Введение к работе
Актуальность проблемы. Разработка новых технологий, включающих культивирование, выделение, очистку, анализ вирусов и вирусных белков для создания новых вакцин против гриппа, бешенства, клещевого энцефалита, СПИДа становится возможным благодаря интенсивному внедрению в биотехнологию и вирусологию современных методов исследований, НОЦЫа ориг;п;аяь:;ь!?: нрибпрпн и методик управления этими процессами.
Открытие возможности управления клеточными процессами привело к тому, что клеточная инженерия в сочетании с микробиологическим синтезом, широким использованием современных методов биофизики и биохимии стали основой новой технологии.
Выпуск биотехнологической продукции в значительной мере определяется возможностями методов выделения веществ и соединений, вырабатываемых биологическими системами, а также последующей процедурой очистки и анализа конечного продукта. В условиях биотехнологического бума роль методов выделения, очистки и анализа биообъектов значительно возрастает. Это относится и к такой динамично развивающейся области, какой является вирусология.
В конце 70-х годов в России происходит становление новой отрасли биотехнологической промышленности - производство высокоочищенных вирусных вакцин. Это связано с успехами в области новых физико-химических методов выделения, очистки и анализа суспензий и субъединиц вирусов, которые могут быть отнесены к транспортным методам: микрофильтрация, хроматография, электрофорез, ультрацентрифугирование. Эти методы характеризуются щадящим воздействием на выделяемые объекты, что делает их практически незаменимыми при работе с лабильными объектами биотехнологических производств, а возможность масштабирования и управления предопределяет их прикладное значение.
Разработка и совершенствование транспортных методов фракционирования и анализа биологических макромолекул и надмолекулярных образований в значительной степени определяет прогресс в различных областях биотехнологии, вирусологии и биохимии.
Состояние проблемы. Проблема очистки вирусных суспензий и выделения вирусных белков является исключительно важной задачей. Современное развитие производства вакцин, качество вакцинных препаратов, диагностика, профилактика и лечение инфекционных заболеваний в значительной мере зависят от уровня развития методов и технологий получения очищенных вирусных суспензий и белков.
Принципиально важным является и вопрос выбора препарата для вак-
цинопрофилактики (живой или инактивированный вирус), что, в свою очередь, определяет и способ очистки препарата.
При выборе методов очистки вирусных суспензий, их комбинации, мы исходили из состояния этой проблемы в России и за рубежом, где для этой цели используют различные варианты ультрацентрифугирования. В России к настоящему времени не налажен выпуск ультрацентрифуг, позволяющих обрабатывать крупные партии сырья (150-300 л ВАЖ *) за смену. В то же время, как в России, так и за рубежом в последние годы получили развитие мембранные методы разделения биомакромолекул и надмолекулярных образований, эксклюзионная хроматография низкого давления на макропористых кремнеземах, электрофорез. В Росси и за рубежом создана промышленная индустрия производства мембран, сорбентов для хроматографии. За рубежом налажен серийный выпуск различных мембранных приборов и устройств, нашедших широкое применение в различных областях науки, техники, медицины.
К началу нашей работы была разработана и внедрена в практику технология получения инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ) комбинацией методов адсорбции-элюции вирусов гриппа на куриных эритроцитах и эксклюзионной жидкостной хроматографии (ЭЖХ) на макропористых стеклах на предприятии НИИЭМ им. Пастера (Перадзе Т.В., Фридман Э.А., Пейсель З.Г., 1973), технология получения вакцины комбинацией методов адсорбционной хроматографии и ЭЖХ в НПО "Восток" (Бреслер С.Е., Ко-ликов В.М., Мчедлишвили Б.В., Молодкин В.М., 1976), разработана и внедрена методика концентрирования и очистки вируса гриппа на лавсановых ядерныхфильтрах(БреслерС.Е., Мчедлишвили Б.В., Флеров Г.Н.,1979), внедрен в практику метод получения ИГВ в НИИВС (С.-Петербург) на ультрацентрифугах типа "К2" фирмы "Электронуклеоникс" (США) (Константинов В.К., Соколов Н.Н.,1979).
На рис.1 представлены две основные группы - инактивированные (ИГВ) и живые (ЖГВ) гриппозные вакцины.
Инактивированные гриппозные вакцины
Цельновирионные Идиотипические
Расщепленные ^нно^нженерные
(сплит-вакцины)
Субъединичные Синтетчесте_
0ИГОППТИДНЬІЄ_
Живые гриппозные вакцины
Коммерческий препарат Очищенная_живад_
(не очищен от примесных белков) гриппозная вакцина
Рис. 1 Схема основных типов гриппозных вакцин, используемых в практике
( ) или находящихся в стадии экспери ментальной разработки (---).
*ВАЖ - вируссодержащая аллантоисная жидкость
Кроме того, в Одессе (Украина) был налажен выпуск живой гриппозной вакцины (ЖГВ) для интраназального применения взрослым и детям. Современный препарат представляет собой лиофильно высушенную ВАЖ, стабилизированную пептоном (Порубель Л.А., Париж Б.М., 1969). Следует отметить, что ЖГВ впервые предложена в 1937 г. акад. А.А.Смородинце-вым. В последующие годы наиболее значительные достижения в теоретическом и практическом плане по совершенствованию живых гриппозных вакцин были сделаны профессором Г.И.Александровой и ее сотрудниками - учениками и последователями акад. А.А.Смородинцева.
На основании анализа решения этой проблемы в России и за рубежом были выбраны в качестве универсального подхода к очистке оазличных вирусов в препаративных масштабах методы фильтрации и хроматогря-фии, оптимально дополняющие друг друга. Преимущество такого подхода состоит также в том, что оба метода относятся к группе транспортных методов разделения биомакромолекул, что теоретически позволяет разработать замкнутый технологический цикл крупномасштабного производства очистки вирусов, его технологической гибкостью, т.е. возможностью оперативного изменения параметров процесса, переналадки, возможностью его полной автоматизации.
В современной вирусологии большую роль играет возможность исследования индивидуальных вирусных белков, что определяется уровнем развития методов их выделения. Как правило, это гидрофобные белки, выделение которых является сложной технической задачей, особенно при условии сохранения их нативных свойств.
Для выделения гемагглютинина вируса гриппа (НА), как образца гидрофобного белка, был выбран метод изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в борат-полиольной системе, разработанный под руководством члена-корреспондента АН Украины Г.В.Троицкого. Электрофоретические методы обладают наибольшей разрешающей способностью для разделения белков, а метод ИЭФ занимает среди них ведущее положение.
Перспективным является изучение возможности использования элект-рофоретических методов для получения вирусных белков в условиях микрогравитации, нового направления биотехнологии - космического. Работы такого рода активно ведутся в США, Германии и России.
Целью работы является
Обоснование и разработка универсальной фильтрационно-хроматогра-фической технологии получения вирионных гриппозных вакцин.
Работа выполнена по общесоюзной проблеме "Грипп, гриппоподобные заболевания, их профилактика и лечение" (09.05).
Конкретные задачи. Работа посвящена изучению следующих вопросов:
1. Разработке методов предварительной очистки и концентрированию вирусных суспензий;
-
Разработке хроматографических методов очистки вирионов;
-
Обоснованию и разработке универсальной фильтрационно-хроматог-рафической технологии получения вирионных вакцин;
-
Разработке методов контроля технологического процесса очистки вирусных суспензий;
-
Разработке препаративного метода выделения гемагглютинина вируса гриппа;
-
Разработке технологии получения очищенной живой гриппозной вакцины (ОЖГВ) для интраназального применения.
При выполнении работы основное внимание уделялось экспериментальным исследованиям процессов выделения, очистки и анализа вирусов и вирусных белков мембранными, хроматографическими и электрофоре -ческими методами.
Впервые предложены новые безасбестовые фильтровальные материалы для осветления вируссодержащих суспензий - стекловолоконные и базальтоволоконные фильтры, обладающие высокими технологическими качествами.
Впервые установлено, что повышение гемагглютинирующей и инфекционной активности ингибиторочувствительных вирусов при различных способах очистки связано с удалением неспецифических ингибиторов ге-магглютинации.
Разработаны методики микро- и диафильтрации для концентрирования и очистки различных вирусов на мембранах различного типа и полых волокнах.
Впервые проведена оптимизация процесса очистки вирусов методом ЭЖХ на основе математической теории эксперимента, предложены для практики новые сорбенты на основе модифицированных макропористых кремнеземов (МПК), превосходящих промышленый образец.
Впервые исследованы сравнительные возможности различных хроматографических методов очистки вирусов ЭЖХ на МПК, биоспецифической, распределительной жидкостной хроматографии.
Впервые на основе комплексных исследований разработана универсальная фильтрационно-хроматографическая технология получения ИГВ. Новая технология позволяет получить препарат со стабильными технико-экономическими показателями, независимо от используемых штаммов вируса гриппа, применима для очистки и других вирусов. Разработаны вопросы аппаратурного оформления фильтрационно-хроматографической технологии получения ИГВ.
Впервые разработана методика потенциометрического иммунофильт-рационного анализа вирусных антигенов.
Впервые разработаны методы аналитического и препаративного выде-
ления вируса гриппа основных серотипов с помощью ИЭФ в борат-поли-ольных системах.
Впервые в условиях микрогравитации показана возможность выделения гидрофобных вирусных белков методами электрофореза, пригодных для получения ангисывороток (на примере НА вируса гриппа).
Впервые введено теоретическое положение о новой физико-химической характеристике вирионов - гидрофобности вирусной частицы и показано различие по этой характеристике для различных штаммов вируса гриппа.
Впервые установлена зависимость между гидрофобностью вирусных часіиц и иа иммуНОГСііНйсТшС.
Впервые высказано предположение о наличия гидрофобных аон'нОпйзй рецепторной щели молекулы НА вируса гриппа.
Впервые на основе комплексного исследования вопросов очистки и выделения вирусов с учетом их биологических свойств и характера иммунного ответа на вакцинацию создана концепция "щадящей технологии" получения противогриппозных вакцин.
Впервые разработана технология получения очищенной живой гриппозной вакцины для взрослых.