Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 14
2.1. Общие сведения о вирусах лейкоза птиц и вызываемых ими заболеваниях .14
2.1.1. История открытия вирусов лейкоза птиц .14
2.1.2. Классификация вирусов лейкоза птиц 14
2.1.3. Морфология, химический состав и структура вирионов 15
2.1.4. Устойчивость к физическим и химическим воздействиям .18
2.1.5. Антигенная активность .18
2.1.6. Эпизоотологические данные .19
2.1.6.1. Восприимчивые виды птиц .19
2.1.6.2. Распространение 20
2.1.6.3. Пути передачи .24
2.1.7. Клинические признаки инфекции и патоморфологические изменения .26
2.1.8. Профилактика заболеваний, вызываемых вирусами лейкоза птиц 28
2.2. Диагностика 30
2.2.1. Обнаружение генома вирусов лейкоза птиц 31
2.2.2. Выделение вирусов лейкоза птиц на культурах клеток
2.2.2.1. Методы выделения ВЛП 31
2.2.2.2. Криоконсервирование клеток ФЭК 32
2.2.3. Обнаружение антигена вирусов лейкоза птиц .34
2.3. Выявление антител к вирусу лейкоза птиц методом иммуноферментного анализа 36
2.3.1. Сущность и принципы метода .37
2.3.2. Непрямой вариант ИФА
2.3.2.1. Носители для сенсибилизации антигена 38
2.3.2.2. Антиген 39
2.3.2.3. Сенсибилизация планшет антигеном 40
2.3.2.4. Конъюгат .41
2.3.2.5. Анализ результатов 41
2.3.3. Преимущества иммуноферментного анализа перед другими методами выявления антител к вирусам лейкоза птиц .44
2.3.4. Выявление антител к вирусу лейкоза птиц с помощью иммуноферментного анализа .44
2.4. Заключение по обзору литературы .47
3. Собственные исследования .49
3.1. Материалы и методы 49
3.1.1. Материалы 49
3.1.2. Оборудование 49
3.1.3. Растворы и химреактивы .51
3.1.4. Методы .52
3.2. Результаты собственных исследований .65
3.2.1. Серологический мониторинг лейкоза птиц, проведённый с 2008 по 2015
гг. в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации 65
3.2.1.1. Исследование сывороток крови кур на наличие типоспецифического антигена p27, проведённое в период 2008-2015 гг 65
3.2.1.2. Исследование сывороток крови кур на антитела к ВЛП-J, проведённое в период 2008-2015 гг 68
3.2.1.3. Выявление вирусов лейкоза птиц на территории Российской Федерации
3.2.2. Выявление генома вирусов лейкоза птиц на территории Российской Федерации с 2008 по 2014 гг 73
3.2.3. Выделение изолятов ВЛП-J из проб патологического материала в первичной культуре клеток ФЭК 74
3.2.4. Выбор изолята для разработки иммуноферментной тест-системы 76
3.2.4.1. Определение титра инфекционной активности выделенных изолятов ВЛП-J 76
3.2.4.2. Исследование выделенных изолятов ВЛП-J на
контаминацию 76
3.2.4.3. Определение нуклеотидной последовательности генома выделенных изолятов ВЛП-J 77
3.2.5. Изучение биологических свойств штамма ALV-J/ CLB-908U .78
3.2.6. Получение культурального препарата антигена ВЛП для использования в серологических реакциях 81
3.2.6.1. Криоконсервирование первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбрионов кур .81
3.2.6.2. Подбор условий для получения антигена ВЛП .89
3.2.6.2.1. Определение оптимального срока инкубации штамма вируса ALV-J/CLB-908U 89
3.2.6.2.2. Определение оптимальной инфицирующей концентрации штамма ALV-J/CLB-908U .90
3.2.6.3. Очистка и концентрирование культурального антигена ВЛП .91
3.2.7. Разработка тест-системы для выявления антител к ВЛП в непрямом варианте ИФА 93
3.2.7.1. Определение рабочей концентрации антигена ВЛП 94
3.2.7.2. Проверка специфичности антигена ВЛП .95
3.2.7.3. Исследование стабильности антигена ВЛП во время хранения при 4С .96
3.2.7.4. Получение контрольных сывороток к ВЛП 97
3.2.7.5. Определение оптимального разведения исследуемых сывороток и
выведение уравнения для вычисления титра исследуемых сывороток .97
3.2.7.6. Определение позитивно-негативного порога 103
3.2.7.7. Выбор допустимых значений контрольных сывороток .104
3.2.7.8. Определение воспроизводимости метода 106
3.2.7.9. Оценка чувствительности, специфичности, точности, степени согласованности полученных результатов разработанной тест-системы по отношению к коммерческому набору фирмы IDEXX . 110
3.2.8. Применение разработанной тест-системы при проведении скрининговых исследований сывороток крови на антитела к ВЛП .112
4. Обсуждение результатов исследований 114
5. Выводы 128
6. Практические предложения .130
7. Список литературы
- Морфология, химический состав и структура вирионов
- Преимущества иммуноферментного анализа перед другими методами выявления антител к вирусам лейкоза птиц
- Выявление генома вирусов лейкоза птиц на территории Российской Федерации с 2008 по 2014 гг
- Оценка чувствительности, специфичности, точности, степени согласованности полученных результатов разработанной тест-системы по отношению к коммерческому набору фирмы IDEXX .
Морфология, химический состав и структура вирионов
История открытия вирусов лейкоза птиц. Работы по исследованию лейкоза птиц начались ещё в конце XIX в. В 1868 году Roloff опубликовал сообщение о случае «лимфосаркомата». Caparini в 1896 году описал лейкемию домашней птицы. В 1905 году Butterfield ввёл понятие «нелейкозного лимфаденоза» при диагностировании заболевших кур [2]. Эллерман открыл восемь штаммов вируса лейкоза птиц и дал названия некоторым формам лейкоза, которые применяются до сих пор: эритроидный, миелоидный и лимфоидный [128]. Множество штаммов ВЛП было изучено исследователями США и в других странах в 20-х и 30-х годах XX века [41]. Начиная с 1960 года было проведено огромное количество исследований, в ходе которых была получена значительная часть информации о лейкозе птиц. В это время были проведены работы по изучению экспериментальной передачи лейкоза, разработаны методики выделения ВЛП в культуре клеток, выявлены особенности взаимодействия вируса и клетки, запускающие механизмы онкогенеза [85, 128].
К настоящему времени расшифрованы нуклеотидные последовательности генома многих штаммов вируса лейкоза птиц [25, 92, 98, 129]. Вирус лейкоза птиц подгруппы J (ALV-J) впервые был выделен в 1988г. в Великобритании от цыплят-бройлеров [72, 121, 125, 126, 154]. Вскоре был выделен и зарегистрирован штамм ВЛП-J HPRS-103 [128]. В 1992г. были доказаны онкогенные свойства ВЛП-J [44, 124, 128]. В 2002г. было установлено, что ВЛП-J может быть патогенным для несушек [154].
Классификация вирусов лейкоза птиц. Согласно данным современной классификации, вирусы лейкозно-саркомной группы относятся к роду Alpharetrovirus семейства Retroviridae, подсемейства Orthoretrovirinae [1, 2]. Отличительная особенность вирусов семейства Retroviridae заключается в наличии у них фермента обратной транскриптазы, участвующего в образовании ДНК-содержащего провируса во время репликации вируса [1, 15, 45, 170]. ВЛП подразделяются на 6 антигенных подгрупп: A, B, C, D, E, J. В основе деления - различный набор антигенов в составе вирусной оболочки у представителей данных подгрупп, разная интерферирующая активность в отношении вируса саркомы Рауса и способность поражать определенные фенотипы клеток [72, 125, 128, 173]. В зависимости от способа передачи вируса выделяют экзогенные и эндогенные ВЛП. К экзогенным относятся вирусы подгрупп A, B, C, D, J, передающиеся горизонтальным (контактным) и вертикальным (т.е. от несушки к потомству) путём, а к эндогенным – вирусы подгруппы E, передающиеся через геном [9, 25, 31, 33, 55, 175]. Имеются также данные о выделении вирусов подгрупп F и G от обыкновенных, алмазных и золотых фазанов [85, 129, 136], подгруппы H от венгерской куропатки [129] и подгруппы I от шлемоносного хохлатого перепела [162].
Морфология, химический состав и структура вирионов. По ультраструктурным характеристикам ВЛП имеют одинаковые признаки. Диаметр вириона ВЛП составляет 80-145 нм, молекулярная масса - 5,0-6,0109 дальтон. Вирионы имеют шаровидную форму и покрыты липопротеиновой оболочкой. На их поверхности имеются характерные выступы длиной около 8 нм с закруглёнными головками [1, 9, 15, 29, 45, 113]. В результате проведения специфического окрашивания становятся видны нуклеопротеиновые микрофиламенты спиралевидной формы диаметром 3-5 нм. Диаметр сердцевины составляет 35-45 нм. Нуклеокапсид имеет икосаэдрический тип симметрии. Величина плавучей плотности в сахарозе для ВЛП составляет 1,15-1,17г/см3 [1, 29, 113, 137]. В состав вириона входят 30—35 % липидов, 60—65 % белков, 2,2 % РНК и небольшое количество ДНК, возможно, клеточного происхождения [33].
Геном ВЛП может существовать в двух формах: геномной РНК или в виде ДНК, синтезированной на геномной РНК и встроенной в виде провируса в хромосому клетки-хозяина [1, 15]. Геномная РНК содержится только в зрелых вирионах и имеет молекулярную массу 1,0-1,2109 дальтон [1]. Аналогичные особенности генома отмечают у вирусов лейкоза КРС [3, 4, 5]. Коэффициент седиментации геномной РНК составляет 60—70S. РНК с 4—5S в основном являются тРНК хозяина. Предположительно, эти РНК не играют никакой роли в репликации вируса. Однако встречается тРНК-праймер, связанный с 70S РНК, который играет определённую роль в жизненном цикле вируса. В составе вириона имеется также небольшое количество 18S и 28S рибосомных РНК, вирусных и клеточных мРНК и ДНК [45, 46, 103].
Преимущества иммуноферментного анализа перед другими методами выявления антител к вирусам лейкоза птиц
Исследования по разработке иммуноферментных тест-систем для обнаружения антител к ВЛП начались во второй половине XX века. В 1986 г. были опубликованы результаты исследований группы учёных под руководством E.J. Smith. В качестве антигена использовали штамм ВЛП-А RAV-1. Для получения антигена вируссодержащую суспензию, полученную с помощью КК ФЭК, подвергали очистке через градиент плотности сахарозы. В качестве носителя использовали 96-луночные планшеты. Рабочее разведение антигена составляло 0,5-1,0 мкг на лунку. Для разведения исследуемых сывороток применяли фосфатно-буферный раствор с добавлением 0,1% твин-80. В качестве конъюгата применяли антитела кролика против IgG кур, меченые пероксидазой. Хромогенную реакцию проводили с добавлением смеси пероксида водорода и 5-аминосалициловой кислоты. Оптическую плотность измеряли при длине волны 490 нм. Совпадаемость результатов данной тест-системы, полученных на разных группах сывороток крови кур, с результатами реакции нейтрализации варьировала от 83 до 95% [148].
Начиная с 90-х гг., ведутся эксперименты по использованию методов генной инженерии для создания препаратов антигена ВЛП. В 1997 г. было опубликовано сообщение о создании K. Venugopal и соавт. препарата рекомбинантного гликопротеина gp85, полученного с помощью бакуловирусного вектора. Гликопротеин был выделен из штамма ВЛП-J HPRS-103. Культивирование бакуловируса осуществляли на культуре гибридомных клеток Sf9. Очистку препарата проводили методом аффинной хроматографии с использованием глютатиона. На основе полученного рекомбинантным путём гликопротеина была разработана иммуноферментная тест-система для выявления антител к ВЛП-J. Для сенсибилизации антигена использовали 96-луночные полимерные планшеты. В качестве конъюгата применяли меченый пероксидазой антикуриный IgG. Выявление иммунных комплексов осуществляли с помощью TMB. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм. Разработанная тест-система показала высокую специфичность и чувствительность в сравнении с коммерческим ИФА-набором и реакцией нейтрализации [133].
M.-F. Hsu и соавт. разработали тест-систему на основе непрямого варианта ИФА для обнаружения антител к ВЛП-А. В качестве антигена использовали рекомбинантный гликопротеин gp85, полученный путём экспрессии бакуловирусного вектора. Культивирование бакуловируса проводили на культуре клеток Sf9. По окончании инкубации в культуральные сосуды добавляли лизирующий буфер для разрушения клеточных стенок, полученную смесь осаждали на центрифуге для отделения клеточных фрагментов. Надосадочную жидкость использовали в качестве препарата антигена для нанесения на планшеты. В данном случае антиген не подвергали дополнительной очистке, так как в ходе проведения иммуноблоттинга не наблюдалось неспецифического связывания неинфицированного образца культуры клеток с моноклональными антителами, полученными на gp85 ВЛП-А. В качестве хромогенного субстрата использовали TMB. В сравнении с реакцией нейтрализации чувствительность метода составила 80%, специфичность – 83,3% [88].
Помимо тест-систем на основе гликопротеина gp85, позволяющих выявить антитела к ВЛП определённых подгрупп, разработаны ИФА-методы для выявления антител, общих для всех подгрупп вируса. В ходе работ по изучению штамма ВЛП-J HPRS-103 было установлено, что при проведении вестерн-блота наблюдалась перекрёстная нейтрализация между белком р27, входящим в состав HPRS-103, и сывороткой крови кролика, полученной на штамм ВЛП-А HPRS-F42 [21]. В 2011 г. было опубликовано сообщение о разработке Y. Qiu и соавт. тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления антител к ВЛП. В качестве антигена использовали рекомбинантный капсидный белок р27. Фрагмент гена, кодирующий р27, был выделен из штамма ВЛП-J JS-nt и клонирован в векторе pGEX-6P-1. Очистку белка проводили методом хроматографии с использованием глютатиона. В качестве конъюгата применяли антитела козы против иммуноглобулинов кур, меченые пероксидазой хрена. Хромогенную реакцию проводили с помощью ОФД. Данная тест-система показала высокую специфичность и чувствительность в сравнении с реакцией иммунофлюоресценции и коммерческими ИФА-наборами для выявления антител к ВЛП подгрупп А, В и J [63]. Приведённые исследования доказывают возможность использования изолятов ВЛП-J в качестве источника антигена р27 для выявления общих для всех подгрупп ВЛП антител.
В РФ для исследования сывороток крови кур на антитела к ВЛП применяются зарубежные коммерческие ИФА-наборы фирм Zoetis и IDEXX (США). Для производства набора для выявления антител к ВЛП-J (Zoetis, США) в качестве антигена используют рекомбинантный гликопротеин gp85.
Применение генно-инженерных технологий для производства антигена позволяет получить высокие концентрации препарата за короткие сроки. Однако получение данного препарата связано с техническими трудностями и требует существенных затрат времени и ресурсов.
Выявление генома вирусов лейкоза птиц на территории Российской Федерации с 2008 по 2014 гг
С целью непрерывного обеспечения лаборатории КК ФЭК для получения вирусного материала, направляемого на изготовление антигена, необходимо было разработать метод получения препарата клеток ФЭК, способного сохраняться длительное время при сверхнизких температурах. Был проведён ряд исследований, направленных на оптимизацию условий криоконсервирования первично-трипсинизированных клеток ФЭК.
Жизнеспособность и пролиферация клеток ФЭК после хранения в экстремальных условиях напрямую зависит от условий трипсинизации и культивирования. Чтобы уменьшить потери клеток ФЭК, связанные с криоконсервированием, необходимо было получить достаточное количество суспензии с их высокой концентрацией для отбора жизнеспособных клеток. Изучение жизнеспособности клеток ФЭК позволило оценить возможность получения клеточной суспензии для длительного хранения путём культивирования фибробластов и сбора клеток методом диспергирования монослоя. Для этого была проведена работа по вычислению коэффициента выживаемости клеток и их способности к пролиферации на первом пассаже. После изготовления суспензии первично-трипсинизированных клеток ФЭК проводили подсчёт живых (неокрашенных) клеток. Концентрацию клеток доводили ростовой средой до 800-950 тыс. кл/ см3 при объёме вносимой суспензии в культуральный флакон 100 см3. КК инкубировали при 37С в течение 24 ч. После образования монослоя проводили диспергирование клеток с использованием смеси трипсина и версена. Полученную суспензию сливали в центрифужные пробирки и осаждали в течение 10 мин при 800 об/мин. Осадок ресуспендировали в бессывороточной среде в объёме 100 см3 для каждого образца. В отобранных образцах подсчитывали количество живых клеток, после чего рассчитывали коэффициент выживаемости по формуле, приведённой в п. 3.1.2.
В ходе проведения исследований посевная концентрация клеток составила (0,93±0,19) млн. кл/см3. После адгезирования клеток, смены среды и формирования монослоя, концентрация диспергированных клеток составила (0,19±0,07) млн. кл/см3, то есть в 5 раз меньше, чем было первоначально инокулировано. Коэффициент выживаемости в таких условиях составил 0,2. Таким образом, было показано, что выросшие клетки ФЭК после посева на ростовую поверхность, обладают слабыми пролиферативными свойствами, лишь 20% клеток участвуют в образовании монослоя, поэтому для замораживания клеточной суспензии предпочтительно применять первично трипсинизированные клетки ФЭК. W. Guan и соавт. был разработан метод криоконсервирования клеток ФЭК, получаемых из эмбрионов кур бройлерных пород [37]. Для криоконсервирования использовали первично-трипсинизированную суспензию клеток ФЭК. Готовили смесь, состоящую из клеточной суспензии, фетальной сыворотки и ДМСО, в соотношении 40%- 50%-10%, проводили подсчёт клеток, после чего смесь подвергали криоконсервированию. Поcле 7 суток хранения проводили размораживание клеток в водяной бане при температуре 40С, подсчёт клеток и оценку морфологического состояния живых клеток с помощью светового микроскопа. В ходе проведения работы было установлено, что после оттаивания суспензии выживало 60 % клеток. Концентрация клеток до замораживания составила (2,9±0,1) млн кл/см3, после оттаивания – (1,74±0,2) млн кл/см3. Затем суспензию разбавляли в ростовой среде, высевали в культуральные флаконы и инкубировали при температуре 37С. По истечении суток поверхность флаконов была покрыта пролиферирующими клетками на 30%. В течение последующих 3 суток дальнейшего деления прикрепившихся клеток не происходило. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что данный способ криоконсервирования не способствует сохранению пролиферативных свойств клеток ФЭК, полученных из SPF-эмбрионов кур-несушек.
С целью оптимизации условий криоконсервирования клеток ФЭК были проведены следующие работы: подобраны оптимальные соотношения криоконсервирующей смеси; стабилизированы режимы охлаждения и оттаивания; проведено изучение жизнеспособности при длительном хранении при минус 150С и непродолжительном хранении при минус 196С.
Выбор криоконсервирующей смеси ДMСO-сыворотка был сделан на основе ранее предложенных концентраций [10, 37] c небольшими вариациями. Суспензии ФЭК с выбранными вариантами концентраций криозащитных веществ были подвергнуты эквилибрации. Результаты работы приведены в таблице 9.
Из приведённых данных видно, что снижение концентрации клеток после эквилибрации наблюдалось в образцах, содержащих 10% фетальной сыворотки и 20% ДМСО, а также 20% сыворотки и 20% ДМСО. В остальных образцах концентрация клеток не менялась. Таким образом, 20% концентрация ДМСО в криоконсервирующей смеси является токсичной для клеток ФЭК уже на этапе добавления и первичного контакта, поэтому для проведения дальнейшей работы были выбраны образцы 1, 2, 3, 5, 6, 7.
Следующим этапом работы было изучение жизнеспособности клеток ФЭК в зависимости от продолжительности хранения при сверхнизких температурах. Для этого готовили клеточные суспензии, добавляли криопротектор с сывороткой, расфасовывали по криопробиркам в объёме 4 см3, помещали в термоконтейнер и хранили в течение эксперимента в низкотемпературном холодильнике при температуре минус 150С. Оттаивание, подсчёт клеток и высев в культуральные флаконы проводили с интервалом в 2 мес. Размораживание проводили при температуре 26-30С. Продолжительность наблюдения данного этапа работы составляла 12 месяцев. Результаты по изучению выживаемости клеток после глубокой заморозки приведены в таблице 10.
Оценка чувствительности, специфичности, точности, степени согласованности полученных результатов разработанной тест-системы по отношению к коммерческому набору фирмы IDEXX .
ВЛП являются возбудителями ряда неопластических заболеваний, таких как лимфоидный лейкоз, миелобластоз, миелоидный лейкоз, глиома и др [2, 72]. ВЛП способны к длительной персистенции в организме птицы, однако, под влиянием различных стресс-факторов существует вероятность возникновения острой формы инфекции [128]. У инфицированной ВЛП птицы, наблюдается снижение репродуктивности, качества яиц, повышается смертность от вторичных инфекций [127].
В настоящее время специфическая профилактика ВЛП невозможна ввиду отсутствия коммерческих вакцин. В связи с этим мерами борьбы с инфекцией являются проведение диагностических мероприятий по обнаружению вируса среди поголовья птицы, постановка диагноза, выбраковка и уничтожение больной птицы [2, 73]. Для своевременного предотвращения возникновения заболеваний необходим постоянный контроль за распространением вируса в птицеводческих хозяйствах. Наиболее эффективным инструментом в решении данной задачи являются серологические исследования.
Среди методов выявления антител к ВЛП наиболее распространёнными являются реакция нейтрализации и ИФА. Реакция нейтрализации обладает высокой специфичностью и чувствительностью, но является трудоёмкой в исполнении и требует существенных затрат времени, порядка 7-9 суток [153]. Метод ИФА имеет ряд преимуществ по сравнению с реакцией нейтрализации: высокая чувствительность, простота исполнения, возможность исследования малых объёмов образцов (до 30 мкл). Использование в качестве носителя антигена для проведения ИФА 96-луночных микропланшет из полистирола или поливинилхлорида позволяет одновременно исследовать большое количество проб и автоматизировать процедуру исследования [17].
В РФ для исследования сывороток крови кур на антитела к ВЛП применяются зарубежные коммерческие ИФА-наборы фирм Zoetis и IDEXX (США). В РФ иммуноферментных тест-систем для выявления антител к ВЛП не разработано.
Исходя из вышеизложенного, целью нашей работы являлась разработка тест–системы для выявления и определения титра антител к ВЛП.
Для обоснования необходимости разработки данной тест-системы была поставлена задача по изучению распространения вирусов лейкоза птиц на территории РФ с 2008 по 2015 гг.
Работы по выявлению инфекции, вызванной ВЛП, проводятся и зарубежными учёными. С середины XX в. до начала 2000-х гг. в странах Запада вспышки лейкозов птиц носили массовый характер, однако, в последние годы в связи с развитием проектов, направленных на борьбу с ВЛП, случаи заболеваний носят спорадический характер [128]. Так, в конце 2004г. в трёх яичных хозяйствах США были отмечены случаи заболеваемости кур саркомой в возрасте 7 недель. [139]. В 2010 г. было опубликовано сообщение о вспышке неопластической инфекции, вызванной ВЛП-A, в одном из птицехозяйств США. Частота заболеваемости составляла 0,0008-0,008% в неделю [104]. Согласно данным 2007-2010гг., во многих бройлерных стадах США и стран Европы выявлялась персистирующая виремия [91, 153].
С начала 2000-х в странах Азии отмечается ухудшение эпизоотический ситуации по лейкозу птиц. В середине 2000-х гг., в ходе исследований, проведённых на 61 бройлерной птицефабрике Тайвани, в 60 хозяйствах были выявлены изоляты ВЛП-A, в 43 – изоляты ВЛП-J [40]. В 2000-2005 гг. в Китае у коммерческих кур-несушек регулярно выявляли миелоидный лейкоз [114, 154]. Начиная с 2008г., в яичных птицефабриках Китая регулярно отмечают вспышки инфекции ВЛП-J [81, 92].
Для получения комплексной оценки распространённости ВЛП на птицефабриках РФ необходимо было провести серологические и молекулярные исследования биоматериала, полученного от коммерческого птицепоголовья. Известно, что ВЛП выявляют главным образом у кур яичных и мясных пород [72], поэтому исследования проводили среди кур различных возрастных групп. Для выявления генома ВЛП использовали метод ОТ-ПЦР-РВ, для исследования сывороток крови кур – коммерческие наборы для проведения ИФА фирмы Zoetis (США).
В период с 2008 по 2015 гг. был проведён серологический мониторинг, направленный на выявление в сыворотках крови кур, направленных на исследование из птицефабрик 107 птицефабрик РФ, антител к ВЛП-J. Обследованные птицефабрики расположены в 7 федеральных округах РФ. Было протестировано 14054 образца сывороток крови кур, из которых в 29% были выявлены антитела к ВЛП-J. Также с 2009 по 2015гг. были проведены исследования сывороток крови кур на наличие антигена p27. Данный антиген входит в состав капсида ВЛП всех подгрупп, т.е. является типоспецифическим [45]. Из 9107 образцов сывороток, поступивших на исследование из 108 птицефабрик РФ, в 66% был выявлен антиген p27. Полученные результаты свидетельствуют об инфицировании коммерческого птицепоголовья РФ ВЛП.
В результате анализа распределения результатов по федеральным округам было выявлено, что наибольшая доля птицы, содержащей антитела к ВЛП-J, была выявлена в птицехозяйствах Приволжского (35%) и Южного (35%) федеральных округов. Наибольший процент птицы, положительной на антиген p27, выявляли на птицефабриках Уральского (83%), Центрального (70%), Сибирского (70%) федеральных округов. Исходя из полученных данных, перечисленные федеральные округа находятся в зоне риска по возникновению вспышек ВЛП. Существует вероятность, что пограничное расположение данных округов является одним из факторов, способствующих распространению инфекции, вызываемой ВЛП.
Был проведён анализ результатов серологического мониторинга, полученных от птицы разных возрастных групп яичного и мясного направлений. Антитела к ВЛП-J выявляли у кур всех возрастов, однако, наибольшее количество серопозитивной птицы отмечали у бройлеров возрастной группы 301-400 сут. (36%) и у несушек возрастной группы 101-200 сут. (46%). Типоспецифический антиген также выявляли в пробах сывороток от птицы всех возрастов. Наибольший процент кур, положительных на p27, отмечали у бройлеров возрастной группы 301-400 сут. (74%) и у несушек возрастной группы 11-100 сут. (73%).
Аналогичные исследования были проведены В.А. Плотниковым в 2005-2011гг. Результаты, полученные за данный период, также свидетельствуют о распространении ВЛП среди кур всех возрастов. Наибольший процент кур бройлерных пород, положительных на антитела к ВЛП-J, был выявлен в возрастной группе старше 300 сут., что коррелирует с проведёнными нами исследованиями [13].
По результатам исследований по выявлению ВЛП на территории РФ за 2008-2015гг. была составлена карта, на которой отображены регионы выявления антигенов и генетического материала возбудителей лейкоза птиц, а также антител к ВЛП-J. В работе В.А. Плотникова приведена карта, где отмечены регионы, на птицефабриках которых с 2005 по 2011гг. проводили серологические исследования по выявлению антигена ВЛП и антител к ВЛП-J. Известно, что в состав Российской Федерации входит 83 региона. Исследования проводили в 47 регионах 5 федеральных округов страны. Согласно информации, обозначенной на данной карте, антиген ВЛП и антитела к ВЛП-J выявляли в основном на птицефабриках регионов Центрального и Южного федеральных округов. В Северо-Западном, Приволжском и Уральском федеральных округах было обнаружено меньшее количество серопозитивной птицы, неблагополучные регионы находились в южных частях данных округов.