Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1 Исторические и эпизоотологические данные 11
1.2 Морфология и устойчивость к физико-химическим факторам 12
1.3 Выделение вируса 13
1.4 Патогенез 14
1.5 Клинические признаки и патологические изменения 15
1.6 Иммунитет 17
1.7 Профилактика метапневмовирусной инфекции 20
1.8 Диагностика метапневмовирусной инфекции
1.8.1 Иммуноферментный анализ 25
1.8.2 Контроль качества исследований с использованием ИФА 29
1.9 Заключение по обзору литературы 31
2. Собственные исследования 32
2.1. Материалы и оборудование 32
2.1.1 Пробы патологического материала. 32
2.1.2. Штаммы микроорганизмов . 32
2.1.3 Иммуноспецифические компоненты. 32
2.1.4 Экспериментальные животные. 32
2.1.5 Культуры клеток и органов. 32
2.1.6 Питательные среды и антибиотики 32
2.1.7 Химические реагенты, растворы, буферные смеси. 33
2.1.8 Оборудование. 34
2.1.9 Расходные материалы 35
2.1.10 Коммерческие наборы 36
2.2 Методы исследований. 36
2.2.1Выделение вируса в трахеальной органной культуре. 36
2.2.2 Культивирование вируса в первично-трипсинизированной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур. 37
2.2.3 Электрофорез вирусных белков и иммуноблотинг 37
2.2.4 Определение титра инфекционной активности вируса в культуре клеток и органах 38
2.2.5 Непрямой твердофазный вариант ИФА 38
2.2.3. ОТ-ПЦР-РВ. 38
2.2.4. ОТ-ПЦР
2.2.5. Очистка продуктов ПЦР 39
2.2.6. Секвенирование. 39
2.2.7. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
2.2.11 Количественный анализ субпопуляций лимфоцитов 39
2.2.12 Определение продукции цитокинов. 40
2.2.13 Гистологическое исследование 40
2.2.14 Статистический анализ результатов. 40
3. Результаты собственных исследований 41
3.1Выделение изолятов 41
3.2 Разработка методики очистки и концентрирования МПВ птиц, получение иммуноспецифических компонентов для ИФА 43
3.3 Разработка тест-систем для оценки иммунного ответа кур при МПВИ 46
3.3.1 Разработка тест-системы ИФА для определения титра антител к МПВ птиц при тестировании сывороток в одном разведении 46
3.3.2 Разработка тест-систем ИФА по выявлению специфических к МПВ птиц иммуноглобулинов (Ig)А, IgМ и IgG в секреторных жидкостях кур 55
3.4 Изучение патогенеза и иммунного ответа восприимчивых цыплят на
экспериментальное заражение изолятами МПВ птиц 58
3.4.1 Изучение патогенеза и иммунного ответа цыплят на экспериментальное заражение изолятом aMPV/А/02/2014 58
3.4.2 Изучение патогенеза и иммунного ответа цыплят на экспериментальное заражение изолятом aMPV/B/12/2010 65
3.4.3 Изучение патогенеза и иммунного ответа цыплят на экспериментальное заражение изолятом aMPV/B/22/2010 71
3.5 Разработка набора 80
4. Обсуждение результатов исследований 87
5. Выводы 98
6. Практические предложения 100
7. Список использованной литературы
- Клинические признаки и патологические изменения
- Штаммы микроорганизмов
- Разработка тест-систем для оценки иммунного ответа кур при МПВИ
- Изучение патогенеза и иммунного ответа цыплят на экспериментальное заражение изолятом aMPV/B/22/2010
Введение к работе
1.1 Актуальность темы. Метапневмовирус птиц – РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Paramyxoviridae, род Metapneumovirus, вид Avian Metapneumovirus (aMPV). Впервые он был выявлен в 1978 году в Южной Африке [3]. На основании антигенных и генетических (по нуклеотидному составу гена белка прикрепления G) различий выделяют 4 подтипа вируса: А, В, С и D. Вирусы подтипов А и В были выявлены в Африке, Азии, Южной и Северной Америке, Европе, России. Подтип С был выделен от индеек с респираторными признаками болезни в США в 1996 г., а подтип D – во Франции и Корее. МПВ птиц является возбудителем контагиозного респираторного заболевания, которому в первую очередь подвержены индейки и куры, а также утки, гуси, фазаны, страусы, цесарки [2, 3].
У индеек заболевание характеризуется воспалительными процессами верхних дыхательных путей, у цыплят-бройлеров может вызывать синдром опухшей головы, у кур-несушек - снижение яичной продуктивности. МПВ птиц подтипа С поражает преимущественно индеек, а вирусы подтипов А и В могут инфицировать как индеек, так и кур. Экономический ущерб при МПВ инфекции обусловлен снижением прироста живой массы и яичной продуктивности, повышенной выбраковкой некондиционной птицы, затратами на ликвидацию болезни [1, 2, 3].
Для данной инфекции характерен горизонтальный путь распространения, при этом уровень смертности не превышает 2-5%, но при ассоциации с другими бактериальными и вирусными патогенами заболевание протекает в более тяжёлой форме с увеличением смертности до 25% [6, 10, 52]. МПВ птиц вызывает временное ухудшение гуморального и клеточно-опосредованного иммунитета во время острой фазы заболевания, когда клинические признаки наиболее выражены, тем самым увеличивая предрасположенность птиц к вторичным инфекциям [2, 3].
Репродуцируется МПВ птиц в тканях верхнего респираторного тракта птиц (носовых полостей, гортани, трахеи) и конъюнктивы в течение 7-10 суток после инфицирования [1, 3, 7].
В последние годы проводится изучение иммунологии промышленной птицы. В работах зарубежных авторов представлены результаты изучения
особенностей гуморального, клеточного и местного иммунитета при экспериментальном заражении кур и индеек выделенными на территории их стран изолятами МПВ [5, 7].
Поскольку МПВ птиц вызывает в основном локальную инфекцию верхних дыхательных путей, решающую роль играет местный и клеточный иммунный ответ [6, 7].
1.2 Степень разработанности проблемы. В РФ регистрируют
подтипы А и В МПВ птиц. Отечественные тест-системы ИФА (ФГБУ
«ВНИИЗЖ», ФГБУ «ВНИВИП») разработаны на основе антигена МПВ птиц
подтипа В (различных вакцинных штаммов). Среди зарубежных
коммерческих диагностических наборов (Svanova (Швеция), IDEXX (США)
и Biochek (Нидерланды), наибольшую чувствительность показывает набор
IDEXX (США) на основе комплексного антигена МПВ птиц подтипов А, В и
С. Поэтому, с учетом сложившейся эпизоотологической ситуации,
представляется актуальным разработать тест-систему на основе смешанного
антигена.
В работах отечественных исследователей [1, 2] представлены результаты по выделению изолятов МПВ птиц подтипа В, а также по изучению клинических признаков и патологоанатомических изменений при МПВИ у цыплят-бройлеров в условиях птицефабрики и при экспериментальном заражении. При этом выделение МПВ птиц подтипа А и изучение особенностей локального, гуморального и клеточного иммунного ответа при экспериментальном заражении восприимчивой птицы обоими подтипами не проводили.
1.3 Цели и задачи исследования. Целью нашей работы являлась
разработка тест–систем для оценки иммунного ответа кур при изучении
изолятов МПВ птиц подтипов А и В, выделенных на территории РФ. Для
достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
-
Выделить полевые изоляты МПВ птиц подтипов А и В для получения диагностических штаммов.
-
Оптимизировать и разработать методику очистки и концентрирования МПВ птиц, получить иммуноспецифические компоненты: препараты антигенов МПВ птиц подтипов А и В, вирусспецифическую контрольную сыворотку.
3. Для оценки гуморального иммунного ответа разработать
иммуноферментную тест-систему на основе комплексного антигена для
определения титра антител к МПВ птиц при тестировании сывороток крови
кур в одном разведении.
-
Для оценки локального иммунного ответа разработать иммуноферментную тест-систему для выявления специфических к МПВ птиц иммуноглобулинов (Ig) А, Ig М и IgG в секреторных жидкостях кур.
-
Изучить патогенез и иммунный ответ при экспериментальном заражении цыплят бройлеров выделенными изолятами МПВ птиц подтипов А и В.
6. Разработать комплект НТД на изготовление набора для определения
антител к метапневмовирусу птиц иммуноферментным методом при
тестировании сывороток в одном разведении.
1.4 Научная новизна исследований:
Выделены и охарактеризованы полевые изоляты МПВ подтипов А и В.
Оптимизированы условия и разработаны методические рекомендации для получения очищенного и концентрированного антигена МПВ.
Разработана иммуноферментная тест-система для определения антител к МПВ на основе комплекса антигенов МПВ подтипов А и В.
Впервые разработан метод ИФА для выявления специфических к метапневмовирусу иммуноглобулинов (Ig) А, Ig М и Ig G в секреторных жидкостях кур.
Впервые проведена комплексная оценка иммунного ответа цыплят-бройлеров на заражение полевыми изолятами МПВ подтипов А и В, выделенными на территории РФ.
1.5 Теоретическая и практическая значимость исследования.
1. Выделены и изучены изоляты МПВ птиц подтипов А и В;
2. Проведено депонирование использованных в работе двух
диагностических штаммов aMPV/A/02/2014 и aMPV/B/12/2010 в Коллекцию
штаммов микроорганизмов (КШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ»;
3. Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором
ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Методические рекомендации по очистке и
концентрированию метапневмовируса птиц», «Методические рекомендации
по определению титра антител к метапневмовирусу птиц
иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном
разведении», «Методические рекомендации по выявлению специфических к метапневмовирусу иммуноглобулинов (Ig) А, Ig М и Ig G в непрямом варианте иммуноферментного анализа»;
4. Результаты проведенных исследований послужили основой для составления следующих нормативных документов:
Инструкции по применению набора для определения антител к метапневмовирусу птиц иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении;
Стандарта ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Набор для определения антител к метапневмовирусу птиц иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении» (СТО 00495527-0239-2015);
- Промышленного регламента на производство набора для определения
антител к метапневмовирусу птиц иммуноферментным методом при
тестировании сывороток в одном разведении.
-
Методология и методы исследований. Методология проведенных исследований включает стандартные процедуры с использованием различных материалов и естественно-восприимчивых животных. В работе использовали молекулярно-биологические (ПЦР, секвенирование, анализ нуклеотидных последовательностей), вирусологические (вирусвыделение, культивирование, титрование вируса), физико-химические (составление растворов заданной молярности и оценка концентрации водородных ионов) и серологические (ИФА), гистологические методы исследований, а также метод проточной цитофлуориметрии.
-
Положения, выносимые на защиту:
а) результаты вирусвыделения из патологического материала в трахеальной
органной культуре и изучение биологических свойств, выделенных изолятов
МПВ птиц подтипов А и В;
б) получение иммуноспецифических компонентов иммуноферментных тест-
систем для выявления антител к МПВ птиц: диагностические штаммы МПВ
птиц подтипов А и В, препараты антигена и вирусспецифическая сыворотка;
в) результаты разработки иммуноферментной тест-системы для определения
титра антител к МПВ птиц при тестировании сывороток крови кур в одном
разведении;
г) результаты разработки иммуноферментной тест-системы для выявления
специфических к МПВ птиц иммуноглобулинов (Ig) А, Ig М и Ig в
секреторных жидкостях кур;
д) результаты изучения патогенеза и параметров гуморального, локального и
клеточного иммунного ответа при экспериментальном заражении цыплят
бройлеров выделенными изолятами МПВ птиц подтипов А и В.
-
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. В ходе выполнения работы практическую и консультативную помощь оказывали к.б.н. Волкова М.А., к.б.н. Никонова З.Б. а также сотрудники референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ» за что автор выражает им искреннюю благодарность.
-
Степень достоверности и апробации результатов. Достоверность всех наиболее важных экспериментальных показателей подтверждена соответствующими статистическими критериями. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2011-2015 гг.), II Международной научно-практической конференции молодых ученых «Инновационное развитие науки в обеспечении биологической безопасности» (Казахстан, 2014 г.), III Всероссийской студенческой научной конференции «В мире научных открытий» (Ульяновск, 2014 г.), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы контроля инфекционных болезней животных» (Покров, 2014 г.). Достоверность результатов исследований подтверждена комиссионными испытаниями.
1.10 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127
страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы,
собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения
и список литературы, который состоит из 177 источников, в том числе 165
зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 21 рисунком и
дополнена 8 приложениями.
Клинические признаки и патологические изменения
Метапневмовирус птиц - это оболочечный сложноорганизованный вирус, имеющий несегментированный негативный РНК геном, относящийся к роду Metapneumovirus из семейства Paramyxoviridae [2, 65, 159, 165].
Вирионы бывают сферической (размером от 150 до 200 нм) и нитевидной (до 400 нм) формы, сверху покрыты липопротеиновой оболочкой, образующейся из плазматической мембраны клетки-хозяина. Геном содержит около 13000 нуклеотидов и состоит из 8 генов: нуклеопротеин (N), фосфопротеин (P), матриксный белок (М), гликопротеин слияния (F), второй матриксный белок (М2), малый гидрофобный белок (SH), гликопротеин прикрепления (G) и РНК-зависимая РНК-полимераза (L) [57, 65, 83].
Нуклеопротеин (N) обеспечивает спиральную структуру РНК-генома, имеет молекулярную массу около 50000 Да. Фосфопротеин (P) участвует в репликации и транскрипции, имеет молекулярную массу 40000-60000 Да. Матриксный белок (М), массой 2500-3000 Да, связывается с липидной мембраной клеток-мишеней. Гликопротеин слияния (F), массой 1617 Да, образует многоклеточные синцитии в клетке-хозяине [126]. Второй матриксный белок (М2) участвует в синтезе РНК вируса [146, 161].
Малый гидрофобный белок (SH) участвует в прикреплении и сборке вириона. Гликопротеин прикрепления (G) обеспечивает антигенное разнообразие в пределах генетически однородной популяции вируса. L-белок является основным компонентом вирусной РНК и участвует в ее синтезе [6, 99].
МПВ активен в пределах рН 4,5 –9. Вирус неустойчив к действию высоких температур, так при воздействии температуры 37 С в течении 24 часов титр инфекционности понижается до 1 ТЦД50/мл, а через 72 часа вирус полностью инактивируется. Сам вирус при температуре 50 С разрушается через 6 часов. При 20 С инфекционная активность снижается за 4 недели, при 4 С - через 20 недель, а при минус 20 С и минус 70 С не снижается до 58 недель. Вирус выдерживает до 12 циклов замораживания-оттаивания без снижения вирулентности [138].
Большинство стандартных дезинфицирующих растворов при температуре 20 С в течение 10 мин полностью не разрушают вирус, кроме органических растворителей, таких как хлороформ и этиловый спирт в концентрации 30-40% [182].
В настоящее время МПВИ проявляется эндемично и может поражать каждое новое пополнение поголовья даже в предварительно очищенных и продезинфицированных птичниках, и особенно в областях интенсивного птицеводства [12].
Выделение МПВ птиц из полевых проб с использованием общепринятых методов является трудоемким и длительным процессом, кроме того, показано, что выделять вирус от цыплят сложнее, чем от индеек.
Трудности при выделении обусловлены очень коротким периодом накопления вируса в высоких титрах в органах птицы (3-5 дней), что обуславливает необходимость вирусовыделения в момент первого проявления клинических признаков [8, 186].
Первичное выделение МПВ птиц из полевых образцов проводят в трахеальной органной культуре (ТОК) кур или индеек, а также в куриных эмбрионах [26, 106, 135, 144, 176]. После выделения в одной из этих двух систем вирус можно адаптировать к росту в клетках фибробластов эмбрионов кур, печени куриных эмбрионов или в культуре клеток Vero [21, 54, 156, 187]. МПВ птиц подтипа С после первичного выделения размножался в других клеточных системах: BGM (почки зеленой африканской мартышки), MA-104 (почки эмбрионов макаки), QT-35 (фибробласты японского перепела), BHK-21 (почка новорожденного хомячка), в первичных клетках носовой раковины и почек индейки или в первичных клетках почки кур [160]. Хотя для первичного выделения редко используют культуры клеток, описаны успешные случаи применения фибробластов куриных эмбрионов (ФЭК) и культуры клеток QT-35 для выделения МПВ птиц в США [173].
В зарубежной литературе описаны эксперименты по выделению МПВ птиц. Было показано что культуры клеток CER (смесь клеток ФЭК и BHK-21), Vero и BHK-21 позволяли нарабатывать МПВ птиц в высоких титрах инфекционной активности. Описана возможность размножения подтипов А и В в КК ФЭК и в ТОК после первичного выделения и нескольких пассажей вируса в линии клеток CER. Оба подтипа накапливались в высоких титрах в клетках CER в течении первых 30 часов после заражения, но не наблюдалось значительной разницы от результатов, полученных на клетках Vero [160].
Метапневмовирусная инфекция протекает остро, подостро и бессимптомно, возможно и хроническое течение. Инкубационный период продолжается обычно от 4 до 7 дней, заболевание контагиозно, быстро передается от больных цыплят к восприимчивым, и уже через 2-3 дня инфекция охватывает весь зал птичника [46, 54, 154].
МПВ птиц подтипа С вызывает ринотрахеит индеек - острую инфекцию дыхательных путей у индеек всех возрастов [170]. МПВ птиц подтипов А и В вызывает «синдром опухшей головы» (SHS) бройлеров с 4-х до 6-недельного возраста [63, 66, 70].
К МПВ птиц восприимчивы клетки ворсинчатого эпителия носовой полости и трахеи, что приводит к разрушению и потере ворсинок [155, 164]. Репродукция вируса в восприимчивых органах птиц и плохой микроклимат, насыщенный бактериями, как предрасполагающий фактор, способствуют параллельному проникновению бактерий в слизистую эпителия. Вследствие этого развивается отек подкожной соединительной ткани головы (синдром опухшей головы). Многочисленные исследования указывают на этиологическую роль бактерий в “синдроме опухшей головы” у индюшат и цыплят – бройлеров: Morganella morganii, Proteus mirabilis и Cyptosporidium baileyi, но в первую очередь Escherichia coli. Сильные цилиостатические свойства МПВ делает птиц подверженными респираторным заболеваниям, вызываемыми другими патогенами такими, как Mycoplasma gallisepticum и Ornithobacterium rhinotracheale, которые действуют синергетически. Инфекционный бронхит кур препятствует размножению МПВ птиц, а также замедляет образование антител к этому вирусу, т.к. обладает способностью гораздо быстрее размножаться в верхних дыхательных путях. Другие вирусные инфекции, такие как герпес индеек, ньюкаслская болезни птиц, Болезнь Марека и пр. приводят к более тяжёлой форме заболевания с увеличением смертности до 25% [30, 85, 93, 123, 141, 149, 150, 151, 152, 174, 183].
Штаммы микроорганизмов
При разработке тест-систем на основе непрямого варианта ИФА необходимо использовать высокоочищенные концентрированные препараты антигена [19]. Учитывая структурные особенности вириона МПВ птиц, для очистки и концентрирования не рекомендуется использование органических растворителей. Центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы – простой и эффективный способ получения вирусных антигенов с высокой степенью очистки.
Для получения препаратов антигена использовали инактивированную аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) культуральную жидкость (вируссодержащая суспензия) КК ФЭК, заражённых метапневмовирусом птиц штаммов aMPV/B/12/2010 и aMPV/А/02/2014. Вируссодержащую суспензию подвергали двум циклам замораживания-оттаивания. Затем осветляли при 4330 g 25 минут. Вирус сначала осаждали при 125300 g в течение 80 мин, затем осадок ресуспендировали в ФБР в соотношении 10:1. Затем центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы (30%-55%) при 125300 g в течение 60 минут. Фракцию, содержащую очищенный вирус, отбирали и разбавляли ФБР в соотношении 1:3 и вновь осаждали в течение 2 ч при 125300 g. Полученный осадок ресуспендировали в ФБР в соотношении 100:1 от начального объема.
Таким методом были получены препараты антигена МПВ птиц подтипов А и В. Степень очистки концентрированных препаратов МПВ птиц проверяли методом электрофореза в 10% полиакриламидном геле и иммуноблоттинга (рис. 3 и 4).
При иммуноблотинге белков (рис. 4) очищенного и концентрированного препарата МПВ птиц со специфическими сыворотками крови кролика и кур идентифицировали гомологичные вирусные белки, соответствующие метапневмовирусу птиц. Нормальные сыворотки крови кур и кролика не связывались с вирусными белками.
Специфическую активность полученных препаратов антигенов МПВ птиц подтипов А и В определяли в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием специфических к МПВ птиц и гетерологичных сывороток крови. В качестве антигена для сенсибилизации планшетов использовали смесь препаратов МПВ птиц подтипов А и В, взятых в рабочем разведении. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Для получения гипериммунной сыворотки проводили двукратную иммунизацию 40-суточных кур-несушек смесью очищенных концентрированных инактивированных препаратов МПВ птиц подтипов А и В в общем объеме 0,5 см3 антигена, с содержанием вирусного белка 0,5 мг/мл, эмульгированным с 0,5 см3 адъюванта ISA-70. Активность вирусспецифической сыворотки в ИФА составляла не менее 1:6400. 3.3 Разработка тест-систем для оценки иммунного ответа кур при метапневмовирусной инфекции.
Для максимального выявления в ИФА антител к обоим подтипам МПВ птиц: А и В сенсибилизацию планшетов проводили одновременно двумя антигенами. Оптимальное количество вирусного белка каждого из двух антигенов, необходимое для иммобилизации в лунки планшета, предварительно определяли в непрямом варианте ИФА. В качестве рабочего определили количество белка, равное 0,5 мкг/0,05 мл для каждого антигена. Для сенсибилизации планшетов использовали различные количественные комбинации. Данные представлены в таблице 2.
Для определения формулы расчёта титра антител к МВП птиц при тестировании в одном разведении сывороток было исследовано в непрямом варианте ИФА в трёх повторностях 77 сывороток с различным уровнем антител. Измерение оптической плотности проводили при 405 нм. Результаты представлены в таблице 3.
При постановке реакции ИФА по одному разведению необходимо было определить допустимые величины оптической плотности для контрольных положительных и отрицательных сывороток. Для определения данной величины были проанализированы соответствующие значения оптической плотности положительной (РСХ) и отрицательной (NCX) контрольных сывороток, исследованных в разведении 1:400. По данным величинам вычисляли разницу между РСХ и NCX (РСХ - NCX). В таблице 4 представлены соответствующие данные измерений оптической плотности. Таблица 4 - Результаты измерения оптической плотности положительного (РСХ) и отрицательного (NСХ) контролей
Данные, представленные в таблице 4, показывают, что допустимые значения оптической плотности контрольных сывороток должны быть следующие: для отрицательного контроля не выше 0,200, для положительного контроля не ниже 0,600, минимальная разница оптической плотности положительного и отрицательного контролей не меньше 0,45.
Определение позитивно-негативного порога Для объективной оценки иммунного ответа необходимо было установить позитивно - негативный порог (ПНП). 90 сывороток крови от клинически здоровых цыплят 20-50 суточного возраста, не вакцинированных против МПВ инфекции (показавших отрицательный результат при тестировании набором Idexx, США), исследовали в трёх повторностях в различные дни. В качестве положительного и отрицательного контроля были взяты стандартные контрольные сыворотки. ПНП определяли путем расчета средних значений S/P отрицательных сывороток для разведения 1:400 и стандартного отклонения. Получили среднее значение S/P отрицательных сывороток равное 0,067 и стандартное отклонение - 0,0322. Сумма среднего значения S/P и двух стандартных отклонений определяет верхнюю границу отрицательных значений, а сумма среднего значения S/P и трёх стандартных отклонение - нижнюю границу положительных значений. lgTотр.= 3.899+1.823 lg(0.067+0.0644) Тотр = 196 lgTпол.= 3.899+1.823 lg(0.067+0.0966) Тпол. = 292 С учётом того, что ошибка метода находится в пределах одного разведения, т.е. Т/2 Т 2Т, пороговые значения титров антител, полученные на основе статистического анализа: если величина Т 1:196 , то результат отрицательный; если величина 1:196 Т 1:392 , то результат сомнительный; если величина Т 1:392 , то результат положительный. В случае, когда качественную сторону результатов реакции определяют по значению величины (S/P), то получаем: для отрицательного результата (S/P) 0.1314, для положительного результата (S/P) 0.1922, для сомнительного результата 0.1314 (S/P) 0.1922.
Разработка тест-систем для оценки иммунного ответа кур при МПВИ
Разработать комплект НТД на изготовление набора для определения антител к метапневмовирусу птиц иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении.
Проведем краткий анализ и сравним результаты собственных исследований с опубликованными данными других авторов.
Выделение полевых изолятов МПВ птиц подтипов А и В для получения диагностических штаммов.
С учетом сложившейся эпизоотологической ситуации на территории РФ по МПВ птиц, актуальным направлением исследований является изучение патогенеза и иммунных реакций вызываемых изолятами подтипов А и В.
Для выделения изолятов МПВ птиц подтипов А и В успешно применяют ТОК, с последующим накоплением вируса в различных клеточных линиях [8, 160].
Выделение изолятов проводили на ТОК в течение 3 пассажей, затем с целью накопления вируса проводили 6 последовательных пассажей в первично-трипсинизированной КК ФЭК. После каждого пассажа определяли титр инфекционной активности вируса. Наибольшее накопление МПВ птиц подтипа А выявляли с 3 пассажа, подтипа В – с 5 пассажа. Изолят МПВ птиц aMPV/А/02/2014 в результате сравнительного анализа был идентифицирован как штамм МПВ птиц подтипа А с отличиями на 0,1- 1,3% в нуклеотидных последовательностях фрагмента гена G от других штаммов и изолятов этого подтипа. Изолят aMPV/B/12/2010 был идентифицирован как штамм МПВ птиц подтипа В с отличиями в нуклеотидных последовательностях фрагмента гена G от других штаммов и изолятов МПВ птиц с 0,9 до 3,4%. Полученные штаммы МПВ птиц были депонированы в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» в качестве диагностических.
В отечественной и зарубежной литературе описаны опыты по выделению МПВ птиц на ТОК и его последующей адаптацией к росту на различных клеточных линиях, в том числе в КК ФЭК, позволяющей получить материал с высоким титром инфекционной активности [2, 10, 62].
Разработка методики очистки и концентрирования МПВ птиц, получение иммуноспецифических компонентов. При разработке тест-систем на основе непрямого варианта ИФА необходимо использовать высокоочищенные концентрированные препараты антигена [19]. Учитывая структурные особенности вириона МПВ птиц, для очистки и концентрирования не рекомендуется использование органических растворителей. Центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы – простой и эффективный способ получения вирусных антигенов с высокой степенью очистки [130].
Для получения препарата антигена была разработана методика очистки и концентрирования МПВ птиц. В результате ультрацентрифугирования инактивированной аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) вируссодержащей суспензии в градиенте концентрации сахарозы были получены препараты антигена МПВ птиц подтипов А и В. Степень очистки концентрированных препаратов МПВ птиц проверяли методом электрофореза в 10% полиакриламидном геле. Полученный спектр вирусных белков и значения молекулярного веса соответствовало данным литературы [130]. Концентрация белка после очистки и концентрирования, определённая по методу Бредфорд, составила 0,5 мг/мл. Специфическая активность препаратов антигена подтверждена методом иммуноблоттинга с референтными сыворотками к МПВ птиц.
Для получения гипериммунной сыворотки проводили двукратную иммунизацию 40-суточных кур-несушек смесью очищенных концентрированных инактивированных препаратов МПВ птиц подтипов А и В в объеме 0,5 см3 антигена, с содержанием вирусного белка 0,5 мг/мл, эмульгированным с 0,5 см3 адъюванта ISA-70. Активность полученной вирусспецифической сыворотки составляла не менее 1:6400 в непрямом варианте ИФА. Для определения оптимальной концентрации каждого антигена, вносимого в лунки планшета, сравнивали различные варианты комбинации антигенов. Оптимальное количество вирусного белка, необходимого для сенсибилизации планшетов антигенами подтипов А и В, предварительно определяли в непрямом варианте ИФА. В качестве оптимальной комбинации антигенов было выбрано: 0,5мкг/0,05мл МПВ А+0,5мкг/0,05мл МПВ В.
Разработка иммуноферментной тест-системы на основе комплексного антигена для определения титра антител к МПВ птиц при тестировании сывороток крови кур в одном разведении.
При МПВИ клинические признаки и патологоанатомические изменения непатогномичны, поэтому основная роль в постановке диагноза принадлежит лабораторным методам, особенно ИФА, который является одним из чувствительных и специфичных методов исследования. На мировом рынке известны несколько коммерческих наборов ИФА для выявления антител к метапневмовирусу птиц - IDEXX (США), Biochek (Нидерланды), Svanova (Швеция), ФГБУ «ВНИИЗЖ» (Россия) и др. с применением компьютерных программ учета и обработки данных [20, 136]. Перечисленные тест-системы могут значительно отличаться по целому ряду параметров, что в первую очередь зависит от антигенных свойств производственного штамма вируса, используемого для получения антигена для ИФА. Разработку тест-системы осуществляли с учетом эпизоотологической ситуации на территории России и стран ближнего зарубежья.
Изучение патогенеза и иммунного ответа цыплят на экспериментальное заражение изолятом aMPV/B/22/2010
Схожие клинические признаки и гистопатологические изменения были отмечены также другими исследователями при экспериментальном заражении цыплят [28, 94, 95, 96, 116, 162].
Геном МПВП подтипа А выявляли в ОТ-ПЦР-РВ на 1, 3 и 7 сутки лишь в тканях носовой полости и в трахее, тогда как геном МПВ птиц подтипа В выявляли со 2 по 12 сутки в ротоглоточных смывах, трахее, тканях носовых полостей, инфраорбитальных синусах и гардеровой железе. У контактных птиц геном вируса обнаруживали в более поздние сроки с 5 по 20 сутки в ротоглоточных смывах, тканях носовых полостей, трахее и лёгких, что подтверждает горизонтальную передачу вируса при соместном содержании инфицированных и здоровых птиц. Во всех экспериментах в контрольной группе геном МПВ птиц не выявляли.
Период выявления генома вируса в соответствующих тканях методом ПЦР, регистрируемый в наших экспериментах, совпадал со временем наблюдения наибольших патологических изменений этих органов и проявлением клинических признаков инфекции, что было отмечены также другими исследователями [28, 94, 95, 96, 116, 162].
Исследования, проведённые рядом зарубежных учёных, показали, что выработка гуморальных антител при МПВ инфекции коррелировала с процессом очищения от вируса и прекращением клинических признаков. Так при окулоназальном инфицировании 16-суточных цыплят-бройлеров двумя вирулентными изолятами подтипов А и В выработку специфических антител регистрировали в реакции нейтрализации, начиная с 6 сут. и в ИФА с 10 сут. после заражения [162].
Пик выработки антител наблюдали через 24-28 сут. после заражения. Это подтверждает наши данные о динамике выявления гуморальных антител у цыплят после их заражения изолятами МПВ подтипа В. Напротив, у цыплят, инфицированных изолятом МПВ птиц подтипа А, выявлены низкие титры специфических антител. Аналогично, J. Kwon et. al. (2010) было показано, что у 31-суточных цыплят-бройлеров, инфицированных изолятом МПВ птиц подтипа А, был очень низкий уровень специфических антител в крови. У цыплят неинфицированной группы специфические антитела в крови не выявляли.
При исследовании местного иммунного ответа в ротоглоточных смывах у цыплят, зараженных МПВ птиц подтипа А, пик выработки специфических антител классов А и М регистрировали на 14 сутки, а пик выработки антител класса G – на 21 сутки. При исследовании местного иммунного ответа у цыплят, зараженных изолятом aMPV/В/22/2010 МПВ птиц подтипа В, пик выработки специфических антител регистрировали в более ранние сроки: антитела классов А и М выявляли уже начиная с 7 суток, антитела класса G – с 14 суток после заражения. Rautenschlein et al. (2011) также показали, что местный антительный ответ (трахеальные смывы) развивается в более ранние сроки, чем системный, и регистрируется в течение более короткого промежутка времени (2 недели).
При исследовании слезной жидкости от цыплят, зараженных МПВ птиц подтипа А, специфические антитела классов А и М в наиболее высоких титрах выявляли на 14 сутки. У цыплят, зараженных МПВ птиц подтипа В, специфические антитела класса А выявляли в низких титрах, незначительно отличающихся от контрольной группы, антитела класса М в наиболее высоких титрах регистрировали на 7 сутки. Пик выработки антител класса G отмечали одинаково для подтипов А и В на 21 сутки.
У цыплят контрольной группы специфические антитела к МПВ птиц в ротоглоточных смывах и слёзной жидкости не обнаруживали.
При экспериментальном заражении МПВ подтипа А через сутки после заражения регистрировали увеличенный уровень Т-хелперов (CD4) в крови и увеличенный объем цитотоксических клеток в тимусе инфицированных цыплят по сравнению с неинфицированным контролем. В бурсе инфицированных цыплят отмечали статистически значимое уменьшение относительного количества В-лимфоцитов (Bu1a), по сравнению с незараженными цыплятами через 1, 10 и 21 сутки после заражения, и увеличение относительного количества Т-лимфоцитов с 3 по 10 сутки после заражения.
Изолят aMPV/В/22/2010 МПВ птиц подтипа В вызывал увеличение относительного количества цитотоксических лимфоцитов (CD8) в крови и селезенке зараженных цыплят по сравнению с неинфицированными, в бурсе отмечали снижение общего объема В-лимфоцитов (Bu1a) на 12 сутки после заражения. При заражении изолятом aMPV/В/12/2010 регистрировали супрессию иммунного ответа, которая выражалась уменьшением в 2-3 раза относительного количества Т-хелперов в крови инфицированных цыплят по сравнению с контрольными со 2 по 8 сутки после заражения.
При определении продукции IFN- в супернатанте активированных Кон А лимфоцитов селезёнки у цыплят, заражённых МПВ птиц подтипа А, регистрировали увеличение продукции IFN- на 14 сутки после инфицирования и затем ее снижение на 21 сутки; у цыплят зараженных МПВ птиц подтипа В увеличение уровня продукции IFN- отмечали в более поздние сроки через 20 суток после инфицирования.
Полученные результаты согласуются с результатами зарубежных исследователей. Так, в своей работе Rubbenstroth et al. (2010) показали, что Т-лимфоциты играют важную роль в начальной стадии МПВ инфекции и в процессе очищения от вируса. Различные подтипы МПВ птиц стимулировали аккумуляцию CD4+ и CD8+ Т-клеток в Гардеровых железах инфицированных индеек и повышенную регуляцию уровней транскрипции интерферона- в носовых ходах и Гардеровой железе [162]. Также наблюдали увеличение уровня интерферона- (ИФА) в спленоцитах заражённых цыплят после их стимуляции конкавалином А с 3 по 11 сутки после заражения в отличие от неинфицированных цыплят.
Таким образом, при изучении выделенных отечественных изолятов МПВ птиц подтипов А и В с помощью разработанных методов была проведена оценка гуморального, локального и клеточного иммунного ответа цыплят-бройлеров.
Одним из основных дальнейших направлений разработки данной темы является выделение и комплексное изучение новых изолятов МПВ птиц на территории РФ. Вторым аспектом является применение разработанных методов для комплексной оценки иммунного ответа кур при применении живых вакцин при МПВИ, что является актуальным при разработке и апробации новых вакцинных препаратов.