Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Семейство Togaviridae, род Alphavirus
1.1. Таксономия 2. 5
1.2. Морфология, молекулярно-генетическая характеристика 2. 6
1.3. Значение альфавирусов в патологии человека 3. 0
1.4. Лихорадка Синдбис 3.
1.4.1. История изучения. Эпидемиология 3. 1
1.4.2. Клиническая картина 33
1.4.3. Лабораторная диагностика 3. 4
1.5. Лихорадка Чикунгунья 34
1.5.1. История изучения, эпидемиология 3. 4
1.5.2. Клиническая картина 35
1.5.3. Лабораторная диагностика 36
Глава 2. Семейство Flaviviridae, род Flavivirus
2.1. Таксономия 37
2.2. Морфология, молекулярно-генетическая характеристика 3..9
2.3. Значение флавивирусов в патологии человека 4. 1
2.4. Лихорадка денге
2.4.1. История изучения. Эпидемиология 4. 3
2.4.2. Клиническая картина 45
2.4.3. Лабораторная диагностика 4. 8
2.4.4. Вакцинопрофилактика 4. 9
2.5. Лихорадка Западного Нила 49
2.5.1. История изучения. Эпидемиология 4. 9
2.5.2. Клиническая картина 56
2.5.3. Лабораторная диагностика 5. 7
2.5.4. Вакцинопрофилактика 5 8
Глава 3. Семейство Bunyaviridae
3.1. Таксономия 5 8
3.2. Морфология и молекулярно-генетическая характеристика 5 9
3.3. Значение в патологии человека 6 3
3.4. Лихорадка Батаи 6 3.4.1. История изучения. Эпидемиология 6 6
3.4.2. Клиническая картина 69
3.4.3. Лабораторная диагностика 70
3.5. Заболевания группы Калифорнийского энцефалита 70
3.5.1. История изучения. Эпидемиология 7 0
3.5.2. Клиническая картина 7. 3
3.5.3. Лабораторная диагностика 76
3.6. Москитные лихорадки (Неаполь, Сицилия, Тоскана) 76
3.6.1. История изучения. Эпидемиология 7 6
3.6.2. Клиническая картина 79
3.6.3. Лабораторная диагностика 8 0
3.7. Лихорадка долины Рифт 8 0
3.7.1. История изучения. Эпидемиология 8 0
3.7.2. Клиническая картина 83
3.7.3. Лабораторная диагностика 8 5
3.7.4. Вакцинопрофилактика 8 6
3.8. Лихорадка Укуниеми 86
3.8.1. История изучения. Эпидемиология 8 6
3.8.2 Клиническая картина 87
3.8.3. Лабораторная диагностика 8 7
3.9. Крымская-Конго геморрагическая лихорадка 8 7
3.9.1. История изучения. Эпидемиология 8 7
3.9.2. Клиническая картина 91
3.9.3. Лабораторная диагностика 9 2
3.9.4. Вакцинопрофилактика 9. 3
4. Заключение 9. 4
Собственные исследования
Глава 5. Материалы и методы
5.1. Вирусы 9. 8
5.2. Приготовление специфических антигенов 99
5.3. Получение гипериммунных асцитных жидкостей 9..9
5.4. Выделение иммуноглобулинов 1. 00
5.5. Приготовление конъюгатов пероксидазы хрена с иммуноглобулинами .1..00
5.6. Метод флюоресцирующих антител 1. 01
5.7. Реакция нейтрализации 1. 01
5.8. Иммуноферментный анализ (ИФА) 1. 5.8.1. ИФА для выявления антигенов вирусов 101
5.8.2. ИФА для выявления антител класса G 1. 03
5.8.3. ИФА для выявления антител класса М (MAC-ELISA) 1..04
5.9. Реакция торможения гемагглютинации 105
5.10. Реакция связывания комплемента 105
5.11. Статистические методы 1 5.11.1. Степень корреляции положительных и отрицательных результатов РН, РТГА и ИФА-IgG 1. 06
5.11.2. Оценки параметров распределений с использованием
выборок экспериментальных данных 107
5.11.3. Метод Манна-Уитни 1. 07
Глава 6. Разработка и внедрение новых подходов в технологии приготовления ИФА тест-систем для серологической диагностики арбовирусных инфекци й и детекции специфических вирусных антигенов
6.1. Определение активности глобулинов 1. 09
6.2. Новый способ приготовления пероксидазных конъюгатов 111
Глава 7. Испытание и внедрение экспериментальных ИФА-тест-систем для специфической диагностики ККГЛ и ЛЗН
8 7.1. Сравнительные испытания ОТ-ПЦР тест-систем "Амплисенс ККГЛ",
"ГенКонго" и ИФА тест-системы НИИ вирусологии для детекции вируса ККГЛ в клинических и полевых материалах 118
7.2. Сравнительные испытания ИФА тест-систем производства ЗАО "Век торБест" и НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского для выявления специ
фических антител классов М и G и антигенов вируса ККГЛ 123
7.2.1. Сравнительное испытание ИФА-тест-систем «ВектоКрым КГЛ-IgМ» и «ЛабБИА-IgM-ККГЛ» 123
7.2.2. Сравнительное тестирование ИФА-тест-систем «ВектоКрым-КГЛ-IgG» и «ЛабБИА-IgG-ККГЛ» 124
7.2.3. Сравнительного тестирование ИФА-тест-систем «ВектоКрым-КГЛ-антиген» и «ЛабБИА-АГ-ККГЛ» 126
7.3. Государственные испытания экспериментальных ИФА тест-систем производства НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского для выявления антител классов М и G к вирусам ККГЛ и ЗН в сыворотках крови человека, так же антигенов вирусов ККГЛ и ЗН в полевых материалах (ГИСК им. Тарасевича, 2003 г.) 128
7.3.1. для выявления IgM антител к вирусу Западного Нила в сыворотках крови людей 129
7.3.2. для выявления IgG антител к вирусу Западного Нила в сыворотках крови людей 129
7.3.3. для выявления антигена вируса Западного Нила в полевых и клинических материалах 132
7.3.4. для выявления антител класса М к вирусу ККГЛ 1. 34
7.3.5. для выявления антител класса G к вирусу ККГЛ 1..35
7.3.6 для выявления антигенов вируса ККГЛ в полевых материалах...1. 36
7.3.7. Заключение Комитета медицинских иммунобиологических
препаратов 1. 39
7.4. Испытание и внедрение в практику ИФА тест-систем с ЗАО
"Биосервис" 1. 39 7.4.1. Медицинские испытания опытно-производственных серий наборов реагентов «БиоСкрин-ВЗН» комплекты «М» и «G» 1. 39
7.4.2. Медицинские испытания опытно-производственных серий наборов реагентов «БиоСкрин-ВЗН» комплект «AG» 1. 40
7.4.3. Технические испытания набора реагентов "БиоСкрин-ККГЛ" для выявления антигенов вируса и антител к вирусу ККГЛ
7.4.3.1. комплект «М» 144
7.4.3.2. комплект «G» 1. 46
7.4.3.3. комплект «AG»
7.5. Приготовление экспериментальных ИФА-тест-систем для использования в практических лабораториях РФ в 1999-2009 гг 150
7.6. Использование экспериментальных ИФА тест-систем НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского для серологической диагностики лихорадки Западного Нила (1997-2006 гг.) 1 7.6.1. Астраханская область 1. 52
7.6.2. Расшифровка этиологии эпидемической вспышки лихорадки Западного Нила на юге Европейской части России в 1999 1. 54
7.6.3. Волгоградская область 1. 58
7.6.4. Ростовская область 1. 59
7.6.5. Краснодарский край 1. 60
7.6.6. Эффективность применения методов MAC-ELISA, ИФА-IgG и РТГА для диагностики лихорадки ЗН 1. 61
7.6.7. Итоговые данные о заболеваемости лихорадкой ЗН в Южном регионе в 1999 г 162
7.6.8. Динамика титров специфических IgM, IgG, выявляемых методами ИФА, и антигемагглютининов в сыворотках крови
больных лихорадкой ЗН 163
7.6.9. Персистенция специфических антител у реконвалесцентов, перенесших лихорадку Западного Нила 1. 63
7.6.10. Использование ИФА тест-систем для изучения иммуноструктуры населения Астраханской области к вирусу ЗН 167
7.6.11. Сравнение эффективности применения РН, ИФА-IgG и
РТГА при изучении иммуноструктуры населения к вирусу ЗН 1. 69
7.6.12. Применение ИФА тест-системы для выявления антигенов
вируса ЗН в полевых материалах и крови больных лихорадкой ЗН 1. 70
7.6.12.1. Выявление антигенов в комарах 1. 71
7.6.12.2. Результаты обследования сывороток крови и СМЖ больных ЛЗН 1. 72
7.6.13. Методические рекомендации по диагностике лихорадки ЗН 1. 73
7.7. Использование экспериментальных ИФА тест-систем НИИ вирусо логии им. Д.И. Ивановского для серологической диагностики ККГЛ... 174
7.7.1. Астраханская область 174
7.7.2. Ростовская область 1..76
7.7.3. Волгоградская область 1. 77
7.7.4. Использование ИФА-IgG тест-систем для выявления антител к вирусу ККГЛ в сыворотках крови населения Волгоградской области...
7.7.5. Применение ИФА тест-систем НИИ вирусологии для изучения циркуляции вируса ККГЛ и специфической диагностики инфекции на территории Черноморского побережья Кавказа 178
7.7.6. Определение значений титров антител классов М и G к вирусу ККГЛ 1. 81
7.7.7. Влияние климата на активность и распространение очагов ККГЛ в северном регионе ареала вируса 1 8 4
7.8. Использование ИФА тест-систем для диагностики малоизученных арбовирусных заболеваний на территории России 1. 91
7.8.1. Диагностика случаев малоизученных арбовирусных инфекций с использованием ИФА-IgM тест-систем (MAC-ELISA) 1. 91
7.8.1.1. Астраханская область 191
7.8.1.2. Случаи лихорадки Батаи 1..93
7.8.1.3. Новороссийский район Краснодарского края 195
7.8.2. Использование тест-систем ИФА-IgG для изучения иммуноструктуры населения эндемичных территорий к малоизученным арбовирусам 1. 96
7.8.2.1. Астраханская область 196
7.8.2.2. Волгоградская область 1. 97
7.8.2.3. Краснодарский край 1. 97
7.8.3. Использование ИФА-IgG тест-систем для обнаружения антител к вирусам Батаи, ЗН и американских энцефалитов лошадей у животных.. 198
7.9. Завозные случаи арбовирусных инфекций в Российскую Федерацию...2..01
7.10. Обсуждение и заключение 2 0 9
Выводы
- Лабораторная диагностика
- Значение в патологии человека
- Приготовление конъюгатов пероксидазы хрена с иммуноглобулинами
- Сравнительное испытание ИФА-тест-систем «ВектоКрым КГЛ-IgМ» и «ЛабБИА-IgM-ККГЛ»
Лабораторная диагностика
В Европе первые два случая лихорадки Синдбис были диагностированы в Финляндии в 1965 г. [174, 522]. В 1980 году вспышки этого заболевания имели место в Финляндии (под названием болезнь Погоста) и Швеции (болезнь Окельбо). Штаммы вируса Синдбис были выделены из комаров и от птиц в 1980 г. в Финляндии [173, 176, 177, 466, 597] в 1984 г. в Швеции [561].
Летом 1981 г. вспышка аналогичного заболевания (названного - Карельская лихорадка) с лихорадкой, сыпью и артралгией наблюдалась в Карелии, где было выявлено примерно 200 больных, хотя истинное число инфицированных, вероятно, было значительно выше, так как лица с легкими формами за медицинской помощью обычно не обращались. На основании эпидемиологических данных было высказано предположение об арбовирусной природе этой инфекции с участием комаров и, возможно, мокрецов в качестве переносчиков. Доказательства этиологической роли вируса Синдбис были получены в результате серологического обследования парных сывороток больных в РСК, РТГА и реакции нейтрализации [83]. В 1983 году из комаров, собранных в Карелии, был выделен вирусный агент, получивший название "вирус Карельской лихорадки" [410]. В 1982-1984 гг. в Карелии ежегодно регистрировались единичные лабораторно подтвержденные случаи этого заболевания (как среди взрослых, так и детей): в 1982 г. - 6, в 1983 г. - 5, в 1984 г. - 7. Кроме того, 2 случая были диагностированы в 1984 г. в Вологодской области, и 3 в 1985 г. в Смоленской области. Эти данные свидетельствовали о продолжавшейся циркуляции возбудителя на эндемичных территориях, что объясняется формированием аутохтонных очагов инфекции, либо ежегодным заносом вируса птицами во время весенней миграции [179]. В Финляндии в летние месяцы с 1980 по 1996 гг., ежегодно выявлялось до 1000 больных [179]. Основными методами верификации заболевания служили РТГА, иммуноферментный анализ и реакция нейтрализации [179].
По данным реакции нейтрализации и с использованием метода оли-гонуклеотитдного картирования было установлено, что вирусы Синдбис (штаммы Michalovce и EgAr 339), Окельбо (штамм Edsbyn 5/82) и Карельской лихорадки (штамм LEIV-9298) являются вариантами (генотипами) вируса Синдбис наиболее близкими угандийскому вирусу Babanki [412]. Т.М. Соколовой с соавт. [111] установлены серьезные различия у штаммов вируса Синдбис в цитопатической активности и продуктивности "выхода" вируса при их пассажах в клеточных культурах. Наиболее продуктивными среди Синдбис-подобных вирусов были вирусы Babanki, Карельской лихорадки, штамм 1381 и Whataroa. Продуктивность Синдбис-подобных штаммов AR339 и Ф-720 оказалась в 100 раз ниже. По данным реакции нейтрализации изученные штаммы вируса Синдбис были разделены на 3 географические группы: 1) вирус Карельской лихорадки, штаммы 1381 и 1383 из Эстонии; 2) штаммы из Африки и Армении (Babanki, AR339 ,Ф-720); 3) вирус Whataroa (Новая Зеландия).
В результате секвенирования нуклеотидных последовательностей участков гена, кодирующего белок Е2, 40 штаммов вируса Синдбис, изолированных в странах Европы, Ближнего Востока и Африки, были разделены на три генетических кластера: первый включал 19 штаммов из Египта, Израиля, Саудовской Аравии, Италии, Словакии, Азербайджана, а также три шведских штамма. Второй кластер объединял 17 штаммов, в том числе вирус Окельбо, большинство других штаммов вируса Синдбис из северной Европы (Швеция, Норвегия, Карелия), а также два штамма из Южной Африки. Третий кластер был представлен четырьмя штаммами из Южной Африки, Уганды и Камеруна [465].
Заболевание, вызванное вирусом Cиндбис и его близкородственными генотипами (Бабанки, Кзыл-Агач), характеризуется триадой сим 34 птомов (лихорадка, сыпь и артралгии) обычной для альфавирусных инфекций Старого Света. Артралгии - доминирующий симптом у большинства больных, иногда приводящий к обездвиживанию пациента на протяжении недели. В некоторых случаях реконвалесценты испытывают боли в суставах на протяжении 3-4 лет. В таких случаях у них выявляются специфические IgМ антитела, что, возможно, свидетельствует о хронизации болезни [460].
Современная лабораторная диагностика основывается на выявлении антител классов М и G [530, 604] и выделении вируса из крови больных людей [381]. В 1993 г. J Hrling с соавт. показали возможность обнаружения РНК вируса Ockelbo в биоптатах кожи больных людей, причем в крови и клетках крови этих больных РНК обнаружить не удалось [354]. Коммерческие наборы для диагностики лихорадки Синдбис не производятся.
Лихорадка Чикунгунья была впервые описана в 1952 году, в ходе вспышки инфекции на территории Танзании (бывш. Танганики), расположенной по границе с Мозамбиком [407, 513]. Вирус Чикунгунья выделен из крови больного в 1953 году [507]. Название Чикунгунья на языке местного населения (Суахили) характеризует состояние больных, связанное с резкой болезненностью суставов.
После вспышки в Танзании [407, 513] число зарегистрированных случаев лихорадки Чикунгунья в Африке было незначительным, вплоть до 1999 года, когда произошла крупная вспышка в Демократической Республике Конго, затем в 2004 г. в Кении и в 2007 г. в Габоне [628].
В Южной и Юго-Восточной Азии, эпидемии этой инфекции имели место с 1963 по 2007 гг. в Индии, Пакистане, Шри-Ланке, Мьянме, Таи 35
ланде, Индонезии, Филиппинах, Камбодже, Вьетнаме, Гонконге, Малайзии [160, 437, 500, 637]. С 2003 по 2006 г крупные вспышки наблюдались на островах Индийского океана, включая Мадагаскар, Коморские, Сейшельские, Маврикий и Реюньон [160], в 2006-2007 г. в Индии и некоторых странах Юго-Восточной Азии [628] с чем связано резкое возрастание числа импортированных случаев в Европе [628]. В 2007 году аутохтонная вспышка лихорадки Чикунгунья, связанная с завозом вируса больным из Индии, впервые наблюдалась в северо-восточной Италии [275], и единичные случаи на юге Франции [145].
Заболеваемость лихорадкой Чикунгунья характеризуется циклическими и сезонными колебаниями: крупные эпидемии и вспышки чередуются с периодами низкой эпидемической активности или отсутствием регистрируемых случаев в течение нескольких лет или десятилетий [437, 500, 558].
Лихорадка Чикунгунья передается через укусы комаров рода Aedes, главным образом A. aegypti и А. albopictus. Для их размножения достаточно небольшого количества пресной воды в лужах, канавах, автомобильных покрышках и любых небольших сосудах, таких как вазы, горшки, банки и т.п. Взрослые комары в прохладных и тенистых местах кусают людей в дневное время [525, 637].
Инкубационный период заболевания колеблется от 3 до 12 дней (обычно 3-7 дней). Заболевание начинается внезапно с подъема температуры до 39-40 C. Кроме высокой температуры, характерными проявлениями болезни являются: головная боль, артралгии и миалгии, сыпь [214, 437, 500, 505, 558, 574]. Часто наблюдаются першение в горле, боль в животе и запор, конъюнктивит, лимфаденопатия.
Значение в патологии человека
Прототипный штамм ММ 2222 вируса Батаи впервые был выделен в 1955 г. из комаров Culex gеlidus, собранных в окрестностях Куала-Лумпур в Малайзии [49]; в 1957 г. был выделен вирус «Читур» (Chitoor G 20217) из комаров Aпopheles barblrostris в Индии [227]; в 1960 - вирус «Чалово» (Calovo) из комаров Ап. тaculipeппis в Чехословакии, в 1971 году - вирус Олыка (штаммы 499 и 1548) из комаров Ап. тaculipeппis и Aedes puпctor, отловленных в Волынской области на Западной Украине [280]. Как было установлено позднее, вирусы Батаи, Читур, Чалово и Олыка в антигенном отношении идентичны друг другу и рассматриваются как штаммы вируса Батаи [89, 347].
Два штамма вируса Батаи были изолированы из крови крупного рогатого скота в самой южной части Японии в 1994 г. и в 2001 г.[641]. Первая информация о выделении вируса Батаи в Китае относится к 1992 г. (провинция Юньнань) [272]. В 1994 г. в Индии (штат Карнатак) вирус Батаи был выделен из крови домашних свиней [285], в 1999 г. в Хорватии из комаров [599]. Fu S.H. в 2005 г. секвенировал новый штамм YN92-4, изолированный из комаров в Китае и установил его принадлежность к вирусу Батаи [272].
Во время вспышки лихорадки в Судане в 1997-1998 гг. из комаров был выделен штамм вируса КУ-141, получившего название Нгари. Анализ последовательности трёх сегментов показал, что КУ-141 является генетическим реассортантом, обладающим S и L-сегментами вируса Буньямвера, и М-сегментом неидентифицированного вируса рода Orthobuпyavirus [290]. В 2005 г. на основании 95% гомологии (по аминокислотным последовательностям) М сегмента штамма КУ-141 с вирусом Батаи установлено, что вирус Нгари (штамм КУ-141) оказался peaccopтантом между вирусами Батаи и Бунъямвера, имеющим значение в патологии человека в Восточной Африке [169].
Вирус Батаи широко распространён в Европе и Азии. Имеются сообщения о выделении штаммов из комаров в Малайзии, Таиланде, Камбодже, Индии, Чехословакии, Австрии, Югославии. Антитела к вирусу Батаи были обнаружены у позвоночных животных в Финляндии, Румынии, Германии, Венгрии, Португалии, Индонезии, Шри-Ланке [73, 180, 191, 361, 492, 550].
В Европейской части России штаммы вируса Батаи были выделены из комаров, собранных в Республике Коми, в Вологодской, Ленинградской, Ярославской, Владимирской областях, Республике Удмуртия, в Калининградской, Нижегородской, Московской, Смоленской, Калужской областях, Республиках Татарстан, Чувашия, Мордовия, Марий Эл, Башкирия, в Воронежской, Белгородской, Ульяновской, Курской, Ростовской, Волгоградской, Саратовской, Пензенской, Липецкой областях, Ставропольском и Краснодарском краях. В Западной Сибири этот вирус, по данным вирусологических и серологических исследований, распространён от северной тайги до лесостепи; в Восточной Сибири - от побережья Ледовитого океана до средней и южной тайги; на Дальнем Востоке - от Магаданской области и Чукотки до Хабаровского и Приморского краёв [32, 73].
Трансмиссивная передача вируса позвоночным животным и человеку осуществляется только комарами, главным образом, рода Anopheles [77, 202, 270]. Заражённость комаров в среднем поясе дельты Волги в Астраханской области достигает 0,188% (примерно, 1 заражённый из 500 комаров) [49, 337, 342].
Различные виды млекопитающих могут играть роль резервуара вируса. Антитела к этому вирусу были обнаружены у 15-36% грызунов и у 3% летучих мышей, обследованных в Таиланде, у 22% кроликов в Австрии. Зайцы оказались резистентными при экспериментальном подкожном заражении, в то время как у барсуков и лис развивалась виремия и появлялись антитела [49, 89, 197, 408].
Антитела к вирусу Батаи часто обнаруживались в Индии у сельскохозяйственных животных: у 86-100% верблюдов, 25-100% мелкого и крупного рогатого скота, у 41% свиней, 32-36% лошадей и 10% собак, а так же у 16% птиц в Таиланде и 5% птиц в Чехии [550]. Виремия и антитела были обнаружены у лошадей, свиней и овец после экспериментального заражения [49, 408].
В антропогенных биоценозах южных районов России основными позвоночными резервуарами являютсясельскохозяйственные животные, прежде всего, КРС - главные объекты кровососания "малярийных" комаров Aпopheles тaculipeппis [49]. Иммунная прослойка среди здорового населения в некоторых южных регионах РФ достигает 6% [90], в Малайзии - 2,3%, в Индии - 2,2%. [49, 89, 191]. В центральной Богемии (Чехия) по результатам РТГА положительными оказались 1,2% сывороток крови людей, а по результатам реакции нейтрализации - 0,2% [341].
Имеются бесспорные доказательства патогенности вируса Батаи для человека. Однако его роль в инфекционной патологии изучена недостаточно [73, 191]. Клиника лихорадки Батаи полиморфна и не имеет патогномоничных симптомов. Тяжесть течения варьирует от лёгких гриппоподобных форм до тяжёлых, протекающих с явлениями поражения ЦНС [73].
При гриппоподобном течении наблюдаются лихорадка, анорек-сия, бронхопневмония, головная боль, боль в суставах и мышцах, редко - пятнистая сыпь [153].
Л.В. Колобухина и Т.М. Скворцова сообщили о случае нейроин-фекции в Калужской области с незначительным нарастанием (от 1:8 до 1:16) титров комплементсвязывающих антител к вирусу Батаи (цит. по [105]).
В 1988 г. штаммы вируса Батаи были впервые выделены от лихорадящих больных в Африке (Судан). Среди 195 серологически обследованных больных острыми лихорадочными заболеваниями неясной этиологии, у 13 человек (7%) были обнаружены антитела класса М к вирусу Батаи, и у 59 человек из 96 антитела класса G (61%) [459]
Приготовление конъюгатов пероксидазы хрена с иммуноглобулинами
Впервые москитная лихорадка (МЛ) (синонимы: лихорадка паппа-тачи, болезнь Пика, трехдневная лихорадка, москитка, балхская лихорадка, эфемерная лихорадка, хава и др.) была описана в начале XIX века. В 1886 г. A.Pick выделил МЛ в качестве самостоятельной нозологической формы, назвав ее «собачьей болезнью». В 1904 г. Е.Э.Иванова, а в 1905 г. S.Taussig установили связь этой болезни с укусами москитов [90]. В России первые сведения о МЛ были получены В.Я.Шредерсом в 1913 г. в Севастополе. В 1917 г. Е.Марциновский представил подробное описание лихорадки паппатачи на Кавказе. В опыте самозаражения он доказал роль москитов в передаче этой болезни [91].
В Восточном полушарии заболевания Неаполитанской и Сицилийской москитными лихорадками регистрируются в Средиземноморских странах (Португалия, Испания, Франция, Италия, республики бывшей Югославии, Саудовская Аравия, Ирак, Иран, Турция, Марокко, Алжир, Тунис, Египет); в Африке (ЦАР, Судан, Эфиопия, Сомали), в южной Азии (Пакистан, Афганистан, Индия, Бангладеш); странах Средней Азии (Туркменистан, Узбекистан, Таджикистан, Киргизия), на территории Северного Кавказа – в Российской Федерации (Дагестан, Краснодарский край, Кабардино-Балкария, Алания - Северная Осетия, Ставропольский край), в Закавказье (Азербайджан, Грузия, Армения), Украине (Крым) и Молдавии [4, 10, 12, 74, 104, 590]. Заболевания лихорадкой Тоскана регистрируются в Италии, Испании, Португалии, на юге Франции, Словении, Греции, на Кипре и в Турции [79]. Среди стран Западного полушария эндемичными по москитным лихорадкам являются страны Южной (Бразилия, Колумбия) и Центральной Америки (Панама) [495], а также США (штат Техас) [352].
Первая известная крупная вспышка на территории бывшего СССР произошла в 1923 г. в Крыму (в Севастополе среди воинских континген-тов, а также Бахчисарае). В 1933 г. случаи МЛ наблюдались в Феодосии [31], в 1928 и 1929 гг. - в г. Армавире. В 1934г. большая эпидемическая вспышка имела место в Новороссийске, в 1935г. – в г. Георгиевске (Ставропольский край), где в июле и августе было зарегистрировано 1375 больных. Заболевания наблюдались в населенных пунктах, расположенных по линии железной дороги от Георгиевска в сторону Буденновска и на юг от станции Прохладная, а также в г. Орджоникидзе (Владикавказ) [109]. В 1935г. эпидемия МЛ охватила не только Новороссийск (где было зарегистрировано более 5000 больных), но и соседние населенные пункты [122]. В послевоенные годы заболеваемость в Севастополе (на 100000 населения) составляла: в 1945г. – 14360; в 1946 – 17700; в 1948 – 573,7; в 1949 – 976,1; в 1950 – 165,3; в1951 – 80,0; в 1953 – 1,7. С 1954г. больные уже не регистрировались [93]. Помимо приведенной выше информации, имеются сведении об эпидемических вспышках «лихорадки паппатачи» в послевоенные годы в Дагестане и других административных территориях Северного Кавказа (Цит. по А.М. Бу-тенко, И.С. Клименко [17]).
В Центральной Италии, с 1977 по 1993 гг. было диагностировано 267 случаев лихорадки Тоскана, протекающей в форме острого менингита или менингоэнцефалита, с 1995 по 1997 гг. – 112 случаев [601], чаще среди взрослого населения [587]. Тестирование крови больных мето 78 дом ОТ-ПЦР подтвердило роль вируса Тоскана как основного агента, вызывающего асептический менингит в центральной области Испании, где это заболевание регистрируется с 1988 г. [168, 246, 526, 527]. Случаи лихорадки Тоскана нередко случаются среди туристов, посетивших эндемичные регионы Италии, Португалии, Испании и Кипра [248, 249, 415, 536].
В 1986 – 1987гг. С.Я. Гайдамович и соавт. [35] были выделены 5 штаммов вирусов НМЛ и СМЛ из крови военнослужащих советских войск, дислоцированных в Афганистане. Афганские штаммы вируса неаполитанской москитной лихорадки, по данным серологической идентификации, имели некоторые отличия от прототипных [9].
Вирусы МЛ в Старом Свете экологически связаны с их основными переносчиками-москитами рода Phlebotomus [287, 532, 588]. Москиты Ph.perfiliewi и Ph.perniciosus, основные переносчики вируса Тоскана, распространены в Италии, Испании, Франции и других средиземноморских странах [210, 211, 325, 498, 526, 607]. На Американском континенте переносчиками вирусов МЛ являются москиты рода Lytzomyia: Lytzomyia trapidoi и L.ylephilatrix. Вирус Чагрес был выделен из комаров Sabethes chloropterus, а также из самок и самцов L.trapidoi [495]. Москиты рода Phlebotomus встречаются и на территории южных областей России, а также других стран СНГ [93, 109, 113].
Москиты являются не только переносчиками, но и резервуарами флебовирусов в природе, поскольку у них доказана трансовариальная передача возбудителя потомству [589]. Вирусы МЛ могут передаваться половым путем от инфицированных самцов неинфицированным самкам [210].
Среди позвоночных хозяев вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана наибольшее значение имеют песчанки. Вирус Тоскана был выделен от летучих мышей [26]. Резервуарами вирусов МЛ в природе могут быть также низшие обезьяны, сумчатые, грызуны, овцы [7, 210, 230, 238]. 3.6.2. Клиническая картина
Инкубационный период длится 3 – 7 дней. Заболевание характеризуется внезапным, без продромальных явлений, высоким подъемом температуры до 39 - 400, сильной головной болью без определенной локализации, болью в мышцах и особенно затылка с явлениями ригидности, болью в глазницах. Отмечается бледность, фотофобия, конъюнктивит, общее недомогание, анорексия, желудочно-кишечные расстройства (диарея, рвота). Гиперемия ротоглотки с отечностью, точечными кровоизлияниями и пузырьками на слизистой оболочке дужек и язычка, губ. Болезненно поднятие век (симптом Тауссига). Патогномоничным является симптом Пика: инъекция сосудов склеры в форме треугольника, обращенного вершиной к роговице. Этот симптом отмечается в течение 7 – 10 дней после падения температуры [122]. На 2 – 3 день болезни возможно появление кореподобной или мелкопапулезной сыпи, быстро проходящей с нормализацией температуры тела. Температура держится около 3 – 5 дней. Зачастую заболевание заканчивается полным выздоровлением, общая слабость может длиться до 2-х недель. Смертность не зарегистрирована. Более мягко, в большинстве случаев субклинически, заболевание протекает у детей [31, 587]. В случае инфекции, вызванной вирусом Тоскана, тяжесть заболевания может варьировать от гриппопо-добного синдрома до асептического менингита и, с меньшей частотой -менингоэнцефалита и энцефалита без проявлений менингита. В Центральной Италии 80% острых вирусных инфекций центральной нервной системы детей в летнее время связано с вирусом Тоскана [168]. Наблюдается также асимптоматическая инфекция и инфекция без вовлечения ЦНС. Продолжительность острой фазы составляет 7 суток. В большинстве случаев заболевание имеет благоприятный исход. Однако есть сведения о таких осложнениях, как глубокая кома, диффузная лимфадено-патия, гепатоспленомегалия, внутрисосудистая коагулопатия, макулопа 80 пулярная сыпь, ДВС-синдром [154, 210, 498, 539]. Клиническая картина крови характеризуется лейкопенией, лимфопенией, эозинофилией, мо-ноцитозом, сдвигом лейкоцитарной формулы влево [63]. В СМЖ увеличивается концентрация белка и лейкоцитов, содержание глюкозы в норме [239].
На первом этапе болезни вирус поражает клетки ретикулогистио-цитарной системы, где происходит накопление вируса. Вовлечение ЦНС у человека в случае инфекции вирусом Тоскана является вторичным процессом после поражения лимфоидных органов [224].
Сравнительное испытание ИФА-тест-систем «ВектоКрым КГЛ-IgМ» и «ЛабБИА-IgM-ККГЛ»
Для выделения специфических иммуноглобулинов отбирали серии ИАЖ с активностью в РСК не менее 1:640. Выделение поводили на колонке с протеином А-сефарозой, одновременно элюируя все фракции глобулинов. После определения концентрации белка в каждой серии выделенного глобулина, сравнивали специфическую активность глобулинов в ИФА. Для этого титровали глобулины в одинаковых концентрациях при сорбции их в лунках планшета. Далее проводили ИФА в соответствии с описанием (пункт 5.8.1).
В качестве примера выбора подходящей серии иммуноглобулинов и выбора рабочего разведения для дальнейшего использования в тест-системах приводим результаты титрования в ИФА двух серий Ig против вируса Западного Нила: Ig ЗН 1-06 (Сбелка = 1,4 мг/мл)и Ig ЗН 2-06 (Сбелка = 1,9 мг/мл) (табл.7).
На основании приведенных данных определена оптимальная концентрация иммуноглобулина для сорбции на планшете при постановке ИФА, которая располагается в диапазоне концентраций от 5.0 мкг/мл до 10.0 мкг/мл.
Впервые пероксидаза хрена для мечения антител была применена в 1966 Nakane P.K. и Pierce G.B.Jr. [454]. В настоящее время конъюгаты с пероксидазой являются важным компонентом большинства коммерческих иммуноферментных тест-систем. При наличии в лунке планшета искомого антигена или антител меченный иммуноглобулин специфически связывается с ним, и этот комплекс выявляется путем добавления хромогена, который изменяет свою окраску при взаимодействии с пе-роксидазой.
Для ковалентной сшивки индикаторного фермента с антителами предложено несколько различных методов [44]. Самый распространенный на сегодняшний день метод конъюгации (мечения пероксидазой), с помощью перйодатного окисления, предложен Nakane P. К. и Kawaoi A. [455]. Суть этого метода заключается в том, что в результате перйодат-ного окисления углеводов в углеводсодержащих ферментах, например в пероксидазе хрена, образуются альдегидные группы, которые взаимодействуют с аминогруппами антител (антигенов). Продукт реакции стабилизируют восстановлением боргидридом натрия. Принципиально в нём можно выделить две основные стадии.
Первая стадия - активация пероксидазы перйодатом натрия с последующей очисткой активированного производного пероксидазы («альдегид-пероксидазы») диализом или гель-фильтрацией. Вторая стадия - это образование конъюгата АТ с активированным производным пероксидазы хрена, т.е. с «альдегид-пероксидазой» с последующей очисткой диализом или хроматографией с целью выделения конъюгата.
Наиболее широко используют методику, изложенную в монографии «Иммунологические методы» (Под ред. Г.Фримеля, 1987, «Медицина», М., с.436-441).
Использованный в нашей работе новый способ приготовления пе-роксидазных конъюгатов основывается на использовании нанотехноло-гических методов, в частности, применении мембран с известной наноструктурой и размерами пор. Выделяемые объекты имеют размер менее 200 нм, то есть являются нанообъектами.
Предложенная технология предусматривает замену диализа и хроматографии на ультрафильтрацию в ячейках. Ячейки представляют собой ёмкости разных объемов, в которых закрепляются полупроницаемые ультрафильтрационные мембраны.
На 1-й стадии (активации пероксидазы с помощью NaIO4) диализ или хроматография на колонке с носителем G-25, заменяется на фильтрацию через различные типы мембран (например, полисульфоновые или ацетилцеллюлозные и т.п., а так же ядерные фильтры с порами различной формы (цилиндрические, конусообразные и т.п.)) с близким размером пор.
На 2-й стадии (образования конъюгата с альдегид-пероксидазой) диализ и хроматография на колонке с носителем –G-200, заменяется на фильтрацию через мембраны.
Схема приготовления пероксидазного конъюгата новым способом, а также конъюгата, полученного на хроматографических колонках с се-фадексом G-25 и G-200, приводится на рис.10.
Данный способ в настоящее время применяется нами для приготовления пероксидазных конъюгатов, используемых в производстве диагностических ИФА тест-систем.
В качестве примера приводится характеристика активности полученных конъюгатов пероксидазы с антителами к вирусам ККГЛ (табл.8) и Батаи установленной в опытах ИФА по выявлению антигена (АГ) вирусов ККГЛ и Батаи (пункт 5.8.1).