Введение к работе
Актуальность проблемы. Грипп продолжает оставаться наиболее массовой и неуправляемой инфекцией, несмотря на определенный прогресс в области разработки средств профилактики этого заболевания. Одной из причин неспособности контролироватьэту инфекцию является отсутствие четких знаний об изменениях, происходящих в вирусной и человеческой популяциях в межэпидемический по гриппу период ( Leowski J.,1986 ).
В последние годы получены новые данные о бессимптомных формах гриппозной инфекции ( Соминина А Л. и др., 1994 ), однако,могут ли здоровые вирусоносители быть источником инфицирования при гриппе и каков вклад этого явления в развитие эпидемического процесса до конца не выяснено.
Трудности в решении этих вопросов связаны, с одной стороны.с биологическими особенностями вирусов гриппа А, крайне трудно выделяющихся в межэпидемический период и при персистентных формах гриппозной инфекции (Иванова НА. и др.,1984;Лузянина Т.Я.идр.1978; Медведева М.Н. и др.Д977;Смородинцев А.А. и др.,І96І;198І). С другой стороны,известно,что традиционные тесты специфической диагностики гриппа, такие как метод иммунофлуоресценции (МИФ), носят качественный характер.страдают субъективизмом (Espy et al.,1986;Shalit et al.,1985) и имеют ряд ограничений при проведении массовых исследований. Это не позволяет использовать МИФ как для оценки процессов циркуляции вирусов гриппа в человеческой популяции, так и мониторинга инфекционного процесса у больных гриппом людей, необходимого для понимания механизмов становления хронических и осложненных форм гриппозной инфекции,в том числе заболеваний аутоиммунной природы и поражений центральной нервной системы (ЦНС). Указанные недостатки МИФ могут быть успешно преодолены при использовании иммуноферментного анализа (ИФА) как наиболее доступного метода количественной детекции вирусных антигенов.
В этой связи создание иммуноферментных тест-систем (ИФТС) высокой чувствительности и специфичности для быстрой индикации гриппозной инфекции, отбывающее новые перспективы в изучении нераспознанных аспектов эпидемиологии и клиники гриппа, следует признать
задачейгвесьма актуальной для науки и практики здравоохранения.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось усовершенствование ИФТС детекции антигенов вируса гриппа типа А на основе использования иммунореагентов моноклонального типа, новых субстратов и твердофазных носителей с изучением лабораторных параметров новых вариантов ИФТС и их апробацией в клинической и эпидемиологической практике.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Изучить свойства новых препаратов моноклональных антител (МА) к различным детерминантам поверхностных и внутренних белков вирусов гриппа человека и птиц.
-
Провести отбор МА,пригодных для диагностических исследований в экспериментальной и клинической вирусологии.
-
Определить оптимальные комбинации различных МА при конструировании ИФТС.
-
Изучить возможности применения вновь разработанных вариантов ИФТС для изучения динамики накопления вирусных антигенов (ВА) на клеточном уровне в сравнении с традиционными тестами.
5. Оценить возможности и перспективы использования
новых вариантов ИФА при индикации ВА в клинических
материалах.
6. Определить возможность замены канцерогенного
субстрата иммунопероксидазной реакции на неканцерогенный.
Основные положениядьшосимые на защиту;
[.Сравнительное изучение чувствительности,
специфичности и диапазона реагирования панели
моноклональных антител к гемагглютинину
(ГА),нуклеопротеину (НП) и М-белку вирусов гриппа А человека и птиц позволило отобрать МА к НП (1С6, F8, 24В4), в наибольшей мере отвечающие заданным лабораторным параметрам, важным для специфического распознавания гриппа Айв клинических условиях и эпидемиологической практике.
2.Указанные МА к НП позволяли диагностировать грипп А вне зависимости от субтипа и видовой принадлежности вируса. Методом конкурентного ИФА установлено, что МА 1С6, F8 и 24В4 направлены к эпитопу НП, общему для всех известных субтипов вирусов гриппа А человека и изученных вирусов гриппа птиц ( в отличие от МА 5С10 к НП и МА 25С4, 33F1 к ГА, реагирующих только с вирусами определенной видовой
принадлежности ) , что свидетельствует в пользу возможности их диагностического применения и в случае появления нового пандемического штамма.
-
На основе MA IC6 к НП вируса гриппа сконструирована высоко специфичная ИФТС (ИФТС-НП), пригодная для детекции вирусных антигенов в сложных биологических смесях и в клинических материалах.
-
На модели клеточных культур впервые показана высокая стабильность НП-детерминанты .выявляемой с помощью МА 1С6,что позволяет в течение длительного времени определять присутствие вирусного антигена в культуральной жидкости инфицированных клеточных культур, а также в секретах респираторного тракта при гриппозной инфекции.
5. Установлена возможность детекции вирусного НП в
клинических материалах (носоглоточные смывы, аспираты),
полученных от больных гриппом , а также при бессимптомных
формах гриппозной инфекции. Показано.что динамика
накопления и последующей элиминации ВА из носоглотки
больных гриппом людей коррелирует с уровнем специфических
сывороточных антител классов IgM и IgG.
6. Разработан безопасный вариант ИФТС-НП с
использованием в качестве неканцерогенного субстрата
тетраметилбензидина , который может быть рекомендован для
широкого внедрения в производство ИФТС без снижения
чувствительности и специфичности реакции (взамен
канцерогенного по своей природе ортофенилендиамина).
7.Предложен новый вариант простого ускоренного дот-мембранного моноклонального ИФА для диагностики гриппа А,не уступающий по показателям чувствительности и специфичности хорошо апробированному в клинических условиях планшетному варианту ИФТС.
Научная новизна работы:
-
Впервые отобраны для целей диагностики гриппа А высоко специфичные МА 1С6 , F8 и 24В4 к НП вируса гриппа А, распознающие антигенные детерминанты, общие для вирусов гриппа человека и гггиц.
-
На основе МА IC6 впервые разработаны ИФТС детекции НП вируса гриппа типа А с показателями чувствительности и специфичности - 92 и 95%, соответственно, при сравнении с результатами диагностики гриппа с использованием комплекса традиционных методов.
3.Впервые показана возможность использования ИФТС-НП для обнаружения вирусных антигенов на отдаленных сроках экспериментальной и естественной гриппозной инфекции.
4. Для выявления вирусных антигенов в клинических
материалах (носоглоточные смывы ) предложено использовать
новый вариант простого ускоренного дот-мембранного ИФА
(ДМ-НП) на основе пероксидазного конъюгата MA 1С6 и
неканцерогенного субстрата.
5. Выявлена высокая диагностическая значимость
разработанных вариантов ИФТС при анализе клинически
выраженных и бессимптомных форм гриппозной инфекции.
Практическая значимость работы. Разработана и внедрена в практику усовершенствованная ИФТС-НП, позволяющая (в отличие от ИФТС поликлонального типа) существенно повысить частоту диагностирования гриппа А при детекции вирусного НП в носоглоточных смывах и аспиратах.
Показана перспективность использования ИФТС-НП для оценки процесса латентной циркуляции вирусов гриппа в человеческой популяции и определения его значимости Б развитии эпидемического процесса. Кроме того, ИФТС моноклонального типа можно рекомендовать для мониторинга инфекционного процесса и изучения противовирусной активности новых соединений на клеточном уровне.
Результаты детекции вирусного НП у отдельных больных на поздних сроках инфекции свидетельствуют о целесообразности назначения средств специфической противовирусной терапии не только в ранние сроки болезни, но и в более поздний период ( при затяжном инфекционном процессе).
Новый субстрат для ИФА - 3,3^5,У-тетраметилбензидин (ТМБ) может быть рекомендован в широкую диагностическую практику, как не проявляющий мутагенного и канцерогенного действия (в отличие от широко используемого ортофенилендиамина).
Разработан новый вариант простого и ускоренного ДМ-НП для детекции антигенов вируса гриппа типа А, который не уступает по чувствительности и специфичности хорошо апробированному планшетному варианту ИФТС-НП. Методы ИФА, предлагаемые для внедрения в широкую диагностическую практику.позволят осуществить раннюю диагностику гриппа , что, в конечном итоге, может определить новую врачебную тактику при назначении химиопрепаратов с целью этиотропного лечения или экстренной профилактики гриппа в очагах, в том
числе в стационарах во избежание развития внутрибольничной инфекции.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых. НИИ гриппа (Санкт-Петербург, май 1993) , на выездной сессии РАМН ( Санкт-Петербург, 1995 ) , международной конференции " Progress in clinical virology " (Прага, сентябрь 1995).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.
Объем и структура работы-Диссертапия изложена на
і$9. страницах машинописного текста, включая 27 таблиц и 21
рисунок. Работа состоит из введения,обзора литературы,5 глав
собственных исследований,обсуждения и списка