Разработка и применение экспериментальных и промышленных иммуноферментных тест-систем для лабораторной диагностики вирусных инфекций Иванов, Александр Петрович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Совершенствование лабораторной диагностики вирусных инфекций - одна из основных методических проблем вирусологии, представляющая собой самостоятельную область исследовательской практики. В представительном арсенале методов, используемых в вирусологии, иммунофер-ментный анализ (ИФА) занимает особое место. Несмотря на то, что его история насчитывает уже более 20 лет, интерес к данной проблеме не убывает. Об этом свидетельствует стабильный поток публикаций, руководств, монографий и т. д., посвященных разработкам ИФА-тест-систем для биомедицинских исследований, включая вирусологические. Согласно современной статистики (США и Европа), на долю ИФА приходится 60 % всех проводимых иммуноанализов; на радиоиммунный метод - 25 %, на иммунофлуоресцентный и прочие методы - 15 %. (S.S. Deshpande, 1996).

Поскольку иммуноаиализ - это "применение реакции антигена с антителом для определения концентрации одного из этих реагентов в растворе", то, очевидно, что разнообразие антигенов и антител определяет и разнообразие систем иммукоанализа. Это предполагает единственно возможный путь - создание конкретных систем регистрации вирусспецифических антигенов и антител, отсутствующих в методическом арсенале. При этом каждая новая ИФА-система является не просто очередной реализацией хорошо известного принципа (принципа ИФА). Для реализации общего принципа при конструировании определённой тест-системы необходим конкретный подход с учётом специфических особенностей её активных компонентов (антигенов или антител), области и способов её применения. Каждый вариант ИФА требует основательного экспериментального анализа и разработки определенных алгоритмов, на базе которых уже можно конструи-

ровать конкретные тест-системы. Все это - реальные проблемы, от решения которых зависит эффективность (специфичность, чувствительность, информативность и т.д.) лабораторной диагностики вирусных инфекций.

К началу нашей работы (к концу 70-х годов) ИФА только входил в практику вирусологических исследований, и фактически мы имели в своём распоряжении лишь принцип и ограниченное количество вариантов метода. На протяжении ряда лет возможности, заложенные в принципе ИФА, использовалисв ^^ч^еко не полностью. Спектр вирусных инфекций, в лабораторной диагностике которых применялся ИФА, был невелик, и в него не входили вирусы, имеющие актуальную значимость в патологии человека (например, некоторые арена- и буниавирусы, такие как вирусы Ласса, Мачупо, Хунин, лимфоцитарного хориомеаингита - ЛХМ, Крымской-Конго геморрагической лихорадки - КГЛ-Конго, хантавирусы). Не были разработаны более эффективные подходы адаптации ИФА для эпидемиологических и серологических исследований, а в эпизоотологических исследованиях ИФА вообще не применялся. Всё это существенно ограничивало дальнейшие исследования в актуальнейших областях инфекционной патологии человека. К началу данной работы в ещё редких публикациях, посвященных применению ИФА в медицинской вирусологии, вопросы разработки оптимальных параметров метода освещались очень скупо, либо вообще не были представлены. Поэтому реально существовала проблема оптимизации, стандартизации и адаптации ИФА с целью создания эффективной методической основы для решения широкого круга актуальных исследовательских задач. Кроме того, объективная необходимость требовала качественно нового уровня исследований, который был невозможен на традиционной методическоіі основе (прежде всего, определение вирусспецнфнческих антигенов в грубых суспензиях органов диких животных при изучении вирусных зоонозных инфекций - широкий эпизоотологический скрининг). Особую значи-

мость представляло использование ИФА для лабораторной диагностики инфекций, вызываемых высокопатогенными вирусами семейств Arenaviridac и Bunyaviridae. Разработка новой методической основы позволила бы решать не только прикладные задачи (собственно лабораторная диагностика вирусных инфекций, например, серологическая диагностика), но и задачи более фундаментальные - как-то выяснение вопросов механизма циркуляции и распространения ряда вирусов-возбудителей инфекций человека в природных очагах. Разработка и успешная апробация нового лабораторного метода (комплекса методов) предполагает логическое завершение - внедрение метода в исследовательскую и диагностическую практику, то есть, чтобы метод стал доступным для пользователей различного уровня.

Цель и задачи исследований. Исходя из вышеизложенного, целью исследований является создание ИФА-тест-систем для лабораторной диагностики вирусных инфекций, имеющих актуальную значимость в патологии человека, и внедрение их в исследовательскую практику и в практику здравоохранения как более эффективной методической основы. Достижение этих целей предусматривает решение следующих задач:

1. Разработка принципов и оптимизация различных вариантов ИФА для определения вирусных антигенов и противовирусных антител.

2. Разработка экспериментальных ИФА-тест-систем, применение и оценка их эффективное в конкретных исследованиях.

3. Разработка технологии промышленного производства ИФА-тест-систем, пригодных для широкого крута пользователей.

Научная новизна работы. Впервые в вирусологической практике разработан комплекс вариантов ИФА для лабораторной диагностики инфекций, вызываемых вирусами семейств Arenaviridae : высокопатогенные вирусы Пасса, Мачупо, Ху-

нин, а также вирусы лимфоцитарного хориоменингита (ЛХМ), Амаиари, Такари-бе, Тамиами, и Bunyaviridae: вирус Крымской - Конго геморрагической лихорадки (КГЛ-Конго) и хантавирусы - возбудители геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Разработка и применение ИФА для определения вирусных антигенов и антител подняли исследования на новый уровень и создали основы нетрадиционных подходов к изучению этих патогенов. На основе ИФА создан качественно новый методический подход к изучению вирусных инфекций - система ИФА-скришшга природных образцов (определение вирусных антигенов в суспензиях органов диких животных), позволившая проводить широкие и информативные исследования (разведка и мониторинг природных очагов, определение видового состава животных-носителей зоонозных вирусных инфекций, изучение эпизоотических процессов в природных очагах, а также контроль лабораторных животных в питомниках). С помощью ИФА-скрининга впервые получены прямые доказательства наличия природных очагов лихорадки Ласса на территории Гвинейской Республики, а также очагов ЛХМ на территории Краснодарского края и Грузии. Впервые на основе ИФА разработана серологическая диагностика нейро-инфекций, ассоциированных с вирусом ЛХМ. Впервые получены данные о распространении ряда патогенных вирусов на территории Гвинеи (вирусы гепатитов А и В, Чикунгунья). На основе поликлонального IgG к нуклеокапсидному белку хантавируса Пумала (N-белок - иммунодоминантный антиген хантавирусов) впервые сконструирована родоспецифическая ИФА-снстема для определения антигенов известных хантавирусов (минимум 10-ти, включая патогенные - Пумала, Хап-тан, Сеул, Добрава, Син Номбрэ). С помощью этой системы проведены широкие эпизоотологические исследования, впервые позволившие определить іраншдьі ареала хантавирусов на территории бывшего СССР (в странах бывшего СССР, Бельгии, Германии, Словакии, Чехии, Швеции). Разработанная типоспецифиче-

ская ИФА-система для определения хантавируса Пумала (на основе моноклоналъ-ных антител) впервые позволила проводить титрование хантавирусных антигенов в ИФА-позитивных образцах, что расширило возможности ИФА-скршшнга. Разработаны первые ИФА-системы для определения антител (IgM и IgG) к ханта-вирусам (серологическая диагностика ГЛПС), позволившие изучить вопросы формирования гуморального иммунитета у больных ГЛПС. Наряду с этими системами разработана принципиально новая система определения IgM к вирусу Пумала с использованием в качестве биозонда биотинилированного рекомбинантного антигена (N-бе.тка) вируса Пумала. Впервые для лабораторной диагностики хантавирусных инфекций (определение антигенов и антител) разработаны атьтернативные варианты ИФА с использованием в качестве твёрдой фазы мембранных фильтров (дот-блот ИФА), предназначенные для неспециализированных лабораторий и для экспедиционных условий (скрининг диких животных).

Практическая значимость работы . На основе подученных данных разработаны технологии экспериментального изготовления иммуноферментных тест-систем для лабораторной диагностики арена- и буниавнрусных инфекций (вирус КГЛ-Конго и хантасирусы) и промышленного производства коммерческой им-муноферментной тест-системы "ХАНТАПІОСТ" для определения антигенов хан-тавирусов - возбудителей ГЛПС. Широкое практическое применение ИФА для определения инфицнрованности мелких млекопитающих хантавирусами открыло возможность оценки степени активности природных очагов (мониторинга) и своевременного проведения соответствующих противоэпидемических мероприятий. Применение ИФА для определения антител к вирусу ЛХМ и хантавирусам в сыворотках крови больных людей значительно повысило эффективность клинической диагностики. Результаты обследования в ИФА материалов от лабораторных животных из питомников свидетельствуют о возможности эффективного использо-

вания разработанных нами ИФА-систем для контроля контаминации вирусом ЛХМ и хантавирусами лабораторных животных и проведения соответствующих мероприятий, направленных на предотвращение распространения инфекций в питомниках.

Разработаны и утверждены следующие нормативно-технические документы:

4. Инструкция по изготовлению, контролю и применению диагностикума лимфо-цитарного хориомсиингита, иммуноглобулниового пероксидазного сухого (протоколы 1 заседанияКВС МЗ СССР от 9. 02. 1983 г.).

5. Инструкция по изготовлению, контролю и применению диагностикума геморрагической лихорадки с почечным синдромом, иммуноглобулниового пероксидазного сухого (протокол N 1 заседания КВС МЗ СССР от 9. 02. 1983 г.).

6. Инструкция по изготовлению, контролю и применению диагностикума Крым-ской-Конго геморрагической лихорадки, нммуноглобулинового пероксидазного сухого (протокол N 1 заседания КВС МЗ СССР от 9.02. 1983 г.)

4. Фармакопейная статья на тест-систему иммуноферменгную для определения антигена вируса ГЛПС (ФС 42/Д055 ВС-95, утверждена Госкомитетом санэпид-надзора Росии 27. 11. 1995 г.).

5. Экспериментально-производственный регламент N 542-95 на тест-систему им-муноферментную 'ХАНТАГНОСТ" для определения антигена вируса ГЛПС (согласовано с ГИСК им. Л. А. Тарасевича от 10. 11. 1995 г.).

6. Инструкция по применению иммуноферментпой тест-системы
"ХАНТАГНОСТ" для определения антигена вируса ГЛПС (утверждена Госкоми
тетом санэпиднадзора России от 27. 11. 1995 г.).

Получено авторское свидетельство N 1639245 от 1. 12. 1990 г. "Диагностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом для детекции

антигенов всех известных серотипов этого вируса прямым иммунофермснтным методом".

Товарный знак "ХАНТАГНОСТ" зарегистрирован в Государственном реестре товарных знаков СССР, свидетельство N 91221 от 8. 10. 1990 г.

Опубликованы следующие методические рекомендации:

1. Применение твердофазных иммуносорбентпых методов (энзимного и радиоиммунологического анализа) для лабораторной диагностики аренавирусных инфекций, КГЛ-Конго и ГЛПС. Методические рекомендации. МЗ РСФСР, М., 1982 г.

2. Методы лабораторной диагностики ГЛПС. Методические рекомендации. МЗ РСФСР, М., 1982 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

3. Разработка и оптимизация б вариантов ИФА для определения вирусспе-цифических антигенов и антител. Стандартизация подходов при конструировании пероксидазных диагностик-умов.

4. Разработка ИФА-систем для лабораторной диагностики инфекций, вызываемых вирусами семейств Arenaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae, Picornaviridae, Togaviridac. Системы для определения аренавирусных и буниавирусных (вирус КГЛ-Конго, хантавирусы) антигенов и антител предложены впервые.

5. Экспериментальные доказательства эффектшшости (чувствительность и специфичность) поликлональных ИФА-систем скрининга (определение антигенов) при их сравнительной оценке с моноклональными системами, а также с методами анализа нуклеиновой кислоты вируса (полимеразной цепной реакции).

6. Разработка и внедрение в исследовательскую практику и в практику здравоохранения нового подхода в эпизоотологических исследованиях: системы ИФА-скришшга (определение вирусных антигенов в грубых суспензиях органов

диких животных) как базисного метода разведки, изучения и мониторинга природных очагов вирусных инфекций.

5. Разработка ИФА-системы на основе моноклональных антител для типи-рования антигенов хантавирусов в природных образцах.

6. Разработка метода ИФА-скрининга диких животных (определение ханта-вирусных антигенов и антител ) на основе более доступного варианта ИФА - дот-блот анализа.

7. Приоритетные результаты обширных исследований (с вирусами-представителями перечисленных семейств) с применением разработанных ИФА-тест-систем, позволяющие говорить об эффективной системе лабораторной диагностики вирусных инфекций на основе ИФА.

8. Разработка и внедрение в производство коммерческих ИФА-диагностикумов на основе разработанных экспериментальных тест-систем.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на 19 и 20 итоговых сессиях Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (Москва, 1981, 1985); пленуме Всесоюзной проблемной комиссии "Арбовирусы" (Таллин, 1984); II Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней (Тюмень, 1984); 10 и 11 международных конгрессах по тропической медицине и малярии (Манила, 1980, Калгари, 1984); 5 международном конгрессе по вирусологии (Страсбург, 1981); рабочем совещании экспертов ВОЗ по вирусным геморрагическим лихорадкам (Москва, 1985); 29 международном коллоквиуме по хантавиру-сам (Антверпен, 1987); международном симпозиуме по ГЛ11С (Ленинград, 1991); 3 международном симпозиуме по арбовирусам и хантавирусам в странах Средиземноморья (Кортина д'Ампеццо, 1992); 2, 3 и 4 международных конференциях по

ГЛПС и хантавирусам (Пекин, 1992; Хельсинки, 1995; Атланта, 1998); ежегодной конференции германского вирусологического общества (Гамбург, 1997).

Публикации. Основное содержание диссертации представлено в 40 публикациях.

Объём и структура диссертации. Диссертация написана в форме монографии и представляет собой рукопись объёмом в 207 страниц с 67 таблицами, 16 рисунками, списком цитируемой литературы (171 отечественный и зарубежный источник) и состоит из введения, собственных исследований (3 главы), обсуждения и выводов. Диссертация снабжена приложением (отдельный том из 158 страниц -нормативно-техническая документация на ИФА-тест-системы).