Введение к работе
Вопросы дальнейшего совершенствования профилактических вирусных вакцин остаются актуальными до настоящего времени. Не -смотря на то,что коммерческие вакцины проходят контроль на безвредность на лабораторных животных, периодически выявляются случаи повышенной реактогенности и побочного действия отдельных серий препаратов на организм привитого человека (Tlzard L., 1990). Почти все, применяющиеся в настоящее время медицинские иммунобиологические препараты не свободны от содержания в них химических веществ, токсическое, мутагенное и канцерогенное действие которых в большинстве случаев невозможно установить при введении их лабораторным животным' (Дзагуров С.Г. с соавт., 1981; Adlam С.,1975).
Прямой перенос экспериментальных данных, полученных на лабораторных животных, на организм человека приводит к существенным ошибкам, так как показано, что повреждающее действие на клетки может быть причиной повышенной реактогенности вакцин, но благодаря большим компенсаторно-приспособительным возможностям организма, патологическое состояние определенных клеток может проявиться спустя довольно продолжительное время (Червонская с соавт., 1986; Hendriksen C.F.,1988).
В настоящее время установлено, что клеточные культуры имеют целый ряд преимуществ перед лабораторными животными и являются адекватной и более чувствительной моделью для разработки критериев безопасности и оценки качества медицинских иммунобиологических препаратов (Кравченко с соавт. ,1982).
Для решения проблемы безопасности вирусных вакцин необходим строгий контроль субстрата, биологических и химических компонен-.тов, используемых в процессе приготовления препарата, так как большая часть используемых в качестве субстрата клеточных линий контаминирована вирусами и микоплазмами, а химические вещества, входящие в состав вакцин, оказывают токсическое, канцерогенное и мутагенное действие (Червонская с соавт., 1986). Поэтому очевидна необходимость разработки системы научно- обоснованных критериев оценки безопасности вакцинных препаратов на высокочувствительной модели клеточных культур.
Представленная работа выполнялась в рамках научней тематики лаборатории культуры тканей НИИ вакцин а сыьср:.;-.к НЮ "Ьирион"
- 4 -"Разработка критериев безопасности вакцины против клещевого энцефалита в тестах In vitro" по заказу концерна "Иммуноген".
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Целью данной работы является разработка новых критериев оценки безопасности и качества вакцины против клещевого энцефалита (КЭ) и обоснование возможности использования чувствительных клеточных культур для предварительного контроля безвредности препарата.
Для достижения цели последовательно решались следующие задачи:
-
Подбор наиболее чувствительных клеточных моделей для регистрации цитотоксического действия вакцины и ее компонентов;
-
Экспериментальное обоснование возможности использования чувствительных клеточных линий в качестве тест-культур для изучения токсичности вакцины против клещевого энцефалита, ее полуфабриката и компонентов;
-
Разработка методики контроля вакцины против клещевого энцефалита на реактогенность на клеточных культурах;
4.Изучение мутагенного действия вакцины против КЭ и ее полуфабриката на хромосомы клеток человека in vitro (в культурах диплоидных клеток и лимфоцитов человека) и in vivo (в лимфоцитах периферической крови привитых людей);
-
Разработка методики контроля субстрата вакцины - клеток куриного эмбриона на контаминацию микоплазмами;
-
Исследование субстрата вакцины против клещевого энцефалита на контаминацию вирусами.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Разработаны новые критерии оценки безопасности и качества вакцины против клещевого энцефалита с использованием чувствительных клеточных культур.
Впервые проведено комплексное изучение цитотоксического действия вакцины против клещевого энцефалита ,ее компонентов и полуфабриката иа диплоидные и гетероплоидные культуры клеток человеческого происхождения.
Экспериментально доказана возможность использования клеточных тест-культур для выявления реактогенных (наиболее токсичных) серий вакцины против клещевого энцефалита.
Впервые изучено мутагенное действие минимальных, доз'-вакцины и ее полуфабриката на генетический аппарат клеток человека двух модельных клеточных систем - лимфоцитов периферической крови и диплоидных клеток человека.
Показано наличие мутагенных свойств у вакцины против клещевого энцефалита и ее полуфабриката в экспериментах in vitro, а также вакцины против клещевого энцефалита в опытах in vivo.
На основании этих исследований экспериментально обоснована возможность тестирования полуфабриката и готового препарата вакцины на мутагенность в культурах лимфоцитов периферической крови и диплоидных клеток человека.
Проведено изучение микоплазменной и вирусной контаминации субстрата для производства вакцины против клещевого энцефалита и рекомендованы определенные чувствительные методы контроля клеток куриного эмбриона на контаминирующие агенты.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработаны "Методические рекомендации по контролю субстрата вакцины против клещевого энцефалита (клеток куриного эмбриона) на присутствие микоплазм".Методические рекомендации утверждены в ГИСКе им. Л.А.Тарасевича (протокол N14 от 19.10.93).
Разработаны "Методические рекомендации по постановке тестов для выявления реактогенных серий вакцины против клещевого знце-фалйта"и представлены на утверждение в ГИСК им.Л.А.Тарасевича.
Разработаны "Методические рекомендации по контролю мутагенности вакцины против клещевого энцефалита в клеточных тест-системах человеческого происхождения", представлены на утверждение в ГИСК им.Л.А.Тарасевича.
Новые критерии оценки безопасности и качества клеточного субстрата, полуфабриката и готового препарата вакцины против клещевого энцефалита с использованием чувствительных клеточных культур.
Экспериментальное обоснование возможности использования .клеточных тест-систем для выявления реактогенных серий вакцины против клещевого энцефалита. Наиболее чувствительными клеточными тест-системами признаны диплоидные штаммы клеток М-19, М-22.ФЭЧ и гетерошюидная Л-41, позволяющие с помощью теста цитотогссичнос-ти выявить реактогенные серии препарата.
Показано мутагенное действие готового препарата вакцины против клещевого энцефалита и ее полуфабриката на генетический аппарат клеток человека двух модельных клеточных систем (диплоидных клеточных линий и лимфоцитов периферической кроьн) и лимфоцитов периферической крови привитых людей. Установлено досто-
-6-. верное увеличение числа клеток со структурными нарушениями хромосом в диплоидных клетках в 3,3 раза,в культуре лимфоцитов в 3,9 раза,в лимфоцитах периферической крови привитых людей в 3,5 раза по сравнению с контролем.
Выявлена высокая степень контаминации клеток куриного эмбриона онковирусами птиц и в 20% случаев микоплазмами. Полученные данные явились обоснованием необходимости проведения контроля субстрата для производства вакцины - клеток куриного эмбриона на контаминирующие агенты.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции "Биология клетки в культуре" в 1992 г. в Санкт-Петербурге, на совещании "Культивирование клеток животных и человека" в 1994 г. в Пущине.
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 3 научные статьи.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 140 стр. машинописного текста, иллюстрирована 8 рисунками и фотографиями, 21 таблицей. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы, описывающей материалы и методы исследований, трех глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 283 работ, в том числе 135 работ иностранных авторов.