Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы .11
1. Corynebacterium glutamicum - важный объект биотехнологического производства 11
1.1.Общая характеристика Corynebacterium glutamicum .11
1.2. Центральный метаболизм углерода и пути биосинтеза основных продуктов биотехнологии 13
1.3. Современные подходы рационального дизайна продуцентов С. glutamicum 18
1.4. Основные продукты, получаемые с использованием C. glutamicum, и перспективы использования этого микроорганизма в биотехнологии 25
1.5. Генетические методы для метаболической инженерии C. glutamicum 27
2. Бактериофаг Mu – транспозон 37
2.1. Необходимые для транспозиции ДНК элементы фага Mu 39
2.2. Белки, принимающие участие в репликативной транспозиции бактериофага Mu 41
2.3. Реконструкция моделей транспозосом 45
2.4. Стадии репликативной транспозиции фага Mu 46
2.5. Механизм нерепликативной транспозиции фага Mu 50
2.6. Бактериофаг Mu – инструмент генной инженерии 52
Материалы и методы .57
1. Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования 57
2. Олигонуклеотиды .60
3. Cтандартные генно-инженерные методики 63
4. Электротрансформация клеток C. glutamicum 64
5. Электротрансформация клеток M. methylotrophus AS1 (M. extorquens AM1) 64
6. Интеграция mini-Mu транспозона в хромосому C.glutamicum 65
7. Интеграцияmini-MuтранспозонавхромосомуM. methylotrophus AS1 (M. extorquens AM1) .66
8. Внутрихромосомальная амплификация mini-Mu (LER) единицы в клетках C. glutamicum .66
9. Внутрихромосомальная амплификация mini-Mu(LER) единицы в клетках M. methylotrophusAS1 66
10. Вырезание ДНК фрагмента, заключенного между lox сайтами, из mini-Mu единиц, интегрированных в геном C. glutamicum 67
11. Вырезание ДНК фрагмента, заключенного между lox сайтами, из mini-Mu единиц, интегрированных в геномM. methylotrophus AS1 67
12. Гибридизация по Саузерну 67
13. Измерение относительной флуоресценции .68
14. Определение точек интеграции mini-Mu транспозона в хромосоме C. glutamicum 68
15. «Shotgun» клонирование интегрированных в хромосому C. glutamicum копий mini-Mu единиц 69
16. Конструирование рекомбинантных плазмид 70
16.1. Конструирования хелперной плазмиды pVK9- lacIQ-Ptac-MuAB 70
16.2. Конструирования хелперной плазмиды pVK-Pdap-MuAB 70
16.3. Конструирование интегративной плазмиды pAH-mini-Mu(LR)-YK 71
16.4 Конструирование интегративных плазмид pAH-mini-Mu(LER)-YK, pAH-mini-Mu(L R)-YK 73
16.5. Конструирование интегративной плазмиды pAH-mini-Mu(LER)-GK 73
16.6. Конструирования плазмиды pCM110-GmR 73
16.7. Конструирование хелперной плазмиды pT-Plac-cre 73
16.8. Конструирование хелперной плазмиды p06-PdapA-cre 74
Результаты и обсуждение .75
1. Адаптация системы транспозиции бактериофага Mu для интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому C. glutamicum ATCC 13869 75
1.1. Компоненты Mu-зависимой системы интеграции/ амплификации/ фиксации генов в хромосоме C. glutamicum ATCC 13869 75
1.2. Транспозиция mini-Mu(LER) единицы с интегративной плазмиды, находящейся в суперскрученной форме, в хромосому C. glutamicum ATCC 13869 81
1.3. Влияние формы донорной ДНК и E-элемента на эффективность транспозиции mini-Mu единицы с интегративной плазмиды в хромосому C. glutamicum ATCC 13869 87
2. Амплификация mini-Mu(LER)-YK единицы в хромосоме C. glutamicum ATCC 13869, оптимизация процесса 90
2.1. Исследование природы происхождения клона №10 90
2.2. Влияние уровня экспрессии факторов транспозиции на эффективность внутримолекулярного переноса mini-Mu единицы в хромосоме C. glutamicum ATCC 13869 93
2.3. Внутримолекулярная Mu-зависимая амплификация mini-Muединиц различного состава в хромосоме C. glutamicum ATCC 13869 96
3. Стратегия интеграция/амплификация/фиксация различных mini-Mu(LER) единиц в хромосоме C. glutamicum ATCC 13869 100
4. Универсальность метода Mu-зависимой транспозиции для С. glutamicum. Новый интегративный вектор 102
5. Метилотрофы – перспективный объект биотехнологии 107
5.1. Система интеграции/амплификации mini-Mu элементов в хромосоме Methylophilus methylotrophus AS1, разработанная ранее 107
5.2. Реализация стратегии интеграции/амплификации/фиксации различных mini-Mu(LER) единиц в геноме M. methylotrophus AS1 108
5.3. Адаптация системы транспозиции бактериофага Mu для интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому M. extorquens AM1 111
Выводы .114
Список сокращений и условных обозначений .116
Список цитируемой литературы .117
Благодарности 134
- Центральный метаболизм углерода и пути биосинтеза основных продуктов биотехнологии
- Бактериофаг Mu – инструмент генной инженерии
- Компоненты Mu-зависимой системы интеграции/ амплификации/ фиксации генов в хромосоме C. glutamicum ATCC 13869
- Реализация стратегии интеграции/амплификации/фиксации различных mini-Mu(LER) единиц в геноме M. methylotrophus AS1
Введение к работе
Актуальность темы исследования. С момента обнаружения в супернатан-те культуры почвенной бактерии Corynebacterium glutamicum аминокислоты L-глутамата [Kinoshita et al., 1957] интерес к этим бактериям как потенциальным продуцентам аминокислот и других биологически активных соединений растет. Классификация Corynebacterium glutamicum как «generally recognized as safe» (GRAS) организм в конце концов превратила эту бактерию в «рабочую лошадку» для крупнотоннажного биотехнологического производства основной массы L-аминокислот (глутамата, лизина и триптофана) [Becker and Wittmann, 2012], диаминов, органических кислот, нуклеотидов, различных спиртов, рекомбинантных белков [Zahoor et al., 2012].
Современный прогресс в совершенствовании имеющихся и создании новых продуцентов биологически активных соединений на базе коринебактерий основывается на успехах применения Х-омных технологий (Becker and Wittmann, 2012; 2015; Wittmann, 2010) и бурного развития генетического инструментария для модификации бактериального генома (Baritugo et al., 2018). Тем не менее, разработка быстрых и эффективных методов для получения генетически-модифицированных штаммов актуальна и сегодня.
Увеличение активности генов пути биосинтеза конечного продукта, как правило, является обязательным этапом в процессе конструирования высокопродуктивных штаммов. Поскольку существующие в большинстве развитых стран законодательные ограничения запрещают использование плазмид при создании промышленных продуцентов биологически активных веществ, то приоритетное значение имеет дальнейшее развитие методов конструирования бесплазмидных ре-комбинантных штаммов с амплифицированными копиями целевых генов в хромосоме.
С целью интеграции определенных фрагментов ДНК в хромосому C. glutamicum были разработаны различные интегративные векторы на основе ко-ринефагов [Le Marrec et al., 1994; Moreau et al., 1999], мини-транспозонов, осуществляющие интеграцию фрагментов ДНК в случайные места на хромосоме с использованием «cut-and-past» механизма [Suzuki et al., 2006; Tsuge et al., 2007]. Однако низкая эффективность встраивания гетерологичных генов из-за наличия мощной системы рестрикции в клетках C. glutamicum, а также ограниченное количество сайтов-мишеней, а, следовательно, интегрируемых в хромосому
C. glutamicum копий целевых генов являются недостатками всех вышеперечисленных методов. Кроме того, для осуществления последовательной интеграции нескольких копий целевой группы генов требуется существенно увеличенное время и, как правило, усложнение процедуры.
В этой связи нам представлялось, что известная для клеток грамотрицатель-ных бактерий система репликативной транспозиции бактериофага Ми (см., для обзора, Akhverdyan et al, 2011) могла бы оказаться чрезвычайно полезной и для штаммов С. glutamicum в случае успешной адаптации двухкомпонетного варианта этой системы интеграции для экспрессии в грамположительных бактериях.
Цель и задачи работы. Целью настоящей диссертационной работы была адаптация системы транспозиции фага Ми в геном С. glutamicum для конструирования бесплазмидных рекомбинантных штаммов-продуцентов.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать возможность адаптации системы репликативной транспози
ции бактериофага Ми для интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому
С. glutamicum, в том числе:
осуществить конструирование хелперных плазмид, содержащих гены факторов транспозиции MuA, MuB в составе вектора, способного к репликации в клетках С. glutamicum;
исследовать возможность использования ранее сконструированных для М. methylotrophus AS1 интегративных плазмид в качестве донора транспозиции целевых генов в составе mini-Mu(LR) или тіпі-Ми(ХЕІІ)-элементов в хромосому С. glutamicum, где MuL/R - специфические «левый» и «правый» концевой участок ДНК Ми, а Е - энхансер транспозиции [Leung et al, 1989; Mizuuchi M and Mizuuchi К., 1989; Surette et al, 1989];
изучить влияние присутствия и расположения асимметричного энхан-сера относительно MuL/R на эффективность интеграции и амплификации mini-Mu единицы в хромосоме С. glutamicum.
2. Разработать систему, позволяющую осуществить стабильную интеграцию
и последующую амплификацию рекомбинантной ДНК в хромосоме бактерии бы
стро и с высокой эффективностью с получением на конечном этапе безмаркерных
рекомбинантных штаммов:
сконструировать интегративные плазмиды с вырезаемыми ДНК-элементами, облегчающими отбор на всех этапах транспозиции;
осуществить интеграцию, амплификацию и фиксацию нескольких копий различных mini-Mu единиц в хромосоме С. glutamicum;
оценить стабильность сконструированных штаммов.
Научная новизна и практическая значимость работы. Двухплазмидная система транспозиции бактериофага Ми впервые успешно адаптирована для целей интеграции рекомбинантной ДНК in vivo в хромосому С. glutamicum.
Установлено, что основным механизмом функционирования mini-Mu-транспозона в клетках С. glutamicum в рамках данной системы является реплика-
тивная транспозиция, с использованием которой может быть осуществлена амплификация интегрированных фрагментов ДНК в бактериальном геноме.
Показано, что наличие энхансерной последовательности фага Ми в составе mini-Mu транспозона существенно увеличивает эффективность транспозиции в хромосоме С. glutamicum, что позволило разработать и осуществить стратегию последовательной интеграции/амплификации/фиксации необходимого числа копий нескольких целевых генов в хромосоме С. glutamicum.
Данная система представляет собой удобный генетический инструмент, прикладным значением которого является конструирование бесплазмидных безмаркерных штаммов-продуцентов биологически активных веществ.
Разработанный генетический инструментарий был успешно использован в работах ЗАО «АГРИ» при конструировании штаммов С. glutamicum - продуцентов некоторых аминокислот и других соединений.
Положения, выносимые на защиту:
1. Mu-зависимая система транспозиции рекомбинантной ДНК в бактериаль
ную хромосому, разработанная ранее для Е. coli и некоторых других грамотрица-
тельных бактерий, была модифицирована и впервые использована для интеграции
mini-Mu элементов в геном трех штаммов грамположительной Corynebacterium
glutamicum с последующей их амплификацией и фиксацией положения в геноме.
Эта система включает три рекомбинантные плазмиды:
«хелперную», обеспечивающую экспрессию генов МиАВ факторов транспозиции, способную к автономной репликации в клетках С. glutamicum, но удаляемую из популяции в неселективных условиях культивирования;
«интегративную», с условно зависимой репликацией, содержащую фланкированный L и R концами ДНК фага Ми интегрируемый ген и селективные маркеры mini-Mu(LR) элемент, и дополнительно энхансер Е mini-Mu(LЕR) элемент, причем весь mini-Mu(LER) элемент, за исключением целевого гена с флангами MuL/R, может быть удален Cre-рекомбиназой фага Р1;
«хелперную», обеспечивающую экспрессию гена сге фага Р1, способ
ную к автономной репликации в клетках С. glutamicum, но утрачивающуюся в не
селективных условиях культивирования.
2. Интеграция mini-Mu элемента в хромосому бактериальной клетки в усло
виях экспрессии генов МиАВ с «интегративной» плазмиды может происходить в
основном (более 95% случаев) по механизму репликативной транспозиции с обра
зованием коинтеграта и последующим его возможным RecA-зависимым разреше
нием. При этом частота интеграции зависит от штамма-реципиента, оптимизиро
ванных условий электротрансформации и составляет «2-Ю"4 на клетку штамма
АТСС13869.
-
Эффективность репликативной транспозиции mini-Mu(LER) элемента в условиях экспрессии факторов MuAB в клетках коринебактерий зависит от присутствия и ориентации энхансера (Е). Присутствие Е существенно повышает эффективность транспозиции, особенно при амплификации in vivo в хромосоме, имеющей сниженную плотность суперспирализации вследствие взаимодействия с клеточными белками. Это позволило реализовать стратегию фиксации интегрированных и амплифицированных mini-Mu(LER) элементов через преобразование их в неспособные к амплификации в используемых условиях mini-Mu(LR) элементы в результате Cre-зависимого вырезания in vivo их Е-содержащих ДНК фрагментов.
-
Конструирование штаммов, производных ATCC 13869, содержащих одновременно в хромосоме различное количество копий двух генов, кодирующих желтый и зеленый флуоресцентные белки, тестируемых генетическими методами, флуоресценцией и Саузерн-гибридизацией, явилось демонстрацией разработанной стратегии.
-
Дополнив новыми элементами ранее разработанную при участии автора систему интеграции/амплификации mini-Mu единиц в хромосому Methylophilus methylotrophus AS-1 для реализации стратегии преобразования интегрированных mini-Mu(LER) элементов в mini-Mu(LR), продемонстрирован универсальный характер системы, успешная адаптация которой была осуществлена еще для одного представителя метилотрофов – Methylobacterium extorquens AM1.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 патентная заявка. Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» (июнь 2017) и на Международной научной конференции (Лиссабон, Португалия, декабрь, 2010), были представлены в постерном сообщении на 12-ом Международном симпозиуме по «Метаболической инженерии» (Мюнхен, Германия, июнь 2018). Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре Научного Совета ЗАО «АГРИ» и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГБУ НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика 23 апреля 2018 года.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из 7 разделов: «Введение»,
«Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Вы
воды», «Список цитируемой литературы» и «Благодарности». Работа изложена на
134 страницах, включая 31 рисунок и 5 таблиц. Список цитируемой литературы
содержит 226 источников, в том числе 5 на русском язык
Центральный метаболизм углерода и пути биосинтеза основных продуктов биотехнологии
На сегодняшний день центральные метаболические пути C. glutamicum, включающие путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (ЭМП) (часто ошибочно называемого -гликолизом, однако в биохимии под гликолизом понимают совокупность химических реакций всех метаболических путей данного организма, приводящих глюкозу в пируват [Stephanopoulosetal., 1998]), пентозофосфатный путь (ПФП), цикл трикарбо-новых кислот (ЦТК), а также анаплеротические реакции и реакции глюконеогенеза хорошо известны (Рисунок 1). Различные ферменты участвуют в реакциях взаимопревращения углерода между интермедиатами ЦТК (малат/осалоацетат) и ЭМП пути (пируват/фосфоенолпируват(ФЕП)).
Пополнение пула расходуемых на строительство биомассы интермедиатов ЦТК происходит посредством двух анаплеротических реакций, в ходе которых кар-боксилирование интермедиатов ЭМП пути -пирувата и фосфоенолпирувата до окса-лоацетета (интермедиат ЦТК) катализируют пируваткарбоксилаза (продукт гена pyc) и ФЕП-карбоксилаза (продукт гена ppc), соответственно. Малик-фермент (продукт гена malE) и ФЕП-карбоксикиназа (продукт гена pck) катализируют реакции декар-боксилирования, тем самым осуществляя переход от ЦТК к гликолизу. Дополнительными ферментами глюконеогенеза являются оксалоацетат декарбоксилаза (продукт гена odX) и ФЕП-синтетаза (продукт гена pps). Кооперативное взаимодействие карбоксилирующих и декарбоксилирующих ферментов на уровне пирувата необходимо для поддержания избытка АТФ в клетке. Многие биосинтетические реакции сопряжены с использованием НАДФН в качестве кофактора. Основную же роль в снабжении клеток НАДФН выполняют ферменты глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (продукт гена zwf), 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (продукт гена gnd) окислительной части ПФП и изоцитратдегидрогеназа ЦТК, а в отдельных случаях может быть вовлечен и малик-фермент. Процессы анаболизма также исследованы. Информация о потребностях в предшественниках, участвующих в нем, была получена. В общей сложности около 16.4 ммоль НАДФН на 1г биомассы расходуется на анаболизм. Это конкурирует с требованием в НАДФН при суперпродукции этими бактериями про-мышленно значимых количеств лизина и метионина, поскольку в аэробных условиях культивирования C. glutamicum образуется 1,7 моль НАДФН на 1моль глюкозы в реакциях ПФП и ЦТК при выходе 0,5 г сухой биомассы на 1г глюкозы [Wittmann, 2010].
Анализ важных для биотехнологического применения штамма метаболических путей позволил сконструировать эффективные продуценты аминокислот, применяя методы классической генетической инженерии, предполагающей использование нескольких раундов случайного мутагенеза и селективного отбора [Demain, 2000]. Глутамат, ароматические аминокислоты и аминокислоты, принадлежащие к семейству аспартата, являются самыми важными продуктами промышленного производства. Биосинтез этих аминокислот тесно связан с центральным метаболизмом. Требования предшественников, кофакторов и энергии, поставляемых в необходимых количествах центральными катаболическими путями, здесь конкурируют с требованиями клетки для роста. Поэтому многочисленные регуляторные механизмы необходимы для обеспечения сбалансированного синтеза всех этих метаболитов для клеточных нужд (Рисунок 2).
Особую проблему представляют очень длинные, сопряженные с другими путями общими промежуточными веществами и реакциями пути биосинтеза аминокислот из семейства аспартата. Здесь уже на уровне аспартилполуальдегида аспар-таткиназа, катализирующая образование аспартилфосфата из аспартата, подвергается совместному ингибированию лизином и треонином по принципу обратной связи, что является ключевой точкой контроля биосинтеза лизина [Wittmann, 2010].Синтез ме-тионина также включает сложные регуляторные механизмы. Так делеция глобального репрессора McbR, следствием которой является сверхэкспрессия почти всех генов, участвующих в биосинтезе метионина, не позволяет получить высокую продукцию этой аминокислоты, что предполагает существование других механизмов регуляции этого пути. Наряду с регуляцией на уровне транскрипции был обнаружен сложный и эффективный механизм ингибирования обратной связью в пути биосинтеза метио-нина [Wittmann, 2010]. Аналогичная сложная регуляция путей биосинтеза ароматических аминокислот, как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции осуществляется в клетках С. glutamicum (Рисунок 2).
Из-за этих препятствий дальнейшей успех методов классической генетики по поиску еще более совершенных желаемых вариантов оказался неэффективным [Vertes et al., 2005].
Бактериофаг Mu – инструмент генной инженерии
Фаг – транспозон Mu явился первым из транспозирующих элементов, для которого была разработана система транспозиции in vitro [Mizuuchi, 1983]. Система, в которой использовались очищенные белки и компоненты ДНК, позволила более детально изучить этот процесс. Использование диметилсульфоксида и глицерола в реакции ослабило требования к сборке траспозосомы in vitro, то есть исключило необходимость суперспирализации ДНК субстрата, HU и энхансера (Е) [Baker and Mizuuchi, 1992; Mizuuchi and Mizuuchi, 1989]. Кроме того, использовние субстрата, содержащего только R – концы с R1, R2 сайтами связывания, способствовало увеличению эффективности реакции. В упрощенном варианте Mu транспозиция выполняется с очищенным белком MuA и короткими R-концевыми сегментами ДНК, содержащими R1, R2 сайты связывания [Savilahti et al., 1995], что вполне достаточно для сборки транспозосомы, осуществления расщепления донорной ДНК и переноса цепей ДНК и используется для изучения детального механизма транспозиции [Chaconas and Harshley, 2002].
Успешная реализация Мu-зависимой репаративной транспозиции рекомби-нантной ДНК была осуществлена с помощью электропорации собранным in vitro комплексом, состоящим из MuA транспозазы и линейной mini-Mu единицы, в хромосомы различных организмов, включающих не только грамотрицательные [Lamberg et al., 2002; Lanckriet et al., 2009], но также грамположительные бактерии, дрожжи и геномы млекопитающих.
Свойство фага Mu внедряться в хромосому реципиента в места, содержащие «мисс-мэтч» замены, позволяет картировать генетический полиморфизм, что и было продемонстрировано in vitro для генома бабочки [Harshley, 2014]. Это важно, поскольку однонуклеотидный полиморфизм является причиной ряда заболеваний у людей.
Поскольку транспозицию бактериофага Mu отличает предельно низкая специфичность (интеграция может идти как в различные гены бактериальной хромосомы, так и в различные участки внутри одного гена с небольшим предпочтением [Harshey, 2014], эта особенность оказалась полезной для целей генной инженерии. С середины 1980-х годов производные mini-Mu широко используются in vivo для инсерционного мутагенеза, для слияния и картирования генов, а также для клонирования генов и се-квенирования ДНК, интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому [Groisman and Casadaban, 1986; Haapa et al., 1999; Chaconas and Harshey, 2002; Akhverdyan et al., 2011].
В настоящее время в литературе описаны разные виды mini-Mu элементов. Некоторые mini-Mu несут все генетические последовательности, необходимые для транспозиции, репликации и упаковки. Другие производные обладают только концами Mu (mini-Mu(LR)), и для выполнения специфических функций Mu в E. coli должны быть дополнены in trans [Chaconas et al., 1981; Hаrshey, 1983]. Интегрированные в хромосому E. coli экспрессионные вектора, сконструированные на базе Mu фага, не имеющего генов, отвечающих за образование фаговых частиц, были использованы для одновременной термо-индуцированной репликативной транспозиции и гетероло-гичного синтеза белка в E. coli [Akhverdyan et al., 2011].
Однако mini-Mu(cts) конструкции, содержащие факторы транспозиции in cis, могут вызывать нестабильность рекомбинантных штаммов даже без индукции [Ах-вердян и др., 2007]. Стабилизация может быть достигнута путем использования двухкомпонентной системы, в которой гены, кодирующие MuA и MuB факторы транспозиции, находятся in trans на ДНК молекуле, не способной к транспозиции и впоследствии теряющейся клеткой.
Разные варианты этой системы были разработаны [Akhverdyan et al., 2011].
Одна из наиболее популярных систем включает интегративную плазмиду, содержащую mini-Mu(LR) единицу в качестве первого компонента и совместимую с ней хел перную плазмиду, содержащую индуцибильные гены, кодирующие MuA, MuB, в качестве второго компонента. Обычно хелперная плазмида имеет нестабильный репли кон, и легко может быть удалена из клетки. Гены, находящиеся в составе mini Mu(LR) единицы, фланкированы Rho-независимыми транскрипционными терминаторами в прямой ориентации [Abalakina et al., 2008]. В mini-Mu(LЕR) единицах между L и R концами расположен энхансер, который положительно влияет на транспозицию [Leung et al., 1989]. Для облегчения отбора mini-Mu транспозиции маркер устойчивости к антибиотику обычно включается в состав транспозона. А фланкированный последовательностями, необходимыми для осуществления сайт специфической рекомбинации- attL/R, loxP или FRT впоследствии легко вырезается in vivo из состава mini-Mu единицы соответствующими рекомбиназами, получая в итоге безмаркерный рекомбинантный штамм [Akhverdyan et al., 2011]. Двухкомпо нентная система транспозиции фага Mu часто используется в E.coli для внесения поправок в геном и для конструирования различных бактериальных штаммов с целью проведения фундаментальных исследований и создания штаммов-продуцентов.
Система, разработанная в АГРИ группой В. З. Ахвердяна, является примером такой интегративной системы. С ее помощью можно интегрировать в хромосому E.coli различные гены, опероны или генетические кассеты с высокой эффективностью. Система включает две совместимые плазмиды, имеющие относительно нестабильные репликоны, что способствует в дальнейшем, после интеграции целевых генов в хромосому, легкому удалению плазмид из интегрантов [Зименков и др., 2004; Ахвердян и др., 2007]. Интегративная плазмида содержит целевой ген, фланкированный концевыми фрагментами ДНК фага Mu-L и Mu-R, а хелперная плазмида содержит фрагмент mini-Muтранспозона MD4041 [Symonds et al., 1987], на котором расположены ген температурочувствительного репрессора фага Mu, cts62, ранний оперон фага и гены факторов транспозиции MuA и MuB. Во время термоиндуцибильного синтеза факторов транспозиции происходит перенос расположенной на интегратив-ной плазмиде mini-Mu кассеты в хромосому хозяина. При длительном действии транспозазы уже интегрированная в хромосому mini-Mu единица в результате реп-ликативной транспозиции может встраивать свою копию в новое место бактериального генома [Ахвердян и др., 2007; Саврасова и др., 2007].
Поскольку эффективность транспозиции в геном E.coli высокая, эта система позволяет интегрировать и амплифицировать целевые фрагменты ДНК в хромосоме без использования селективных маркеров [Саврасоваи др., 2007], что существенно облегчает процедуру и уменьшает время конструирования промышленных продуцентов. Кроме того, эта Mu-производная интегративная система позволяет осуществить интеграцию одновременно нескольких копий экспрессионных кассет в различные локусы бактериальной хромосомы, а также провести последовательную интеграцию нескольких функционально различных единиц mini-Mu. В большинстве случаев уровень экспрессии интегрированных с помощью Ми генов увеличивается пропорционально увеличению числа копий их в хромосоме. Несмотря на то, что бактериофаг Ми с частотой приблизительно 10 2 встраивается в жизненно важные гены, приводя к гибели клетки или к возникновению ауксотрофных мутантов, последующая селекция позволяет отобрать штаммы с высокой продуктивностью и хорошими ростовыми характеристиками. Уровни продукции полученных бесплазмидных штаммов соответствовали их плазмидным рекомбинантным аналогам, причем первые были значительно более стабильны при неселективном культивировании [Ахвердян и др., 2007; Саврасова и др., 2007].
Двухкомпонентная системы транспозиции фага Ми была адаптирована для интеграции целевых фрагментов ДНК в геном с последующим увеличением числа интегрированных копий в хромосоме метилотрофной бактерии М. methylotrophus AS1 [Abalakina et al, 2008]. Было продемонстрировано, что в отличие от E.coli системы Mu-зависимой транспозиции, для обеспечения возможности высокоэффективной (с частотой 2х10"2) амплификации mini-Mu элемента в бактериальной хромосоме в присутствии факторов транспозиции необходимо введение в состав интегрируемой mini-Mu кассеты Е-элемента [Токмакова, 2010], присутствие которого повышает внутримолекулярный перенос на 2 порядка. Была получена библиотека ауксотрофных по ароматическим аминокислотам мутантов в штамме, содержащем в хромосоме ген транспортера aroPEco, интегрированный с использованием Mu-зависимой системы транспозиции (Yomantas et al., 2010).
Исходя из предшествующих результатов, полученных в нашей группе, в том числе и непосредственно автором данной работы, была сформулирована конкретная цель настоящей диссертации. Она состояла в дальнейшем развитии исследований свойств системы Mu-зависимой интеграции гетерологичной ДНК в геном различных бактерий. Удалось показать, что этот инструмент можно с успехом использовать и для коринебактерий. Более того, поскольку и в этом случае наблюдалось значительное снижение эффективности внутрихромосомальной транспозиции mini-Mu(LR) элементов по сравнению с их mini-Mu(LER) аналогами, была предложена, апробирована и затем практически использована новая стратегия Интеграция-Амплификация – Фиксация независимых mini-Mu(LEexR) элементов со специально организованными, «выщепляемыми Еex-локусами». Эту стратегию оказалось возможным с успехом применять как в случае коринебактерий, так и в случае нашего раннего объекта исследования – M. methylotrophus, а также и для еще одного метилотрофа, Methylobacterium extorquens AM1.
Компоненты Mu-зависимой системы интеграции/ амплификации/ фиксации генов в хромосоме C. glutamicum ATCC 13869
С момента своего открытия в 1957 году, как продуцент L-глутамата непатогенная грамположительная почвенная бактерия, относящаяся к классу актиномице-тов и классифицированная как «в целом признана безопасным» (GRAS) организмом, Corynebacterium glutamicum стала «рабочей лошадкой» в широкомасштабном промышленном производстве аминокислот, химических веществ, материалов, топлива и различных белков [Becker and Wittmann, 2012] («Обзор литературы»).
Поэтому в настоящее время достаточно остро стоит задача разработки новых высокоэффективных методов редактирования генома этого организма с целью конструирования высокопродуктивных промышленных штаммов.
Сведения об успешной реализации Мu-зависимой репаративной транспозиции рекомбинантной ДНК с помощью электропорации собранным in vitro комплексом, состоящим из MuA транспозазы и линейной mini-Mu единицы, в хромосомы различных организмов, включающих не только грамотрицательные [Lamberg et al., 2002; Lanckriet et al., 2009], но также грамположительные бактерии [Pajunen et al., 2005], а также обнаружение в геноме некоторых грамположительных Firmrcutes профагов, полностью или частично подобных фагу Mu [Taussaint, 2013], явились предпосылками к началу исследования возможности транспозиции фага Mu в хромосоме грампо-ложительной бактерии Corynebacterium glutamicum.
Известно, что при осуществлении транспозиции Mu бактериофага in vivo в геномы бактерий по механизму репликативной транспозиции намного большее количество белков клетки хозяина принимает участие в этом процессе по сравнению с процессом простой инсерции [Au et al., 2006; North and Nakai, 2005]. Однако интеграция целевых генов в бактериальную хромосому E. coli с последующим увеличением числа их копий в геноме осуществляется с высокой эффективностью с помощью двухкомпонентной Mu-зависимой системы транспозиции, первоначально разработанной и использованной в 80-х годах в нескольких западных лабораториях в различных целях [Groisman and Casadaban, 1986; Surrette et al., 1989; Savilahti et al., 1995], а в конце 90-х годов воспроизведенной в АГРИ группой проф. Ахвердяна для создания стабильных бесплазмидных рекомбинантных штаммов E.coli [Саврасова и др., 2007; Ахвердян и др., 2007]. Позже интеграция mini-Mu транспозона с последующей амплификацией его копий в хромосоме была осуществлена в АГРИ группой Йомантаса для метилотрофной бактерии Methylophilus methylotrophus AS1 («Обзор литературы», «Результаты и обсуждение – Раздел 5.1»).
Поскольку ранее адаптированная Mu-зависимая двухкомпонентная система интеграции гетерологичной ДНК в геном грамотрицательных бактерий оказалась высокоэффективным и удобным методом хромосомной инженерии, особенно для тех бактерий, для которых пока еще не разработано универсального генетического инструментария, было интересно его опробовать и для грамположительных бактерий. Для исследования был выбран штамм C. glutamicum ATCC 13869.
На первом этапе для проверки возможности интеграции и амплификации гете-рологичных генов в хромосоме C. glutamicum с использованием механизма транспозиции фага Mu необходимо было провести модификацию ранее разработанной для метилотрофных бактерий двухкомпонентной системы транспозиции с целью экспрессии ее в клетках грамположительной бактерии.
Как было отмечено выше («Обзор литературы»), особенностью этой системы является то, что необходимые для транспозиции элементы и белковые факторы находятся в составе разных векторов, при этом одна из плазмид – интегративная не способна к автономной репликации, а другая - хелперная, обеспечивающая экспрессию факторов транспозиции MuAB, относительно стабильно поддерживается в штамме-реципиенте даже в неселективных условиях. Поскольку все ранее сконструированные хелперные плазмиды получены на базе векторов, способных к автономной репликации только в грамотрицательных бактериях, для осуществления Mu-зависимой транспозиции в геном Corynebacterium glutamicum необходимо было ввести гены MuA, MuB в состав плазмиды, способной к автономной репликации в этой бактерии. Поэтому для экспрессии генов факторов транспозиции MuA и MuB в клетках C. glutamicum была сконструирована хелперная плазмида pVK9-lacIQ-Ptac-MuAB («Материалы и методы»; Рисунок 15) на базе довольно стабильной в клетках C. glutamicum плазмиды pVK9-GmR, но в то же время обладающей способностью теряться при культивировании в неселективных условиях (без добавления антибиотика гентамицина в среду). Так доля клеток, потерявших плазмиду pVK9-lacIQ-Ptac-MuAB при росте в неселективных условиях в течение ночи, составляет 3-10%. Оперон, содержащий гены MuAB, был клонирован в состав хелперной плазмиды со своим собственным сайтом связывания рибосомы (RBS), поскольку рассчитанная эффективность трансляции (URL:https://salislab.net/software/) [Borujeni and Salis, 2016] не предполагала проблем с трансляцией этих белков в клетках С. glutamicum. Экспрессия генов факторов транспозиции находилась под транскрипционным контролем довольно часто используемой в клетках С. glutamicum конструкции Pfac/Ofac и гена LacIQ репрессора [Eggeling and Bott, 2005; Kirchner and Tauch, 2003; Nevera and Pdtek, 2011; Ravasi et al, 2012]. Индукция синтеза MwAB осуществлялась добавлением в среду IPTG. Но поскольку lacP-?tJOlac система даже без индукции имеет достаточно высокий базальный уровень транскрипции [Billman-Jacobe et al, 1994; Хи et al, 2010], нередко могут возникать проблемы с клонированием токсичных для клеток генов. Однако мы не столкнулись с трудностями при клонировании генов MwAB в клетках . coli.
Для сравнительной оценки влияния уровня синтеза факторов транспозиции MuA, MuB на эффективность процесса дополнительно была сконструирована хел-перная плазмида pVK-P -Mu/LB («Материалы и методы»). На этой плазмиде экспрессия генов MwA, МХХВ находилась под контролем конститутивного С. glutamicum VdapA промотора средней силы [Pdtek, 1996; Pdtek et al, 2005].
Надо отметить, что при конструировании плазмид pVK9-lacft-Ptac-MuAB и pVK-?dap-MuAB были учтены недостатки предыдущей двухкомпонентной системы, разработанной для метилотрофных бактерий, связанные с трудностями выявления типа механизма транспозиции (репликативный или репаративный) mini-Mu единицы с интегративной плазмиды в хромосому бактерии. Поэтому маркером отбора трансформантов, содержащих хелперную плазмиду, была выбрана устойчивость к гента-мицину, кодируемая геном aacCl, способным выражаться в клетках С. glutamicum и отсутствующим на интегративном векторе.
Что касается второго элемента системы, то, исходя из схемы, предложенной для эффективной интеграции гетерологичных генов в хромосомы грамотрицатель-ных бактерий, интегративная плазмида, содержащая mini-Mu единицу, может вообще не обладать способностью к репликации в клетках бактерии, что существенно облегчает отбор первичных интегрантов. Ранее сконструированные интегративные вектора, входящие в систему Mu-зависимой транспозиции, разработанную для метилотрофных бактерий, созданы на базе плазмиды рАН162 Е. coli [Haldimann and Wanner, 2001; Posfai et al, 1994] и имеют //-зависимый (oriRy) репликон, а, следовательно, не могут поддерживаться в клетках C. glutamicum. Этот факт, а также присутствие маркера отбора транспозиции в составе mini-Mu единицы позволяет напрямую вести селекцию первичных интегрантов в C. glutamicum клетках. Поэтому для проверки возможности работы системы в клетках C. glutamicum в качестве второго элемента Mu-зависимой системы транспозиции было удобно воспользоваться ранее сконструированной интегративной плазмидой. Однако предполагаемая в дальнейшем работа, направленная на получение стабильных безмаркерных рекомбинантных штаммов C. glutamicum, требовала введения некоторой модификации. В результате было сконструировано несколько вариантов интегративной плазмиды с использованием pir+-зависимого репликона E. coli плазмиды pAH162.
Не содержащая ДНК бактериофага Mu часть интегративной плазмиды имела tetA ген транспозона Tn10 [Hillen and Berens, 1994; Lawley et al., 2000], находящийся под контролем конститутивного промотора. Предполагаемая экспрессия этого гена в клетках C. glutamicum была очень важна для подтверждения образования коинтегра-та в случае репликативной транспозиции и последующего его возможного разрешения, поскольку коинтеграты обладают TcR фенотипом в отличие от их разрешенных вариантов, а также от интегрантов, для которых встраивание mini-Mu единицы в хромосому произошло через репаративный механизм транспозиции («Обзор литературы»). Но, насколько нам было известно на сегодняшний день, экспериментальных данных, касающихся экспрессии гена tetA в клетках C. glutamicum, не существовало.
Реализация стратегии интеграции/амплификации/фиксации различных mini-Mu(LER) единиц в геноме M. methylotrophus AS1
Разработанная для коринебактерий стратегия интегра ции/амплификации/фиксации различных mini-Mu(LER) единиц, содержащих в своем составе вырезаемый энхансерный элемент, с использованием механизма транспозиции фага Mu базировалась на различиях в эффективностях внутрихромосомальной репликативной транспозиции mini-Mu(LER) и mini-Mu(LR) единиц, первоначально обнаруженных в грамотрицательных бактериях [Akhverdyan et al., 2011]. Для демонстрации универсального характера новой системы мы применили ту же стратегию и к ранее изученным грамотрицательным метилотрофным бактериям Methylophilus methylotrophus AS1 и Methylobacterium extorquens AMI.
Согласно ранее представленным результатам [Токмакова, 2010] все процессы проводили с использованием хелперной плазмиды р17ТР310, сконструированной ранее на базе вектора рШСЗЮІпсРа-группы, не имеющей в своем составе энхансер [Akhverdyan et ah, 2011] (Рисунок 28), и описанной в данной работе интегративной-плазмиды pAH-mini-Mu(LER) (Рисунок 29).
В качестве дополнительного элемента разработанной системы для возможного вырезания фрагмента mini-Mu транспозона, фланкированного ІохШох71 последовательностями, преобразуя, таким образом, in vivo интегрированные в хромосому М. methylotrophus AS1 mini-Mu(LER) единицы в mini-Mu(LR) единицы, была сконструирована плазмида pT-Рfac-сre на базе вектора широкого круга хозяев IncPa-группы несовместимости pRK310 [Ditta et al, 1985], в составе которой экспрессия гена, кодирующего Cre-рекомбиназу фага P1, осуществлялась под контролем Р/ас промотора («Материалы и методы»).
Интеграцию, а затем амплификацию mini-Mu(LER)-GK транспозона проводили в условиях индукции факторов транспозиции, согласно ранее разработанной методике [Токмакова, 2010]. Результаты подтверждали генетическими методами, измерением флуоресценции и Саузерн-гибридизацией. После вырезания из состава хромосомы отобранных на высокой концентрации стрептомицина (2 мг/мл) клонов, содержащих одну или две копии mini-Mu(LER)-GK единицы в геноме, фрагментов с маркерами устойчивости к антибиотикам и энхансерной областью с помощью сайт-специфической Cre рекомбиназы, экспрессирующейся с хелперной плазмиды pT-Рlac-сre, по той же схеме («Материалы и методы») была последовательно осуществлена интеграция и амплификация новой mini-Mu(LER)-YK единицы. Количество содержащихся в хромосоме копий генов yEGFP и yECitrine в случайно отобранных клонах предварительно оценивали, регистрируя уровни удельной флуоресценции (Рисунок 30А). Для подтверждения предварительных выводов была проведена ДНК-гибридизация по Саузерну (Рисунок 30Б).
Было установлено, что в результате Mu-зависимой внутрихромосомальной транспозиции количество копий mini-Mu(LER)-YK кассеты увеличилось до 2-5 на геном бактерии, в то время как количество mini-Mu(LR)-G единиц не изменилось. Была отмечена корреляция между регистрируемым в клетках уровнем флуоресценции yEGFP, yECitrine и числом копий yEGFP, yECitrine генов в хромосоме.
Таким образом, возможности этого метода, объединяющего в себе две различ ные системы – mini-Mu транспозицию и cre/lox рекомбинацию, с помощью которых осуществляются последовательные селективные процессы Mu-зависимой интегра ции-амплификации нескольких гетерологичных генов в хромосоме M. methylotrophusAS1 и удаление на промежуточной стадии, перед следующим раундом интеграции-амплификации, селективных маркеров и энхансерной последовательно сти из всех содержащихся в хромосоме копий mini-Mu с целью сохранения количе ства и локализации интегрированных на первом этапе копий целевого гена, проде монстрированы на примере модельных генов yEGFP и yECitrine, кодирующих, соот ветственно, зеленый и желтый флуоресцентные белки.
Было также показано, что, при необходимости, в качестве альтернативного маркера детерминантам устойчивости к антибиотикам для тестирования точного количества копий mini-Mu в хромосоме при его амплификации могут служить зеленый и желтый флуоресцентные белки.