Содержание к диссертации
Введение
2. Введение
2.1. Актуальность темы 7
2.2. Цель и задачи исследования 8
2.3. Научная новизна и практическая значимость 8
2.4. Научные публикации по итогам диссертационной работы
2.4.1. Статьи по теме диссертации 9
2.4.2. Тезисы научных конференций по теме диссертации 9
3. Обзор литературы. «модифицированные основания в ДНК» 11
3.1. Модифицированные основания в ДНК бактерий и их вирусов 12
3.1.1. Модифицированные основания в ДНК бактерий. 12
3.1.2. Модифицированные основания в ДНК бактериофагов 18
3.2. Модифицированные основания в геноме эукариот 20
3.2.1. Метилированные основания в геноме высших эукариот 20
3.2.2. Импринтинг и инактивация Х-хромосомы 25
3.2.3. Гипермодифицированные основания в геноме млекопитающих 28
3.2.4. Простейшие: модифицированные и гипермодифицированные основания 33
3.2.5. Наличие метиладенина в геноме эукариот 35
3.3. Заключение 39
4. Практическая часть. «разработка нового метода крупномасштабного поиска гипометилированных регуляторных участков в геномах эукариот» 40
4.1. Материалы и методы 40
4.1.1. Оборудование 40
4.1.2. Расходные материалы 40
4.1.3. Выделение и очистка ДНК 40
4.1.4. Олигонуклеотидные праймеры и суппрессионные адапторы 41
4.1.5. Молекулярное клонирование, скрининг библиотек 41
4.1.6. Бактериальные штаммы. Трансформация и культивирование 41
4.1.7. Эндонуклеазы рестрикции, рестрикция и лигирование 42
4.1.8. Полимеразная цепная реакция 43
4.1.9. Дуплекс-специфическая нуклеаза (ДСН)
4.1.10. Бисульфитная конверсия 44
4.1.11. Электрофорез в агарозном геле 44
4.1.12. Секвенирование 4.2. Теоретические основы метода 45
4.3. Выбор мобильных элементов 47
4.4. Получение пилотных клонотек 47
4.5. Применение nMETR для поиска гипометилированных последовательностей в геномной ДНК рака мочевого пузыря 52
4.6. Крупномасштабное секвенирование nMETR-библиотек 54
4.7. Бисульфитное секвенирование 56
4.8. Заключение 59
4.9. Экспериментальный анализ специфичной для человека открытой рамки считывания c11orf
5. Выводы 67
6. Список сокращений 68
7. Список литературы 69
8. Благодарности 82
- Научная новизна и практическая значимость
- Научные публикации по итогам диссертационной работы
- Модифицированные основания в геноме эукариот
- Молекулярное клонирование, скрининг библиотек
Научная новизна и практическая значимость
Эпигенетика — быстро развивающаяся область молекулярной биологии, пытающаяся ответить на вопрос «Как работает геном?». Тогда как каждая содержащая ядро клетка человеческого организма, за исключением лимфоцитов, несет один и тот же набор генов, разные гены в разных клетках экспрессируются в разное время, что и является одной из причин разнообразия клеток и тканей человеческого организма. Помимо критической роли в нормальном развитии живых организмов, эпигенетические изменения сопровождают (или являются причиной) таких патологических процессов как онкогенез и старение.
Метилирование геномной ДНК является важной частью эпигенетических процессов. До настоящего времени главным методом изучения статуса метилирования генома позвоночных животных является секвенирование ДНК, подвергнувшейся реакции
бисульфитной конверсии. В случае полногеномных исследований за бисульфитной конверсией может следовать использование техник секвенирования следующего поколения (англ. Next Generation Sequencing, NGS) или анализ реакционных смесей на микрочипах. Помимо этого, для получения метилированных последовательностей из смеси фрагментов геномной ДНК может быть использована аффинная хроматография. Однако, для анализа большого объема получающихся данных требуются методы контроля, позволяющие исключить ложноположительные и ложноотрицательные результаты.
Идеальный контроль должен соответствовать следующим критериям: - содержать достаточный объем данных для полногеномного исследования - покрывать большое количество разнообразных локусов на разных хромосомах и в разных областях каждой хромосомы - быть достаточно дешевым, хорошо воспроизводимым и не требовать длительного времени на каждый эксперимент.
Помимо этого, важно не просто получить нужную информацию, но и оценить её достоверность. Таким образом, актуальным представляется создание такого «контрольного метода». В работе показано, что метод имеет и самостоятельную практическую ценность, в том числе за счет таких преимуществ, как удобство, простота и небольшая длительность выполнения эксперимента. 2.2. Цель и задачи исследования
Цель данной работы - разработка нового метода крупномасштабного поиска гипометилированных регуляторных участков в геномах эукариот nMETR (англ. non-Methylated Tag Recovery). При разработке метода основной упор делался на универсальность и наибольшее разнообразие покрываемых локусов человеческого генома.
В рамках поставленной цели предполагалось решить следующие задачи: - получить с помощью nMETR пилотные клонотеки на основе геномной ДНК человека - получить с помощью nMETR ампликоны, содержащие последовательности гипометилированных локусов генома - осуществить биоинформатический анализ полученных последовательностей, а картировать местоположение обнаруженных гипометилированные последовательности в человеческом геноме
Помимо указанных задач, прямо следующих из цели исследования, в работу включена глава, посвященная экспериментальному анализу открытой рамки считывания с11orf72. Эта задача возникла в процессе анализа результатов одного из пилотных экспериментов и дополнительно иллюстрирует потенциал nMETR как источника новой информации.
Метод, разработанный в рамках данной работы является оригинальным, дешевым и быстрым спсобом поиска гипометилированных последовательностей в геномной ДНК любого эукариотического организма с CG-метилированием и мобильными элементами в геноме. Метод прост и универсален, он может служить для быстрого обнаружения эпигенетических маркеров одновременно для большого количества тканей и образцов, имеет большой потенциал использования для определения различий в метилировании геномов клеток в норме и при различных патологиях или использоваться в качестве контрольного.
В ходе выполнения работы получены 6589 нуклеотидных последовательности несущие информацию о 1113 локусах человеческого генома, из которых 711 (64%) из них находились в окрестности CpG-островков (200 п. о. ) . Данные результаты получены с помощью специализированной программы “PostParser”, написанной в нашей лаборатории. В процессе разработки nMETR автором было показано, что предсказанная ранее открытая рамка считывания белка c11orf72 специфична для генома человека и отсутствует в ДНК других высших приматов. Выявление и структурно-функциональный анализ подобных «новых» последовательностей генома человека представляется актуальной задачей. Также, впервые проведен системный анализ транскрипционной активности c11orf72 в различных тканях человека.
В настоящем обзоре литературы рассматриваются природные химические модификации нуклеиновых кислот и их функциональная роль, с акцентом на новую информацию о модифицированных основаниях в геномной ДНК эукариот.
В ДНК различных организмов, как про-, так и эукариот, были обнаружены модифицированные и сверхмодифицированные основания, называемые минорными. Впервые присутствие модифицированного основания (5-метилцитозина) в бактериальном геноме было выявлено в 1925 году [10]. Позже, в конце 40-х – начале 50-х годов XX века, также было показано наличие 5-метилцитозина в геномной ДНК эукариотического организма [11]. Модификации, приводящие к образованию минорных оснований происходят энзиматически, то есть являются естественными для ДНК организма, в отличие от воздействия различных алкилирующих и гликозилирующих агентов. Заместители модифицированных оснований могут быть простыми, как например метильные или гидроксильные группы, а могут быть более крупными, как сахара [8].
Научные публикации по итогам диссертационной работы
В геноме Escherichia coli содержатся два метилированных основания: 5mC и N6A, составляя, соответственно, 1 и 2% от общего числа C и A. В ДНК прокариот модифицированные основания, как 5mC, так и N6A зачастую являются частью системы рестрикции-модификации, защищающей ДНК клетки-хозяина от ферментов, называемых эндонуклеазами рестрикции. Феномен рестрикции и модификации впервые был открыт в начале 1950-х. Было обнаружено, что некоторые штаммы бактерий ингибировали ("restrict", [15]) размножение вирусов, предварительно выращенных на других штаммах. Эффект был вызван эндонуклеазами, специфичными к определенной последовательности ДНК с образованием нескольких дискретных фрагментов ДНК после гидролиза [16]. К настоящему моменту известно, что эндонуклеазы рестрикции широко распространены среди прокариот [17], кроме того, эти ферменты нашли чрезвычайно широкое применение в генной инженерии и ДНК-диагностике[18].
Системы рестрикции-модификации совмещают активности эндодезоксирибонуклеазы (ENase) и ДНК-метилтрансферазы (MTase). Ферменты взаимодействуют со специфичными последовательностями ДНК, обычно насчитывающими от четырех до восьми нуклеотидов. Эти последовательности могут быть непрерывными или прерываться, симметричными или асимметричными, уникальными или вырожденными. Обычно ферменты РМ-систем узнают двуцепочечную ДНК. Модификации, катализируемые метилтрансферазами, представляют собой присоединение метильных групп к одному нуклеотиду каждой цепи в узнаваемой последовательности [19]. Метилтрансферазы, метилирующие цитозин в положение C5 называются эндоциклическими, в отличие от метилтрансфераз экзоциклических, метилирующих аденин и цитозин в положениях N6 и N4 соответственно [20]. В качестве донора метильных групп и необходимого кофактора служит S-аденозил-метионин.
Первоначально системы рестрикции/модификации относили к одному из трёх классических типов – I, II или III. В первом и третьем типе метилазная и эндонуклеазная активность совмещена в одной полипептидной цепи, а во втором – метилаза и эндонуклеаза – это два разных полипептида. Эндонуклеазы III типа расщепляют ДНК на удалении от сайта метилирования, а эндонуклеазы типов I и II, наоборот, расщепляют ее в окрестности сайта метилирования. Затем, в 2000 году основы номенклатуры РМ-систем были пересмотрены, и был выделен IV тип систем РМ, эндонуклеазы которого расщепляют модифицированные (метилированные, гидроксиметилированные и глюкозил-гидроксиметилированные основания) [17].
Любая чужеродная ДНК, попадающая в бактериальную клетку потенциально опасна и полностью расщепляется, если только не защищена (см. раздел «Модифицированные основания в ДНК бактериофагов») или не происходит из бактериальной клетки, имеющей аналогичную РМ-систему. Потому активность эндонуклеаз рестрикции выше, чем соответствующих им метилаз. Однако, расщепление неметилированной ДНК – это потенциально смертельное для бактериальной клетки событие, потому в целях его предотвращения используются различные системы регуляции, так или иначе «задерживающие» появление в цитоплазме эндонуклеазной активности. Подробное рассмотрение данных механизмов выходит за рамки данного обзора, более детальное их описание можно найти в работе [14].
Метилирование бактериальной ДНК не исчерпывается только метилазами систем рестрикции-модификации. Так, помимо метилтрансфераз, участвующих в системе рестрикции-модификации существуют и т. н. «одиночные» или «орфанные» («orphan») метилтрансферазы, по всей видимости, ведущие своё происхождение от ферментов систем рестрикции-модификации (РМ), но не имеют «парного» фермента-эндонуклеазы. Эти ферменты
называются Dam, Dcm и CcrM, метилирование которых может происходить как в контексте, так и вне контекста РМ. Dam и Dcm метилируют, соответственно, аденин в последовательностях 5 -GATC-3 и второго цитозина в последовательностях 5-CCWGG-3, где W – A или T, а CcrM 5 -GANTC-3 , где N – любой нуклеотид [14]. Следует упомянуть, что Dam-метилирование встречаются преимущественно у гамма-протеобактерий и у некоторых археобактерий, тогда как CcrM распространена среди альфа-протеобактерий [21; 22].
Dam-метилаза E. coli участвует во множестве клеточных процессов – от мистмэтч репарации до экспрессии генов и контроля сегрегации бактериальных хромосом. Аналоги Dam обнаружены в Salmonella spp. [23], Haemophilus influenza [24] и других грамотрицательных бактериях. Dam-метилаза весьма процессивна, так, в клетках кишечной палочки находится всего по нескольку молекул этого фермента, тогда как в геномной ДНК обнаруживается примерно 19000 последовательностей GATC последовательностей [25].
Метилирование аденина напрямую влияет на связывание определенных белков с ДНК. Так, рестриктаза DpnI расщепляет последовательность 5 -GATC-3 только в том случае, если аденин в составе данного тетрануклеотида метилирован, но не расщепляет неметилированные последовательности, тогда как MboI связывается и расщепляет ту же последовательность только тогда, когда аденин в ее составе неметилирован [26]. Предполагается, что отсутствие водородной связи между метилированным аденином и тимином позволяет различать метилированные и неметилированные последовательности (метилированные
последовательности более лабильны, кроме того, метильная группа оказывается в большой бороздке ДНК и создавать стерические затруднения для связывания белков) как это, например, показано для рестриктазы EcoRV, которая расщепляет неметилированную последовательность 5-GATATC-3, но не расщепляет эту же последовательность с двумя метилированными аденинами [27]. Другим примером подобного специфичного связывания является компонент системы мистмэтч-репарации MutH, расщепляющий неметилированную дочернюю цепь в гемиметилированной последовательности GATC и сама Dam-метилаза, которая с равной эффективностью связывает как неметилированную, так и гемиметилированную цепь, но быстро диссоциирует, если таргетная последовательность полностью метилирована [26].
Обычно последовательность 5 -GATC-3 метилирована в обеих цепях, а гемиметелированное состояние возникает только в реплицируемой ДНК и существует от половины до трех минут при выращивании кишечной палочки при 30C. Таким образом, только что синтезированная цепь может узнаваться белками системы репарации, так как аденины в ее составе не являются метилированными. Если же дочерняя цепь метилирована, то она уже не является субстратом белков системы репарации и ошибки в ее составе не исправляются. Таким образом, метилирование аденина в составе последовательности 5 -GATC-3 достаточно для пострепликативной мистмэтч-репарации. Гемиметилированный дуплекс расщепляется компонентом системы репарации MutH, при этом разрывается связь в неметилированной ДНК между гуанином и аденином, после чего образуется одноцепочечная брешь, могущая достигать размера 1 т. п. о. Затем полимераза заполняет разрыв и дуплекс ДНК восстанавливается [28]. В отсутствии Dam фермент MutH не может отличить материнскую цепь от дочерней и с равной вероятностью расщепляет одну из двух цепей, что может приводить к закреплению мистмэтчей в качестве мутаций при внесении изменений в материнскую цепь [29].
Экспрессия некоторых генов кишечной палочки, а также инсерции ее вирусов и траспозонов зависят от метилирования аденина в составе сайтов Dam-метилазы. Например, штаммы, мутантные по dam гену показывают увеличение частоты инсерций TnlD в 10-20 раз, а ISlO в 100 раз, а частоту делеций и других геномных перестроек, связанных с TnlO, в 200 раз или больше. Помимо этого, гемиметилированные GATC-сайты используются транспозонами для контроля количества инсерций последовательностей IS3, IS10, IS50 и IS903 и бактериальных траспозонов Tn5, Tn10 и Tn 903 [30-32]. Примером может служить регуляция транспозиции IS10: в первом случае GATC-сайт расположен внутри -10 модуля промотора гена транспозазы. Полное метилирование этого сайта затрудняет связывание РНК-полимеразы с промотором и уменьшает транскрипцию tpn. Второй аналогичный сайт находится около внутреннего конца IS10 и его полное метилирование полностью блокирует связывание транспозазы. Следует заметить, что IS10, метилированный по значащей цепи в примерно 330 раз более активен, чем метилированный по незначащей и примерно в 1000 раз более активен, чем полностью метилированный IS10-элемент. Данный механизм оставляет мобильным элементам бактерий только небольшой на транспозицию между репликацией и полным метилированием геномной ДНК [33].
Многие промоторы, содержащие сайты метилирования Dam в области -10 или -35, показывают различия в экспрессии в штаммах, мутантных по гену dam. Так, уровень 3-галактозидазы, при экспрессии фьюжна генов glnS-lacZ в три раза выше в мутантах dam- в сравнении с диким типом. Напротив, экспрессия гена dnaA уменьшается в штаммах, содержащих мутацию dam [34].
Модифицированные основания в геноме эукариот
Степень метилирования и распространение метилированных оснований по геному среди животных сильно варьируют. Так, у модельного организма нематоды Caenorhabditis elegans в составе ДНК 5mC не детектируется, кроме того, червь не несет в своём геноме аналогов каких-либо метилтрасфераз. Другой модельный организм, плодовая мушка Drosophila melanogaster, имеет в своём составе ген-аналог метилтрансферазы и её ДНК содержит 5mC, но его содержание относительно невелико, а происходит оно в контексте CpT, а не CpG, как у большинства животных [71; 72]. Большинство изученных геномов беспозвоночных умеренно метилированы в контексте CpG-динуклеотидов, с большими областями метилированной ДНК, разделенной такими же большими областями неметилированной [73]. У позвоночных животных 5mC в составе динуклеотидов CpG широко и относительно равномерно распространены по геномной ДНК [74; 75].
У млекопитающих метилирование ДНК происходит почти исключительно по CG динуклеотидам (принято обозначение CpG, где C – это цитозин связанный фосфодиэфирной связью p с гуанином G), большинство динуклеотидов CpG в геномной ДНК метилированы [76; 77]. CNG, CC(a/t)GG, CA и CT быть метилированы, правда данное событие происходит с очень низкой частотой [78-80]. Так, CNG и CNN метилрование показно для ранних стадий в мышином эмбрионе [81] и эмбриональных стволовых (ES) клетках и почти прекращается в соматических клетках [82]. CpG – метилирование у эукариот участвует в большом количестве клеточных функций, включая тканеспецифическую экспрессию генов, клеточную дифференциацию, геномный импринтинг, инактивацию Х хромосомы, регуляцию структуры хроматина и такие патологии, как канцерогенез и старение [77]. Метилирование динуклеотидов CpG необходимо для нормального развития организма [92,93], и необходимо для выживания дифференцированной клетки [94]. CG-динуклеотиды сконцентрированы в геноме в составе так называемых CpG-островков, которые характеризуются повышенным содержанием цитозина и гуанина и повышенной частотой динуклеотидов CpG [77; 83]. Данные образования составляют примерно 0,7% человеческого генома (по длине), но содержат 7% всех CG динуклеотидов [84]. CpG-островками называются последовательности длиной не менее 200 п. о. (часто больше 500 п. о. ), в которых содержание C и G составляет более половины всех нуклеотидов, а отношение наблюдаемой частоты CpG-динуклеотидов к ожидаемой равно хотя бы 0,6 [85]. Такое определение было сделано в 1989 году, т. е. еще до наступления постгеномной эры, и может включать в себя не только СpG-богатые 5 -регионы генов, но и некоторые межгенные участки (например, Alu-элементы), поэтому в работе [86] на основе анализа полного сиквенса хромосом 21 и 22 было предложено другое определение, исключающее такие последовательности. Авторы называют CpG-островками последовательности более 500 п. о. длиной в которых содержание гуанина и цитозина составляет по крайней мере 55%, а отношение ожидаемой частоты динуклеотидов CpG к наблюдаемой 0,65. Cледует отметить, что лучшим способом идентификации CpG-островка является экспериментальный, а не биоинформатический.
Показано, что примерно 60% промоторов человеческих генов находятся в тесной близости с CpG-островками и, хотя большая часть CpG в их составе неметилирована, для некоторых CpG-островков показано тканеспецифическое метилирование, например, в процессе развития организма [77]. Следует отметить, что транскрипция некоторых генов, в промоторах которых нет CpG-островков, коррелирует со статусом метилирования областей, прилежащих к промторной. В качестве примеров можно привести гены Oct-4 и Nanog, которые имеют в составе своих промоторов метилированные области, но не имеют CpG-островка и ген интерлейкина-3, тканеспецифическая транскрипция которого связана с деметилированием соответствующих последовательностей (в его промоторе нет CpG-островка) [87-89]. Большинство CpG-островков в геноме являются неметилированными на всех стадиях во всех тканях, из этого следует тот факт, что ген может «молчать» даже если его CpG-островок неметилирован, как это показано, например, для тканеспецифичных человеческих генов -глобина и -2(1)-коллагена [90]. Предполагается, что связывание каких-либо регуляторных белков с CpG-островком может защищать его от метилирования de novo, путем стерического исключения соответствующих метилаз. Существуют белки, связывающие неметилированные CpG и, таким образом, наиболее подходящие на эту роль [91-93]. В соматических клетках человека метилировано около 1% всего цитозина, т. е. 60-70% всех CpG в геноме [94]. Хотя уровень метилирования генома сперматозоида и яйцеклетки сравним с таковым в соматических клетках организма, но его паттерны отличаются от таковых в соматических клетках [95]. В раннем развитии млекопитающих отцовский геном активно деметилируется. Данный процесс происходит сразу после протамин-гистонного обмена в мужском пронуклеусе (Рис. 2). Деметилирование отцовского генома обнаружено у различных млекопитающих: человека, домашней свиньи, коровы, лабораторной крысы и мыши [96]. Согласно данным по флуоресцентной иммуноперципитации хроматина, деметилирование происходит в масштабах всего отцовского генома, однако более детальные исследования ДНК, подвергающейся бисульфитной конверсии показывают, что отдельные участки геномной ДНК защищены от деметилирования. Так, области, контролирующие импринтинг, интрацистернальные подобные ретровирусам мобильные элементы, центромерные и теломерные сателлитные ДНК остаются метилированными все время, что может быть важно для поддержания стабильности хромосом и подавления транскрпиции импринтированных генов [97]. Деметилирование на этом этапе, согласно последним данным, осуществляется за счет конверсии метилциозина в гидроксиметилцитозин белками семейства Tet в мужском пронуклеосе с последующим «пассивным» истощением общего содержания гидроксиметилированного цитозина в процессе репликации ДНК (подробно обсуждается в разделе «Гипермодифицированные основания в геноме млекопитающих» [98]. Тогда как «отцовская» ДНК быстро теряет метильные метки и сохраняет низкий уровень метилирования, изначально высокий уровень метилирования материнского генома снижается постепенно, по пассивному механизму, следующему из полуконсервативного способа репликации ДНК (Рис. 2). Показано, что «материнскую» часть генома в целом (как и некоторые импринтированные гены в частности) защищает от метилирования белок PGC7/Stella, сохраняя его даже после слияния пронуклеусов [99].
Процесс деметилирования в масштабах всего генома обнаружен в эмбриональных половых клетках, которые под воздействием сигналов из висцеральной эндодермы и экстраэмбриональной эктодермы начинают движение к зачатку гонады из задней эктодермы зародыша. Если в начале своего движения (E8.5) в их геноме возможны эпигенетические «метки» (по аналогии с другими клетками эпибласта), то к концу своего движения данные метки полностью «стираются» (показано для эмбриона мыши) [100].
Молекулярное клонирование, скрининг библиотек
Полимеразная цепная реакция осуществлялась в амплификаторе Терцик, для каждой ПЦР исходное количество ДНК составляло 30 нг.
Лигазная смесь, полученная методом nMETR амплифицировалась, температура плавления 95С (время плавления вначале 1 цикл 5 минут, затем по 20 секунд каждый цикл) отжига 65С (время элонгации 20 секунд), температура элонгации 72С (время элонгации минута тридцать секунд). Первая реакция – 15 циклов, а затем для определения оптимального количества циклов для амплификации целевых продуктов при “Nested” ПЦР, была поставлена расцикловка от 10 до 25 циклов с шагом в 5 циклов. Для определения нецелевых продуктов амплификации была осуществлена “Nested” ПЦР полученной смеси с праймерами только к последовательности адаптора и только к последовательности повтора.
Скрининг полученных пилотных клонотек следующим образом: температура плавления 95С (время плавления: вначале 1 цикл 10 минут, затем по 25 секунд каждый цикл), температура отжига 60С (время элонгации 20 секунд), температура элонгации 72С (время элонгации одна минута сорок секунд), всего 20 циклов.
При получении рекомбинантной вставки из обработанной бисульфитом ДНК использовались следующие условия: температура плавления 95С (время плавления: вначале 1 минута, затем по 20 секунд каждый цикл), использованная температура отжига зависела от того, какая пара праймеров используется (список праймеров и их температур отжига представлен в Приложении 1, время элонгации 20 секунд), температура элонгации 72С (время элонгации минута сорок секунд), 15 циклов для внешних праймеров, затем разбавление в 10 раз и “Nested” ПЦР 25 циклов.
Для реакций использовался 10x буфер для проведения ПЦР и 50x раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов и препарат Taq-полимеразы («Евроген», Россия), количество праймеров в реакционной смеси составляло 0,4М. ПЦР смеси, полученной из продуктов реакции рестрикции после лигирования адапторов и при получении рекомбинантных вставок обработанной бисульфитом ДНК осуществлялись в объеме 25 мкл. Реакции, производящиеся для скрининга пилотных клонотек – в объеме 12,5 мкл.
Дуплекс-специфическая нуклеаза приобретена у фирмы «Евроген», Москва, Россия. Для реакции использовались реагенты производителя, в каждой реакционной смеси содержалось 300 нг ДНК (объем смеси 10 мкл, 2 ед. активности фермента на каждую реакцию), перед каждой реакцией осуществлялось нагревание 10х Мастер-буфера (5 мкл на реакцию, 500 mM Tris-HCl (pH 8. 0); 50 mM MgCl2; 10 mM ДТТ) до 68С, реакция проводилась при той же температуре в течение 10 минут, а затем добавлялся 2х Стоп-раствор (5mM ЭДТА, 80 мл) и осуществлялось инкубирование смеси в течение 5 минут при 68С с последующей инактивацией в течение 2 минут при 98С.
Биульфитная конверсия геномной ДНК производилась с помощью кита EpiTect Bisulfite Kit (Promega, США), перед дальнейшим использованием производилась амплификация полученной конвертированной ДНК с помощью набора EpiTect Whole Bisulfitome (Promega, США).
Разделение продуктов ПЦР, проверка целостности плазмид, несущих рекомбинантную вставку и очистка фрагментов ДНК для клонирования осуществлялась в 1. 5% агарозном геле, приготовленном на 0. 5x TBE буфере с добавлением бромистого этидия. Перед нанесением образцы смешивались с 1 мкл краски, содержащей 0. 25% бромфенола, 0. 25% ксиленицанола и 30% глицерина. Электрофорез производили при силе тока в 40 А в 0. 5x TBE буфере. Данные электрофоретического исследования фиксировались при помощи цифровой камеры с УФ трансиллюминатором, длина волны УФ - 280 нм.
Секверинование отдельных клонов из полученных пилотных клонотек заказывалось в фирме «Евроген», Россия. Крупномасштабное секвенирование ДНК осуществлялось в центре "Биоинженерия" Российской Академии Наук, Москва, Россия на приборе GS FLX, Roche. Количество секвенированной ДНК составляло 1500 нг в 20 мкл. 4.2. Теоретические основы метода
Многие эндонуклеазы рестрикции расщепляют геномную ДНК в зависимости от статуса метилирования их специфического сайта связывания. Некоторые из них, называемые метилзависимыми, расщепляют только метилированные последовательности, а другие, называемые метилчувствительными, только неметилированные [202]. Эндонуклеазы, узнающие неметилированные сайты могут быть использованы для «зондирования» деметилированных геномных областей, а последующее лигирование супрессионных адаптеров делает возможной ПЦР-амплификацию деметилированных локусов [203]. Метилчувствительные рестриктазы, используемые для эпигенетических исследований, как правило, выбираются так, чтобы их сайт узнавания содержал один или несколько CG-динуклеотидов, содержание которых больше в регуляторных последовательностях, таких как CpG-островки [204]. Таким образом, расщепление геномной ДНК рестриктазой, сайт узнавания которой содержит более одного CG-динуклеотида с большой вероятностью будет происходить именно по регуляторным последовательностям.
Различные повторяющие последовательности составляют наибольшую фракцию человеческого генома [205], некоторые из них, такие как теломерные или центромерные повторы занимают строго определенные позиции в хромосоме, а другие, такие как мобильные элементы (transposable elements, TE), составляющие 40% человеческого генома [1], распределяются случайным образом по всей последовательности хромосомы. Различные семейства TE представлены в геноме различным числом копий, от десятков до миллионов на одного члена семейства. Так, в человеческом геноме содержится 106 копий ретротротранспозона Alu, ассоциированных с CG-богатыми регионами генома , а их расположение относительно различных генов достаточно случайно , т. е. на каждые 3 т. п. о. гаплоидного генома приходится примерно одна копия данного мобильного элемента [205-207].