могут
быть использованы для производства противооспенной вакцины
четвертого поколения для проведения доклинических и
клинических исследований.
Степень достоверности и апробация результатов. Все
исследования выполнены с использованием современных технологий и
методов на современном сертифицированном оборудовании с
применением высококачественных материалов и реактивов. Результаты исследований обработаны с использованием стандартных статистических методов.
Результаты работы были представлены на 12 международных и 5
российских конференциях и конгрессах: Всероссийская конференция с
международным участием «Актуальные проблемы природной очаговости
болезней» (Омск, 2009); II Ежегодный Всероссийский Конгресс по
инфекционным болезням (Москва, 2010); XVIII International Poxvirus,
Asfivirus, and Iridovirus Symposium (Sedona, Arizona, USA, 2010); Medical
Biodefense Conference 2011 (Munich, Germany, 2011); XIX International
Poxvirus, Asfarvirus, and Iridovirus Conference (Salamanca, Spain, 2012);
WHO Advisory Committee on Variola Virus Research, Fourteenth Meeting
(Geneva, Switzerland, 2012); 7th International Meeting on Replicating Oncolytic
Virus Therapeutics (Quebec City, Canada, 2013); Научно-практическая
конференция «Диагностика и профилактика инфекционных болезней»
(Новосибирск, 2013); Medical Biodefense Conference 2013 (Munich,
Germany, 2013); 15th International Congress of Immunology (Milan, Italy,
2013); Международная конференция «Инновационное развитие науки в
обеспечении биологической безопасности» (Гвардейский, Казахстан,
2014); XX International Poxvirus, Asfarvirus, and Iridovirus Conference
(Victoria, Canada, 2014); WHO Advisory Committee on Variola Virus
Research, Sixteenth Meeting (Geneva, Switzerland, 2014); I Международная
конференция молодых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и
вирусологов (Кольцово, 2014); 15th Medical Biodefense Conference (Munich,
Germany, 2016); XXI International Poxvirus, Asfarvirus, and Iridovirus
Conference (Le Bischenberg, France, 2016); Научно-практическая
конференция «Диагностика и профилактика инфекционных болезней на современном этапе» (Новосибирск, 2016).
По теме диссертационной работы опубликовано 46 работ, включая 16 статей опубликованных в журналах списка, рекомендованного ВАК, из которых 12 статей опубликованы в журналах, индексируемых в базах данных Web of Science и Scopus, 27 тезисов в сборниках конференций, 1 монографию, 2 патента Российской Федерации.
Личный вклад автора. Поиск и компьютерный анализ нуклеотидных
последовательностей видоспецифичных районов геномов вирусов
натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины и ветряной
оспы выполнен автором при участии Е.В. Гавриловой. Разработка метода
детекции и дифференциации вирусов натуральной оспы и оспы обезьян с
одновременной дифференциацией от вируса ветряной оспы на основе ПЦР
в реальном времени в мультиплексном формате выполнено автором лично.
Разработка метода видоспецифичной детекции вирусов натуральной оспы,
оспы обезьян, оспы коров и осповакцины на основе ПЦР в реальном
времени в мультиплексном формате выполнено автором при участии
Д.Н. Щербакова. Разработка и реализация комплексного подхода к
видоспецифичной детекции вируса оспы коров на основе мультиплексного
и мультилокусного ПЦР в реальном времени выполнена автором лично.
Регистрация медицинского изделия Набор реагентов «Вектор-МПЦРРВ-
Оспа» выполнено автором при участии М.П. Богрянцевой. Определение
полных нуклеотидных последовательностей генома 2 штаммов ВОК, 4
штаммов ВНО и 7 штаммов ВОВ с помощью технологии секвенирования
следующего поколения (NGS) на платформе Illumina выполнено автором
при участии Т.В. Трегубчак. Биоинформационный анализ результатов
секвенирования и последующий филогенетический анализ полученных
данных выполнено автором при участии А.Н. Швалова и М.Р. Кабилова.
Создание рекомбинантного штамма VAC5 ВОВ выполнено автором при
участии И.В. Колосовой, С.Н. Якубицкого, И.Н. Бабкиной,
П.Ф. Сафронова. Создание рекомбинантного штамма VAC6 ВОВ, характеризация, изучение иммуногенных свойств и протективной эффективности рекомбинантных штаммов VAC5 и VAC6 ВОВ выполнено автором при участии И.В. Колосовой, С.Н. Якубицкого. Наработка и аттестация вакцинного и производственного штаммов VAC6 ВОВ выполнено автором при участии И.В. Колосовой, С.Н. Якубицкого, Т.В. Трегубчак, М.П. Богрянцевой, Е.А. Нечаевой, О.С. Таранова.
Благодарности. Автор искренне благодарен своему научному
консультанту д.б.н., профессору С.Н. Щелкунову за помощь, советы и
направления в организации и проведении работ, представленных в
диссертации. Автор искренне признателен и благодарен всем сотрудникам
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, внесшим свой вклад в
проведение настоящего исследования: к.б.н. Е.В. Гавриловой,
Т.В. Трегубчак, к.б.н. И.В. Колосовой, С.Н. Якубицкому, к.б.н.
Д.Н. Щербакову, к.ф.-м.н. А.Н. Швалову, к.б.н. М.П. Богрянцевой, к.м.н. Е.А. Нечаевой, к.б.н. А.Е. Лемза, О.С. Таранову, к.б.н. И.Н. Бабкиной, к.б.н. В.А. Терновому, к.б.н. С.А. Бодневу, к.б.н. П.Ф. Сафронову.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа построена по монографическому типу, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение (2 главы), выводы, список сокращений и условных обозначений, список литературы. Работа изложена на 288 страницах, включая 29 таблиц и 56 рисунков, 286 библиографических ссылки, в том числе 259 зарубежных источников. Нумерация таблиц и рисунков приводится отдельно для каждой главы.
Классические методы родоспецифичной и видоспецифичной диагностики ортопоксвирусных инфекций человека
Вспышки заболевания оспой коров с определенной периодичностью регистрируются в различных странах Европы: в Италии в 2007 г. [Carletti et al., 2009]; в Германии в 2007 г. [Kurth et al., 2008], 2008 г. [Becker et al., 2009; Herder et al., 2011], 2009 г. [Campe et al., 2009] и 2012 г. [Hobi et al., 2015; Fassbender et al., 2016]; во Франции в 2009 г. [Ninove et al., 2009] и 2011 г. [Elsendoorn et al., 2011; Ducournau et al., 2013]; в Финляндии в 2009 г. [Kinnunen et al., 2015].
В последние годы, помимо ВОО и ВОК, отмечается увеличение числа зарегистрированных случаев заболевания людей, вызванных вакцино-подобным вирусом [Zafar et al., 2007; Silva-Fernandes et al., 2009; Trindade et al., 2009; Bhanuprakash et al., 2010].
Распространение данных вирусов в человеческой популяции, на фоне отсутствия противооспенного иммунитета, может за счет эволюции привести к появлению более вирулентных вариантов, включая возникновение ВНО-подобного вируса. Возможности современной синтетической биологии и возрастающая угроза биотерроризма дополнительно обостряют эпидемическую ситуацию с катастрофическими последствиями.
Также следует указать о необходимости точной дифференциальной диагностики от других экзантемных вирусных инфекций, таких как ветряная оспа, корь, скарлатина, особенно в продромальный период заболевания. В данный период заболевания имеют сходные признаки сыпи, и показатели для постановки диагноза не фиксированы. В практике искоренения натуральной оспы 20-го века наиболее часто ошибочно диагностируемым агентом являлся вирус ветряной оспы (ВВО, VZV). Учитывая необходимость проведения масштабной противоэпидемической работы в случае даже единичного выявления ВНО, дифференциальный диагноз от ВВО приобретает особую важность. В первую очередь это связано с тем, что натуральная оспа является высококонтагиозным заболеванием с летальностью от 5 до 40 %.
Своевременная видоспецифичная дифференциация является начальным и наиболее важным элементом в сложной последовательности противоэпидемических мероприятий по борьбе с ортопоксвирусными инфекциями. С учетом того, что оспа относится к высококонтагиозным болезням, становится очевидной необходимость разработки быстрых и надежных методов идентификации и дифференциации возбудителя ортопоксвирусных инфекций человека.
К традиционным методам детекции ортопоксвирусов относятся электронная микроскопия содержимого кожных поражений и мазков глотки, обнаружение ортопоксвирусных антигенов в клинических образцах с помощью соответствующих тест-систем на основе иммуноферментного анализа (ИФА), методе флуоресцирующих антител (МФА), реакции микропреципитации в агаре (РМПА) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА), выявление антител к ортопоксвирусам в сыворотке крови с помощью соответствующих ИФА тест-систем, кроме того проводят выделение возбудителя на куриных эмбрионах или на культуре клеток для подтверждения диагноза и всесторонней характеризации клинического образца [Мацеевич и др., 1996; Shchelkunov et al., 2005b]. С помощью данных методов удается выявить только родоспецифичные антигены ортопоксвирусов или антитела к ним без возможности видовой дифференциации, а чувствительность данных методов не всегда достаточна для надежного анализа клинического материала. При этом с учетом этапов подготовки и проведения анализа для получения достоверного результата данными методами требуется до 24 ч. Из основных недостатков можно выделить нецелесообразность применения МФА для исследования клинического материала от больного в стадии пустул по причине наличия аутофлуоресценции элементов белой крови, а также зависимость ложноотрицательного результата РМПА и РТГА от качества материала кожных поражений и срока болезни [Мацеевич и др., 1996].
Для подтверждения диагноза и дополнительной характеризации изолята проводят последующее выделение возбудителя на куриных эмбрионах или на культуре клеток, требующее от 3 до 6 сут, а предусмотренное при отрицательном результате проведение 2-го пассажа дополнительно удваивает время исследования. При этом определение морфологии оспин на хорионаллантоисной оболочке РКЭ является надежным вирусологическим методом видоспецифичной диагностики ортопоксвирусных инфекций.
Поскольку все традиционные диагностические исследования включают работу с инфекционным материалом, последующее совершенствование средств и методов дифференциальной диагностики ортопоксвирусных инфекций вели в направлении максимального отказа от использования инфекционного материала (только этап выделения вирусной ДНК) и уменьшения сроков исследования для идентификации возбудителя. Наибольшее развитие получили диагностические методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Использование метода ПЦР значительно расширило возможности выявления многих инфекционных заболеваний. Высокая чувствительность и специфичность, возможность работы, практически, со всеми клиническими образцами и пробами окружающей среды, относительная быстрота выполнения анализа (6-8 ч с учетом стадии электрофореза) значительно расширили использование ПЦР при дифференциальной диагностике инфекционных заболеваний, позволяя надежно идентифицировать и охарактеризовать патогенный микроорганизм в клиническом образце.
Существование четырех патогенных для человека ортопоксвирусов (ВНО, ВОО, ВОК и ВОВ), различающихся по эпидемической значимости, указывает на целесообразность разработки методов индикации с использованием ПЦР, позволяющих одновременно детектировать и дифференцировать данные вирусы между собой. Одним из решений данной задачи является применение мультиплексной ПЦР (МПЦР), в которой в реакционной смеси одновременно присутствует смесь нескольких пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных в отношении различных видов ортопоксвирусов, патогенных для человека [Гаврилова и др., 2003; Shchelkunov et al., 2005a].
Для проведения МПЦР-анализа авторы использовали одновременно пять пар олигонуклеотидных праймеров, одна из которых является родоспецифичной, и четыре пары олигонуклеотидных праймеров – видоспецифичными для ВНО, ВОО, ВОК и ВОВ. При проведении амплификации со смесью олигонуклеотидных праймеров образуются ПЦР-продукты, соответствующие расчетным длинам для четырех видов ортопоксвирусов и родоспецифичного фрагмента: для ВНО – 200 п.н., для ВОО – 581 п.н. (западноафриканские изоляты ВОО) или 832 п.н. (центральноафриканские изоляты ВОО), для ВОК – 421 п.н., для ВОВ – 492 п.н., и родоспецифичный фрагмент – 294 п.н. (Рисунок 1.1) [Гаврилова и др., 2003; Shchelkunov et al., 2005a].
К вопросу о происхождении вируса осповакцины
Первым способом защиты людей от опустошительных эпидемий натуральной оспы явилась вариоляция, при которой инфекционный материал из пустул больных оспой, вводили посредством скарификации или инсуффляции здоровым людям [Riedel, 2005]. Индуцированное заболевание протекало в относительно легкой форме по сравнению с обычной респираторной передачей натуральной оспы от человека к человеку и приводило к значительно меньшей смертности (0,5-2,0 %) в сравнении с наблюдавшейся во время эпидемий натуральной оспы (20-30 %) [Fenner, 1989]. Вариоляцию применяли на протяжении тысячелетий в Индии и Китае, прежде чем она была введена в практику здравоохранения сначала в Турции в 1670 г., а затем и в Европе в 1721 г., где еще на протяжении более 70 лет оставалась единственным средством защиты против натуральной оспы [Fenner et al., 1988; Riedel, 2005]. Помимо относительно высокого уровня смертности вариоляция в ряде случаев приводила к новым вспышкам натуральной оспы, что также ограничивало повсеместное распространение и применение данной технологии [Fenner et al., 1988].
Проведенный эксперимент Э. Дженнером в мае-июле 1796 г., показавший возможность вакцинации людей, используя инокуляцию инфекционного материала из пустулы больного оспой коров, и принятия общественностью данного открытия в 1798-1799 гг., привело к постепенному замещению процесса вариоляции на вакцинацию, занявшему более 40 лет, и сопутствовавшему снижению смертности и риска тяжелых побочных эффектов [Riedel, 2005].
Первоначально процесс вакцинации проводился путем переноса с помощью различных методик, преимущественно скарификации, инфекционного материала оспы коров от человека к человеку. Параллельно при этом осуществлялся и перенос сопутствующих заболеваний, что привело к отказу во второй половине 19-го века от использования данного подхода в пользу наработки инфекционного материала на животных [Fenner et al., 1988].
Следует отметить, что в начале 19-го века ряд практикующих врачей для формирования защиты против натуральной оспы использовали инокуляцию инфекционного материала, полученного с кожи лошадей, болевших оспоподобными заболеваниями, что дополнительно поднимает вопрос о происхождении современных штаммов ВОВ [Shchelkunov, 2013; Snchez-Sampedro et al., 2015].
В настоящее время до сих пор не обнаружен эндемичный для вируса осповакцины вид животных, что приводит к существованию нескольких независимых гипотез происхождения вируса. Первоначально, с учетом технических проблем и недостатка запаса вакцины, иммунизацию осуществляли посредством скарификации инфекционным материалом, выделенным из пустул ранее вакцинированного человека. В регионах, эндемичных по натуральной оспе, была высока вероятность одновременного наличия в одном человеке двух близкородственных вирусов – ВОК и ВНО в результате вакцинации и заболевания, соответственно, что могло способствовать получению новых рекомбинантов ВНО/ВОК с последующей потенциальной передачей их вновь вакцинируемым и, таким образом, появлению нового вируса [Baxby, 1977]. Ранее считалось, что не менее семи штаммов ВОВ могли быть получены путем адаптации ВНО на различных видах животных и культурах клеток: Dairen (Япония), Ikeda (Япония), Lister (Великобритания), LMC (Великобритания), Ташкент (СССР), Temple of Heaven/Tian Tan (Китай), Williamsport (США) [Wokatsch, 1972]. Например, штамм Temple of Heaven, полученный от пациента, заболевшего натуральной оспой, имеет следующую пассажную адаптационную историю: 3 пассажа в обезьянах, 5 пассажей в кроликах (кожа/семенники), 3 пассажа на коже телят, 1-2 пассажа на коже кролика и 1-3 пассажей на коже телят. С учетом того, что эксперименты по адаптации ВНО проводили на территории производителей классической противооспенной вакцины на основе ВОВ, контаминация последним, вероятно, и объясняет истинное происхождение всех данных штаммов [Fenner et al., 1988]. Данный факт косвенно подтверждают отрицательные результаты аналогичных экспериментов по трансформации ВНО в ВОВ на территориях, где никогда не проводили работ с последним [Herrlich et al., 1963].
Среди всех ортопоксвирусов ВОК характеризуется максимальным размером генома, до 225 т.п.н., и содержит весь спектр генов, которые присутствуют в остальных патогенных для человека вирусах данного рода [Shchelkunov et al., 1998; Hendrickson et al., 2010]. То есть не существует ни одного гена в ВНО, ВОО или ВОВ, которого не было бы в разнообразии штаммов ВОК. Это подтверждает теорию редуцированной эволюции, по которой считается, что все существующие сейчас ортопоксвирусы могли произойти от ВОК или общего с ним предшественника, путем потери ряда генов [Hendrickson et al., 2010].
Филогенетические исследования полноразмерных кодирующих последовательностей ортопоксвирусов (район C23L-B29R ОРТ ВОВ штамм Copenhagen, общей длиной 145 т.п.н.) доказывают, что ВОК в силу своей гетерогенности не может являться одним видом, а должен быть разделен, как минимум, на пять независимых видов, способных инфицировать человека и других животных (Рисунок 1.3) [Carroll et al., 2011].
Дизайн олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых гибридизационных зондов
Индивидуальную колонию E. coli засевали в 50 мл LB-бульона с соответствующими антибиотиками и растили ночь при 37 C. Затем клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин при 4 C в течение 15 мин в роторе JA-20 в центрифуге J2-21 («Beckman», США). Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 2 мл раствора I для выделения плазмидной ДНК и охлаждали во льду. К полученной суспензии клеток добавляли 5 мг лизоцима, растворенного в растворе I для выделения плазмидной ДНК, встряхивали на вортексе и инкубировали во льду в течение 5 мин. Затем к лизату добавляли 4 мл свежеприготовленного раствора II для выделения плазмидной ДНК, аккуратно перемешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. После этого к суспензии добавляли 4 мл раствора III для выделения плазмидной ДНК, осторожно перемешивали и инкубировали во льду в течение 30 мин. Полученный раствор осаждали при 17000 об/мин при 4 C в течение 30 мин в роторе JA-20 в центрифуге J2-21, супернатант осторожно отбирали и переносили в новую пробирку, добавляли изопропиловый спирт (в соотношении 1:1), встряхивали и центрифугировали при 10000 об/мин при 4 C в течение 10 мин в роторе JA-20 в центрифуге J2-21. Осадок промывали этиловым спиртом (70 %) и сушили 30 мин при комнатной температуре. Осадок растворяли в 1,5 мл TE, добавляли 1,5 мл 5 М LiCl. Полученный раствор инкубировали при минус 20 С в течение 10 мин и осаждали при 10000 об/мин при 4 C в течение 10 мин в роторе JA-20 в центрифуге J2-21. Супернатант переносили в чистую пробирку, добавляли 3 мл изопропилового спирта, охлаждали при минус 20 С в течение 20 мин и осаждали при 8000 об/мин при 4 C в течение 10 мин в роторе JA-20 в центрифуге J2-21. Осадок промывали этиловым спиртом (70 %), высушивали и растворяли в 500 мкл TE. После чего добавляли 5 мкл РНКазы (10 мг/мл), инкубировали в термостате при 37 С в течение 10 мин. Далее добавляли 500 мкл фенола, встряхивали и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 2 мин в центрифуге типа «Эппендорф». Водную фазу отбирали в чистые пробирки, добавляли 50 мкл 3 М CH3COONa, 1,2 мл этилового спирта (96 %) и охлаждали при минус 20 С в течение 30 мин. Затем материал центрифугировали при 8000 об/мин в течение 2 мин в центрифуге типа «Эппендорф». Полученный осадок промывали этиловым спиртом (70 %), высушивали и растворяли в 200 мкл TE.
После амплификации реакционную смесь очищали от невключившихся флуоресцентно меченых нуклеотидов очисткой на сефадексе G-50 superfine. Расшифровку первичных данных секвенирования (хроматограмм) проводили с помощью программы Sequencher (v.4.0.5.) («Gene Codes», США).
Очистка плазмидной ДНК от эндотоксинов при помощи набора EndoFree Plasmid Maxi Kit («Qiagen», Германия)
Плазмидную ДНК очищали с помощью набора EndoFree Plasmid Maxi Kit в соответствии с рекомендациями производителя. 100 мл ночной культуры осаждали центрифугированием при 6000 g при 4 C в течение 15 мин. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 10 мл раствора Р1. Затем к лизату добавляли 10 мл раствора Р2, аккуратно перемешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. После этого к суспензии добавляли 10 мл раствора Р3 для выделения плазмидной ДНК, аккуратно перемешивали, переносили лизат в «QIAfilter Cartidge» и инкубировали 10 мин при комнатной температуре с последующим фильтрованием лизата. К осветленному лизату добавляли 2,5 мл раствора ER для удаления эндотоксинов, перемешивали и инкубировали во льду в течение 30 мин. Далее лизат переносили на предварительно уравновешенную 10 мл раствора QBT колонку «QIAGENip 500». После освобождения колонки самотеком, ее промывали 60 мл раствора QC. Очищенную ДНК элюировали с колонки 15 мл раствора QN в чистую пробирку, добавляли 10,5 мл изопропилового спирта, перемешивали и осаждали при 15000 g при 4 C в течение 30 мин. Осадок промывали этиловым спиртом (70 %) и осаждали при 15000 g при 4 C в течение 10 мин. Далее осадок высушивали при комнатной температуре и растворяли в подходящем объеме раствора TE. Концентрация плазмидной ДНК была измерена спектрофотометрически на приборе Ultrospec 3000 pro («GE Healthcare Life Sciences», США).
Создание и изучение биологических свойств высокоаттенуированного и высокоиммуногенного штамма VAC6 вируса осповакцины с направленным нарушением шести индивидуальных генов вирулентности
Таким образом, специфичность метода на основе ОРТ D8L составила 97,9 %. Специфичность новой процедуры также оценили с использованием ДНК других видов ортопоксвирусов, патогенных для человека, в том числе на пяти штаммах ВОВ, пяти штаммах ВОО и десяти штаммах ВНО. Все результаты были отрицательными. Далее сконструировали рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент ОРТ D8L ВОК, с помощью которой определили чувствительность нового метода на уровне 10 копий в реакции.
Следует отметить, что поскольку по современным данным вирус оспы коров является не одним видом, а представляет собой обобщенное название нескольких (до пяти) независимых видов [Carroll et al., 2011; Duraffour et al., 2013], то всегда будет сохраняться вероятность появления генетически отличного штамма ВОК, который сможет избежать выявления с помощью одиночного видоспецифичного метода детекции. Поэтому для надежной детекции ВОК и отсутствия ложноотрицательных результатов, желательно, одновременно с ВОК специфичными олигонуклеотидами использовать родоспецифичную диагностику в одной пробирке (Таблица 3.6). В таком случае, даже если будет получен ложноотрицательный результат по детекции ВОК, всегда будет идентифицирована ортопоксвирусная ДНК в образце за счет использования высококонсервативного района, и данный образец сможет быть охарактеризован последующим секвенированием.
Альтернативно, может быть реализован мультилокусный подход для видоспецифичной детекции ВОК. В этом случае в каждом индивидуальном локусе ВОК-специфичные олигонуклеотидные праймеры / флуоресцентно-меченый гибридизационный зонд не обязательно должны детектировать все известные штаммы ВОК – достаточно добиться детекции каждого штамма хотя бы по одному-двум локусам. Такой подход значительно повысит количество подходящих видоспецифичных районов с учетом высокой гетерогенности и кластеризации по нескольким отдельным группам известных геномов ВОК [Carroll et al., 2011].
Для многих ВОК-специфичных районов генома (не имеющих гомологии с геномами других патогенных для человека ортопоксвирусов) оказывается невозможным выбор олигонуклеотидов, не выявляющих ДНК вируса эктромелии (непатогенный для человека ортопоксвирус). С точки зрения целевого предназначения разрабатываемого метода – анализа клинических образцов человека, отсутствие возможности дифференцировать ВОК от ВЭ не является недостатком, однако, это необходимо учесть для расширения арсенала средств, подходящих для детекции ДНК зоонозных ортопоксвирусов. Решение данной задачи может быть реализовано за счет одновременного использования ВЭ-специфичных и ВОК-специфичных олигонуклеотидов. Тогда при отсутствии ВЭ-специфичного сигнала и наличию сигнала для флуорофорного красителя, специфичного ВОК, можно будет идентифицировать образец как вирус оспы коров.
С учетом обобщения вышеобозначенных подходов, разработали мультиплексный вариант ПЦР в реальном времени для одновременной родоспецифичной детекции на основе C8L, ВОК-специфичной детекции на основе D8L, D11L (оптимизированный вариант с олигонуклеотидным праймером CPXV_D11L_upper2) и K2R и ВЭ-специфичной детекции (Рисунок 3.15, Рисунок 3.16, Таблица 3.6). Район ОРТ K2R был выбран, в том числе, с целью надежной детекции ДНК ВОК штамм EP-1, который содержит данный локус в своем геноме. Разработанный вариант ВЭ-специфичной детекции на основе уникального для ВЭ района позволит эффективно дифференцировать данный вирусный агент относительно штаммов ВОК. Следует отметить, что олигонуклеотиды к району ОРТ K2R являются более ВОК-специфичными в сравнении с методом на основе ОРТ D8L за счет наличия двух нуклеотидных замен в области, комплементарной флуоресцентно-меченому гибридизационному зонду CPXV_K2R_probe, для ВЭ (Рисунок 3.15). В последующем эксперименте по оценке в моноплексном формате на расширенной панели ДНК различных штаммов ВОК детекция на основе ОРТ D8L показала более высокую чувствительность в сравнении с ОРТ K2R. При этом штамм EP-1 ВОК был детектирован только в ПЦР в реальном времени с ОРТ K2R в качестве мишени.
В состав флуоресцентно-меченых гибридизационных зондов включили различные флуоресцентные красители и гасители флуоресценции для возможности проведения ПЦР в мультиплексном формате: для ОПВ-специфичного зонда – FAM/BHQ1, трех вариантов ВОК – JOE/BHQ1 и ВЭ – Cy5/BHQ3. ПЦР-анализ с выщеплением 5 -концевой метки (TaqMan формат) проводили на приборе Realime PCR System 7500 («Applied Biosystems», США). 25 мкл реакционной смеси содержало 2,5 мкл 10x TaqMan Buffer A, 200 мкМ dNTP, 5 мМ MgCl2, олигонуклеотидные праймеры (300 нМ каждого), гибридизационные зонды (250 нМ каждого), 0,5 ед. AmpliTaq Gold DNA polymerase, и 1-10 мкл раствора анализируемой ДНК. ПЦР с измерением интенсивности флуоресценции проводили по следующему протоколу: 95 С – 10 мин, далее 45 циклов: 95 С – 15 сек, 63 С – 1 мин.
Последующий анализ на панели ДНК различных штаммов ВЭ и ВОК, включая «проблемные» штаммы Austria_1999, Norway_1994_MAN и EP-1, показал абсолютную специфичность и адекватность интерпретации полученных результатов. Таким образом, аналитическая специфичность составила 100 %. Диагностическая специфичность и чувствительность в условиях эксперимента также составили 100 %.
Аналитическая чувствительность, исследованная с помощью 10-кратных разведений рекомбинантных плазмид с видоспецифичными вставками, составила: OPV – 20 копий в реакции, ВОК (D8L) – 50 копий в реакции, ВОК (D11L) – 50 копий в реакции, ВОК (K2R) – 100 копий в реакции, ВЭ – 20 копий в реакции.