Введение к работе
Актуальность темы. Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) - широко распространенное высококонтагиозное заболевание, к которому в возрасте до 22 недель восприимчивы куры всех пород. Возбудителем ИББ является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Birnaviridae роду Avibirnavirus. Инфекция, в основном, передается алиментарным путем. Вирус является лимфоцитотропным и репродуцируется в ^-лимфоцитах и макрофагах, поэтому наиболее выраженные патологические изменения происходят в фабрициевой сумке, что проводит к снижению ее главной функции - воспроизводству иммунокомпетентных клеток и, в итоге, выражается в иммунодепрессии птиц (Allan W.N. et al, 1972; Faragher J.T. et al,1974; Hirai К.,1974). Заболевание охватывает практически все поголовье, летальность может достигать до 90%, при этом переболевшая птица приобретает повышенную восприимчивость к большинству известных инфекционных болезней вирусной и бактериальной этиологии. В связи с этим ИББ наносит значительный экономический ущерб птицеводству.
С середины 70-х годов наличие ИББ было зарегистрировано практически во всех экономически развитых странах мира (Laser H.N., 1994). В настоящее время, в связи с широкими мероприятиями по ликвидации и специфической профилактике (Tsukamoto K.etal, 1995; Haddad Е.Є. et al, 1997), ИББ не проявляется в виде эпизоотии. В последние годы в России вакцинация против бурсальной болезни осуществляется практически во всех крупных птицеводческих'хозяйствах.
Диагноз на ИББ устанавливается на основании вирусологических и серологических исследований, а также клинических, паталогоанатомических и эпизоотологи-ческих данных. Серологическая диагностика ИББ является наиболее распространенной, как в аспекте ретроспективного отслеживания возможных вспышек заболеваний, так и для оценки эффективности специфической профилактики. Важным и актуальным вопросом для диагностики ИББ является выявление вируса в организме птиц. Кроме того большой интерес представляет определение концентрации антигена в вирусном сырье, используемом для производства живых и инактивированных вакцин против ИББ.
Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур, а также присутствие вируса или его антигена в биологических материалах основано на имуноферментном анализе (Snyder D.B. et al, 1986; Kumar A. et a/,1991; Tsukamoto K.etal, 1995). Достоинствами ИФА являются:
высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов.
Для выявления антител и определения их концентрации в сыворотках крови получил распространение непрямой вариант ИФА, в котором исследуемый образец взаимодействует с антигеном, иммобилизованным на планшете, далее антитела, в составе иммунных комплексов реагируют с конъюгатом (Solano W. et al,1986 Fahey K.J. et al, 1987; Zajac J. et a/, 1992). В свою очередь, для обнаружения и оценки титра антигена в биологических материалах широко применяют, так называемый, непрямой сэндвич-вариант, где исследуемый антиген вначале улавливается специфическими антителами, иммобилизованными на планшете, а затем выявляется детекторными антителами, с которыми взаимодействует конъюгат (Tsukamoto К. et al, 1995; Mohamed К. Н. et al, 1996; Kardi V. et al,1997).
На основе ИФА разработаны и описаны различные тест-системы и выпускаются готовые коммерческие диагностические наборы с прилагаемыми инструкциями (IDEXX, KPL (США), BioChek (Голландия)). При этом все известные наборы, позволяющие проводить количественный анализ, являются импортными, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований. Важно отметить, что в литературе не обнаружено публикаций, в которых дано описание подготовки используемых компонентов, выбора их концентраций, условий проведения анализа и обоснования количественных показателей реакции.
Учитывая очевидную перспективность методов ИФА, создание отечественных тест-систем для выявления и оценки концентрации антител к вирусу ИББ в сыворотках крови птиц и соответствующего антигена в биологических материалах является, безусловно, актуальным.
Цели и задачи исследований. Главной целью исследований была разработка тест-систем на основе ИФА для выявления и определения титров антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур (непрямой вариант), а также для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах (сэндвич-вариант).
При разработке тест-системы, предназначенной для выявления и определения
титров антител к вирусу ИББ, на основе непрямого варианта ИФА необходимо было
решить следующие задачи: '
з -отработать методы получения антигена вируса ИББ, пригодного для ИФА с последующей иммобилизацией его на планшеты;
-определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия компо-. нентов реакции;
-установить величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции и разработать способ опосредованного расчета титров антител при титровании проб в одном разведении;
-сопоставить результаты непрямого варианта ИФА и РДП, определить показатели коррелятивной связи и оценить относительную чувствительность данных тестов;
-с помощью разработанной тест-системы провести исследования напряженности материнского иммунитета у цыплят, а также поствакцинального иммунного ответа у птиц после применения живых и инактивированной вакцин против ИББ.
При разработке тест-системы для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах на основе сэндвич-варианта ИФА были поставлены следующие задачи:
-определить оптимальные концентрации взаимодействующих компонентов и-условия проведения анализа;
-установить пороговые величины показателей реакции и разработать процедуры расчета титра антигена;
-сопоставить титры антигена, установленные в ИФА, РДП и титрами инфекционного вируса, определить их корреляцию и относительную чувствительность тестов;
- с помощью разработанного сэндвич-варианта провести исследования содержания антигена в органах птиц и в сырье для производства инактивированных вакцин против ИББ.
Научная новизна. Впервые разработаны отечественные тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления и оценки концентрации антител к вирусу ИББ при тестировании сывороток в одном разведении. При этом отработаны методы получения антигена вируса ИББ, пригодного для ИФА, с последующей иммобилизацией его на планшет, определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия, а также установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, разработан
способ опосредованного расчета титра антител при титровании проб в одном разведении.
Сопоставлены результаты непрямого варианта ИФА и РДП и установлена корреляция между титрами, полученными этими методами, а также проведена оценка относительной чувствительности этих тестов,
С помощью разработанной тест-системы проведено изучение напряженности материнского иммунитета у цыплят, а также поствакцинального иммунного ответа у птиц после применения живых и инактивированной вакцин против ИББ.
Впервые разработана отечественная тест-система для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах на основе сэндвич-варианта ИФА, при этом определены оптимальные концентрации взаимодействующих компонентов и условия проведения анализа, разработана процедура расчета титра антигена.
Проведено сопоставление титров антигена, установленных в ИФА с титрами, полученными в РДП и титрами инфекционного вируса, определена корреляция между показателями, полученными этими методами, и показана относительная чувствительность тестов.
Проведено определение содержания антигена в органах птиц и в вирусном сырье, используемом для производства инактивированных вакцин против ИББ.
Практическое значение работы. Полученные результаты научных исследований легли в основу 9 нормативных документов, методик, инструкций, указаний и рекомендаций по диагностике ИББ, которые одобрены ученым советом ВНИИЗЖ, утверждены директором института или Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России.
Тест-система, разработанная на основе непрямого варианта ИФА с субстратами ОФД и АБТС, в качестве официально зарегистрированных коммерческих диагностических наборов применяется для диагностики ИББ в различных регионах России и странах ближнего зарубежья.
Во ВНИИЗЖ диагностические наборы в период с 1997 до 2000 г. были использованы для исследования более 100 000 проб сывороток, присланных для анализа более чем из 500 птицеводческих хозяйств Российской Федерации и ближнего зарубежья. Было реализовано 1039 указанных диагностических наборов, при этом стоимость одного исследования, выполненного с помощью разработанных наборов примерно в 4 раза дешевле, чем с использованием импортных.
Тест-система на основе непрямого сэндвич-варианта И<' при».' -<ется для оценки концентрации антигена в сырье, используемом для производств : инактиви-рованных вакцин против ИББ.
Основные положения, выносимые на защиту:
-тест-система, разработанная на основе непрямого варианта ИФА для выявления и оценки титров антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении, включающая обоснования: оптимальных концентраций, условий взаимодействия компонентов, пороговых показателей реакции и способ опосредованного расчета титра антител;
-результаты использования непрямого варианта ИФА для исследования материнского иммунитета у цыплят и поствакцинального иммунного ответа птиц после использования живых и инактивированной вакцин против ИББ;
-тест-система, разработанная на основе сэндвич-варианта ИФА для выявления и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах, включающая обоснование оптимальных концентраций взаимодействующих компонентов, условий проведения анализа, установление пороговых показателей реакции и процедура расчета титра антигена;
-результаты использования сэндвич-варианта для оценки концентрации антигена вируса ИББ в органах птиц и сырье для производства инактивированных вакцин.
Апробаций работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета ВНИИЗЖ в 1995-1999 годах, на Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные болезни сельскохозяйственных животных» (Владимир, 1995г.); на научной конференции «Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных», посвященной 100-летию открытия вируса ящура (Владимир, 1997г.); на научной конференции «Современные аспекты ветеринарной патологии животных», посвященной 40-летию ВНИИЗЖ (Владимир, 1998г.); на научной конференции «Производство и контроль медицинских и ветеринарных препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ», посвященной 30-летию ФГУП ПЗБ (Вольгинский, Владимирской области, 1999г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.
б Объём и структура работы. Диссертация изложена на 127 страницах, включая приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 20 рисунками. Список литературы включает 164 источника.