Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 21
1.1 Вирусный онколиз 21
1.2. Онколитические энтеровирусы человека 24
1.2.1 Общая характеристика и классификация 24
1.2.2 Организация генома энтеровирусов 25
1.2.3 Репликация энтеровирусов 26
1.3 Онколитические свойства энтеровирусов. 28
1.4 Онколитические энтеровирусы 29
1.4.1 Энтеровирусы группы ЕСНО 29
1.4.2 Вирусы группы Коксаки 31
1.4.3 Полиовирусы как онколитики 33
1.5 Клеточные рецепторы необходимые для проникновения онколитических энтеровирусов клетку 34
1.5.1 Рецептор полиовируса PVR/CD155 37
1.5.2 Белок межклеточной адгезии 1 (ICAM-1) 39
1.5.3 Скавенджер-рецептор B2, SCARB2 41
1.5.4 - интегрины 42
1.5.5 Рецептор вирусов Коксаки и аденовирусов (CAR) 45
1.5.6 Фактор ускорения распада DAF/CD55 47
1.5.7 Рецепторы иммуноглобулинов: неонатальный Fc рецептор FсRn 49
1.5.8 Рецептор KREMEN1 (Krm1) 52
1.6 Механизмы проникновения энтеровирусов в клетки 54
1.6.1 Клатрин-опосредованный эндоцитоз 55
1.6.2 Кавеолин – опосредованный эндоцитоз 56
1.6.3 Макропиноцитоз и фагоцитоз 57
1.7 Системы противовирусной защиты клетки, в частности система интерферона. 59
1.7.1 Паттерн-распознающие рецепторы 59
1.7.2 Активация интерферон-индуцируемых генов 65
Глава 2. Материалы и методы 69
2.1 Материалы 69
2.2 Методы 75
2.2.1 Культивирование клеток 75
2.2.2 Подсчет клеток 75
2.2.3 Криоконсервация культур опухолевых клеток 75
2.2.4 Определение титра энтеровирусных штаммов методом бляшек 76
2.2.5 Наращивание вирусных стоков 77
2.2.6 Определение чувствительности опухолевых клеток к онколитическим вирусам 77
2.2.7 Определение титра вируса методом Рида-Менча 78
2.2.8 Оценка жизнеспособности (МТТ-тест) 80
2.2.9 Наработка плазмидной ДНК в Echerichia Coli, штамм 10-beta. Трансформация клеток E.coli 80
2.2.10 Создание плазмид pCas-Guide-2A-RFP для выключения генов 83
2.2.11 Проведение ПЦР 85
2.2.12 Трансфекция клеток плазмидной ДНК pCas-Guide-2A-RFP 86
2.2.13 Получение моноклональных сублиний клеток после трансфекции плазмиды pCas-Guide-2A-RFP 87
2.2.14 Выделение геномной ДНК 87
2.2.15 Подготовка образцов для секвенирования по методу Сэнгера 88
2.2.17 Оценка экспрессии поверхностных белков с помощью проточной цитометрии 89
2.2.18 Определение первичной последовательности геномов энтеровирусов 90
2.2.19 Проведение филогенетического анализа энтеровирусного генома 90
2.2.20 Анализ и статистическая обработка результатов 91
Глава 3. Результаты и их обсуждение 92
3.1 Анализ геномов непатогенных штаммов онколитических энтеровирусов 92
Echovirus E6 isolate RA/E6/Ahvaz/Iran/2011 (GenBank: KX619440.1) 93
3.2 Оценка цитолитических свойств штаммов энтеровирусов на моделях in vitro 96
3.2.1 Линии клеток рака толстого кишечника человека существенно различаются по чувствительности и способности реплицировать онколитические штаммы энтеровирусов. 96
3.2.2 Линии клеток рака толстого кишечника могут существенно различаться по чувствительности к противовирусному действию интерферона 1 типа. 100
3.3 Изучение зависимости онколитической активности непатогенных штаммов энтеровирусов человека от состояния сигнальных путей интерферонового ответа на клетки 102
3.3.1 Получение линии клеток с нокаутом генов IFNAR1 и STAT2 с помощью системы CRISPR/Cas9 102
3.3.2 Влияние обработки клеток НЕК293Т с нокаутом генов IFNAR1 и STAT2 интерфероном-альфа на литическую активность онколитических энтеровирусов 104
3.3.3 Влияние состояния клеточной системы врожденного противовирусного иммунитета на чувствительность клеток к действию онколитических энтеровирусов. 106
3.4.1 Получение культур клеток с нокаутом отдельных рецепторов проникновения для энтеровирусов. 108
3.4.2 Разделение штаммов эховируса 11 и вируса Коксаки А10 из смеси с помощью клеток нокаутных по рецепторам FCGRT и SCARB2. 112
3.4.3 Исследование потребности в поверхностных рецепторах PVR, СXADR, CD55, ITGA2, SCARB2, ICAM1, FCGRT и KRM1 для различных штаммов энтеровирусов. 113
3.4.4 Установление зависимости используемых вирусами рецепторов клетки от эволюционной близости вирусных штаммов . 127
Список литературы 133
- Вирусный онколиз
- Паттерн-распознающие рецепторы
- Наработка плазмидной ДНК в Echerichia Coli, штамм 10-beta. Трансформация клеток E.coli
- Установление зависимости используемых вирусами рецепторов клетки от эволюционной близости вирусных штаммов
Вирусный онколиз
Проблема метастатазирования злокачественных заболеваний по-прежнему остается нерешенной. До 1900–х годов противоопухолевая сводилась к хирургическому удалению опухоли. В начале XX века стали появляться альтернативные методы лечения, такие как радиотерапия, химиотерапия, а затем и иммунотерапия [34]. Несмотря на значительный прогресс в борьбе с злокачественными новообразованиями, актуальным является поиск эффективных, менее токсичных и более точных методов лечения.
Вирусный онколиз — это новый подход к терапии онкологических заболеваний, основанный на использовании природных непатогеных штаммов вирусов или генетически модифицированных вирусов, которые способны селективно реплицироваться в опухолевых клетках и вызывать гибель преимущественно злокачественных клеток, при этом не повреждая нормальные ткани [35-37]. В России исследования онколитических вирусов были начаты в период 1960–1970-х годов профессором М. К. Ворошиловой (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР), но сама идея использования вирусов в борьбе с онкологическими заболеваниями человека зародилась еще задолго до этого [36]. Ещё в начале прошлого века было замечено, что после перенесенных вирусных инфекций у некоторых пациентов наблюдалась спонтанная ремиссия онкологических заболеваний [34]. Дальнейшее исследование онколитических свойств вирусов продолжалось параллельно с изучением биологии вирусов и механизмов злокачественной трансформации клеток. Первые обзорные работы онколитических свойств вирусов появились в 50–е годы [38, 39, 40], однако в 70–80–х годах исследования были приостановлены и возобновились лишь в 90–е годы с развитием методов генной инженерии и улучшением понимания молекулярных основ биологических процессов [34].
В настоящее время, основными требованиями, предъявляемыми к онколитическим вирусам, являются эффективность в отношении гетерогенной и постоянно меняющейся популяции опухолевых клеток, безопасность и неспособность повреждать нормальные ткани. Под эффективностью понимается способность вируса проникать в злокачественные клетки, реплицироваться в клетках с высоким уровнем амплиферации и максимально полно и быстро лизировать их, несмотря на наличие противовирусного иммунного ответа. Кроме того, одним из самых важных направлений является возможность создания рекомбинантных вирусов с целью получения штаммов с программируемыми свойствами. Например, популярным подходом к увеличению селективности является создание рекомбинантных вирусов, нацеленных на конкретные мишени, специфичные для опухоли. С этой целью участки генома вирусов подвергают различным модификациям, таким как делеция в конкретном гене, вставка опухолеспецифических промоторов, псевдотипирование, инсерция последовательностей, кодирующих малые интерферирующие РНК [40]. Благодаря развитию методов генной инженерии в последние несколько лет появились новые методы редактирования генома, такие как, например, CRISPR/Cas9, ZFN и TALEN, с помощью которых можно не только нокаутировать ген, но и вставить новый участок ДНК. Данные методы предоставляют ученым возможность найти новые подходы к усовершенствованию онколитического потенциала вирусов.
Онколитические вирусы представляют собой перспективный класс противоопухолевых агентов, благодаря способности селективно инфицировать и разрушать клетки опухоли [41]. В значительной степени действие онколитических вирусов основано на том, что опухолевые клетки являются более восприимчивыми к инфекциям по целому ряду причин, которые будут описаны ниже.
1. Увеличение физической доступности опухолевых клеток для вирусов по сравнению с клетками нормальных тканей. Опухоль обладает дезорганизованной структурой с нарушением тканевых барьеров и межклеточных контактов [15]. Кровоснабжение новообразований обеспечивают быстро растущие сосуды с хорошо проницаемыми стенками. В связи с этим вирусу проще распространяться между клетками опухоли, чем по здоровым тканям.
2. Ускоренный метаболизм и активная пролиферация опухолевых клеток. Вирусы используют ресурсы заражённой клетки, поэтому репликация вирусного генома и сборка вирусных частиц в активно делящихся клетках происходит быстрее и эффективнее. В опухолевых клетках происходит активная репликация собственной ДНК и присутствует большое количество нуклеотидов и ферментов, которые необходимы также и для репликации вирусного генетического материала.
3. Дефекты противовирусной защиты. В большинстве опухолевых клеток нарушено функционирование опухолевого супрессора p53. В результате клетки даже с множественными повреждениями генома избегают апоптоза и продолжают активно пролиферировать. Также в ходе опухолевой прогрессии происходит отбор клеток с различными нарушениями в интерфероновой системе. Такие клетки устойчивы к противоопухолевому действию интерферонов, но в то же время значительно более чувствительны к вирусным инфекциям.
В настоящее время, в качестве противоопухолевых агентов рассматриваются представители важнейших семейств вирусов: пикорнавирусы, аденовирусы, герпесвирусы, поксвирусы, парвовирусы и другие. На основе некоторых из них уже созданы терапевтические препараты, применяемые в клинике. Например, в 2004 году в Латвии для лечения меланомы был одобрен препарат RIGVIR на основе энтеровируса ECHO7 [42,43]. Также, в 2005 году в Китае для лечения рака головы и шеи на основе генетически модифицированного аденовируса типа 5 был создан и запатентован препарат Oncorine (H101) [44]. В октябре 2015 года в США для применения в клинике для лечения пациентов с неоперабельной метастатической меланомой был допущен препарат на основе модифицированного вируса простого герпеса Talimogene laherparepvec (T–VEC) [45].
На сегодняшний день активно разрабатываются новые противоопухолевые препараты, основанные на представителях различных семейств вирусов, обладающих онколитическими свойствами. Одним из перспективных является семейство Picornaviridae. Наиболее хорошо изученными представителями данного семейства с точки зрения онколитической эффективности являются представители рода Enterovirus – непатогенные энтеровирусы человека, в том числе вакцинные штаммы полиовирусов, вирусов Коксаки и эховирусов.
Паттерн-распознающие рецепторы
За распознавание вирусной инфекции в клетках отвечают две группы рецепторов. Первую группу составляют мембранные Toll-подобные рецепторы (TLRs, Toll-like receptors). TLRs принадлежат к трансмембранным гликопротеинам 1-го типа, локализованы на клеточной поверхности и в эндосомальных компартментах. У человека имеется 10 различных типов TLRs, каждый из которых обладает определенной специфичностью [257]. В распознавании одноцепочечных РНК таких вирусов, как вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус везикулярного стоматита (VSV), вирус гриппа и парамиксовирусы, участвуют TLR7 и TLR8 [258-260]. TLR-7 и TLR-8 локализованы внутри клетки на эндосомальных мембранах. В процессе эндоцитоза материала, содержащего РАМР, происходит их мобилизация из мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭПР) в мембрану фаголизосомы, где данные рецепторы узнают вирусную РНК и передают сигналы внутрь клеток. Благодаря тому, что TLR-7 и TLR-8 локализованы не в цитоплазме клеток, а в фаголизосомах, клетка оказывается защищенной от распознавания собственных нуклеиновых кислот, попадающих в фаголизосомы только в результате усиленного апоптоза. После связывания с лигандом TLRs димеризуются, происходят конформационные изменения распознающей части рецептора, которые передаются на внутриклеточный домен TIR (Toll-подобный рецептор).
В передаче сигналов от TIR-доменов TLR-7 и TLR-8 участвует адапторный протеин MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene (88)) [261]. MyD88 активирует первую сигнальную киназу – серин-треониновую киназу IRAK-4 (interleukin-1 receptor-associated kinase 4). Активированная IRAK-4 запускает каскад реакций активации сигнальных специфических ферментов, в частности, убиквитин-лигазы TRAF6 (TNF (tumor necrosis factor) receptor associated factors 6). TRAF6, совместно с двумя убиквитиназами UBC13 и UEV1A, катализирует образование K-63 полиубиквитиновой цепи на самом TRAF6 и на важном белке-модуляторе NF-kB (nuclear factor kappaB) – NEMO (NF-kappa-B essential modulator) – регуляторной субъединице IkB киназного комплекса (IKK). Полиубиквитиновая цепь выполняет функцию скаффолда, к которому при помощи дополнительных белков TAB1, TAB2 и TAB3 (TGF-beta activated kinase) прикрепляется киназа TAK1 (TGF-b-activated kinase 1), фосфорилирующая и активирующая киназу IKK [262-264]. Активированная IKK специфично фосфорилирует ингибирующий белок IkB (inhibitor of kappa B), который связан с транскрипционным фактором NF-kB и подавляет его активность. В результате фосфорилирования происходит деградация IkB с освобождением активного димера транскрипционного фактора NF-kB, который мигрирует в ядро и связывается с промоторными областями многих провоспалительных генов, тем самым запуская синтез различных цитокинов, являющихся ключевыми посредниками в воспалительном ответе [265]. При передаче сигнала от TLR-7 образуются дополнительная сигнальная ветвь, приводящая к активации транскрипционных факторов IRF-7 и IRF-3 (interferon regulatory factor), запускающих синтез интерферона (IFN) [266,267].
Представители второй группы рецепторов находятся в цитозоле. Они принадлежат к семейству цитозольных РНК-хеликаз, называемых RIG-I-подобными рецепторами (RLRs, RIG-like receptors). В семейство RLRs входят три рецептора: RIG-I (ген 1, индуцируемый ретиноевой кислотой-Retinoic acid-Induced Gene I), MDA5 (Melanoma Differentiation-Associated protein 5 гена 5, ассоциированного с дифференцировкой меланомы-) и LGP2 (laboratory of genetics and physiology 2 -Лаборатория Генетики и Физиологии 2) [268]. Эти рецепторы экспрессируются в цитоплазме большинства типов клеток и являются основными PRRs [269]. Каждый тип RLR узнает специфические структуры РНК. RIG-I узнает характерные для РНК-содержащих вирусов двуцепочечные РНК или не кэпированные одноцепочечные РНК, имеющие на 5 -конце трифосфатные группы [270-271]. MDA-5 распознает более длинные молекулы двуцепочечной РНК [272]. LPG2 служит в качестве ингибитора, который способен маскировать концы вирусных двуцепочечных РНК и препятствовать индукции интерферона, связываясь с MDA5 [273]. Все RLRs содержат DExD/H-box РНК хеликазный домен и C-концевой домен (CTD), которые участвуют в распознавании вирусной РНК. Кроме того, RIG-I и MDA5, но не LGP2, содержат по два N-концевых CARD-домена (caspase recruitment domain), ответственных за взаимодействие с адапторным белком.
Активация RIG-I происходит при инфекции различными РНК вирусами, например, вирусом гриппа А, вирусом болезни Ньюкасла, вирусом Сендай и вирусом кори [269, 274]. Лигандом для этого рецептора являются некэпированные 5 -трифосфат-содержащие короткие двуцепочечные и одноцепочечные РНК [270]. Недавнее исследование показало, что 5 -дифосфат-содержащие РНК также активируют RIG-I [271]. При связывании лиганда с хеликазным и CTD-доменом происходят конформационные изменения, которые приводят к активации RIG-I, а также активируют его ATP-азную активность. Гидролиз ATP способствует перемещению RIG-I вдоль вирусной РНК, при этом N-концевые CARD-домены становятся доступными для связывания с K63-полиубиквитиновыми цепями [275-276]. Присоединение полиубиквитиновых цепей с помощью E3 убиквитинлигаз Riplet и TRIM25 (tripartite motif-containing protein 25) является необходимым для активации RIG-I [277,278]. Активированные RIG-I олигомеризуются с образованием большого комплекса, состоящего из четырех RIG-I и четырех полиубиквитиновых цепей и формируют комплекс с TRIM25 и шапероном 14-3-3 [279,280]. Этот комплекс, называемый «транслокон», перемещается из цитоплазмы к внутриклеточным мембранам, для дальнейшего взаимодействия с MAVS (рисунок 10).
MDA5 преимущественно отвечает за распознавание пикорнавирусов. Субстратом для MDA5 является длинная дцРНК ( 1 т.п.н.) [281]. Недавнее исследование с использованием метода секвенирования нового поколения (NGS) показало, что MDA5 также способен узнавать AU-богатые вирусные РНК, образующиеся в клетках, зараженных вирусом кори [282]. Молекулярный механизм активации MDA5 не до конца раскрыт. Известно, что хеликазный и CTD-домены MDA5 взаимодействуют с основной частью дцРНК, формируя на ее поверхности спиральные филаменты, при этом оставляя повторы CARDs выставленными на периферию [283].
У LGP2 отсутствует N-концевой CARD-домен, но он взаимодействует с дцРНК с высокой аффинностью. LGP2 способствует продукции IFN в ответ на инфекцию некоторыми РНК вирусами, например вирусом везикулярного стоматита [284]. Недавние биохимические исследования показали, что LGP2 способствует MDA5-РНК взаимодействию и образованию MDA5 филаментов [285]. Олигомеры, образующиеся при связывании CARDs доменов RIG-I и MDA5 с полиубиквитиновыми цепями, обладают высокой способностью к активации адапторного белка MAVS через CARD-CARD взаимодействия.
Активация интерферонового ответа при распознавании вирусной РНК RIG-I и MDA5 рецепторами происходит при участии адапторного белка MAVS, который является ключевым звеном в данном сигнальном пути. Он передает сигнал через ряд различных киназ к транскрипционным факторам NFB и IRF3/7, которые, в свою очередь, запускают транскрипцию IFN-, IFN- и нескольких интерферон зависимых генов (ISGs, interferon-stimulated genes).
Наработка плазмидной ДНК в Echerichia Coli, штамм 10-beta. Трансформация клеток E.coli
К 100 мкл суспензии компетентных клеток Escherichia coli штамма 10-beta добавляли плазмидную ДНК (0,1-10 нг), инкубировали на льду 30 минут. Далее инкубировали 30 секунд при температуре 420С (тепловой шок), выдерживали на льду 5-10 минут, затем добавляли 250 мкл среды LB и инкубировали клетки 1 час при 37оС. Суспензию клеток высевали на твёрдую селективную среду (LB + агар + ампициллин), используя методику растирания. Чашки переворачивали и инкубировали при 37оС 16-18 часов.
Выделение плазмидной ДНК
Бактериальный клон высевали в 2-3 мл среды LB, содержавшей ампициллин, в концентрации 1,5 мкг/мл. Выращивали в течение 16-18 часов в термостатическом шейкере (37С, 180 об/мин). Клетки осаждали центрифугированием (центрифуга Eppendorf 5417 R, 4С, 15 минут, 3600 g). Осадок тщательно ресуспендировали в 250 мкл буфера S1 и добавляли 250 мкл раствора S2, после чего перемешивали путем переворачивания эппендорфа 4-6 раз. К лизату клеток добавляли 350 мкл раствора S3, аккуратно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 5-10 минут, после чего центрифугировали (4С, 10 минут, 12000 g). Далее наносили по 650 мкл полученного супернатанта на колонку и центрифугировали (4С, 1 минута, 12000 g). После пропускания всего объема через колонку проводили дополнительное центрифугирование при тех же условиях. Колонку промывали 700 мкл буфера W1 и центрифугировали (4С, 1 минута, 12000 g).. Далее переносили колонку в новую микропробирку, добавляли 50 мкл элюента (2,5 мМ Tris-HCl, pH 8,5), инкубировали 5 минут при 37С и затем центрифугировали (4С, 1 минута, 13000 g). Измеряли концентрацию ДНК в суммарном объеме элюента на спектрофотометре Nanodrop, после чего хранили образцы при -20С.
Проверку образцов проводили путем рестрикционного анализа. ДНК разрезали по специфическим сайтам с помощью соответствующих эндонуклеаз рестрикции (New England Biolabs, США). Реакционная смесь содержала 0,5-3 мкг ДНК, рестриктазы (1-2 единиц активности (е.а.) на 1 мкг ДНК) и 1х буфер, рекомендованный для конкретного фермента. Реакционную смесь инкубировали в течение 2-3 часов при температуре, соответствующей рекомендациям производителя.
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Анализ фрагментов ДНК проводили в 1% агарозном геле. Гели и буфер (1ТAЕ: 10 мМ трис-HCl, pH 8,0; 1мМ ЭДТА) содержали 1 мкг/мл бромистого этидия. Образцы наносили на гель в растворе, содержащем 0,001% ВРВ и 5% глицерина (DNA loading dye). Электрофоретическое разделение проводили при напряжении 5-10 В/см в течение 1-2 часов. Оценку распределения фрагментов ДНК проводили на трансиллюминаторе в средневолновом УФ-свете.
Элюирование фрагментов ДНК из агарозного геля
Элюцию фрагментов ДНК из агарозного геля проводили с использованием набора для очистки ДНК из геля (Евроген, Россия) проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Фрагменты геля с целевой ДНК вырезали и взвешивали. Гель помещали в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Вес геля в мг численно приравнивается к его объему в мкл (100 мг геля = 100 мкл). К гелю добавляли 3 объема «Связывающего раствора», инкубировали смесь при 50-55C до полного растворения геля. После чего добавляли 1 объем изопропанола на 1 объем геля и перемешивали смесь. Спин-колонку помещали в собирательную пробирку, в ней переносили пробу и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 30 секунд. После этого элюат удаляли и сорбирующий слой колонки промывали 750 мкл раствора, содержащего 1хТЕ, 100 мМ NaCl и 80 % этанола. Затем ДНК элюировали с колонки в 40 мкл воды путём центрифугирования при 13000 об/мин в микроцентрифуге в течение 1 минуты.
Клонирование плазмидных конструкций
Для лигирования векторные плазмиды и встраиваемые фрагменты (вставки) обрабатывали рестриктазами. Лигирование ДНК векторной плазмиды и вставки проводили по липким концам. Для этого ставили реакцию лигирования с T4-лигазой (New England Biolabs, США) по протоколу производителя. В пробирку добавляли 2 мкл лигазного буфера, 1 мкл T4-лигазы, 40 нг вектора, 20 нг встраиваемого фрагмента олигонуклеотида и доводили объем реакции до 20 мкл добавлением ddH2O. Затем инкубировали при 14С в течение 4-16 часов. В качестве контроля использовали лигазную смесь, содержащую только гидролизованный плазмидный вектор. После инкубирования добавляли 10 мкл лигазной смеси в 100 мкл суспензии компетентных клеток, пробирки помещали в лёд на 30 мин, затем быстро переносили в термостат с 42С на 30 сек. После этого добавляли в каждую пробирку 250 мкл среды LB и их инкубировали при 37С в течение 60 минут. Суспензию клеток высевали на твёрдую селективную среду (LB + агар + ампициллин), используя методику растирания. Чашки переворачивали и инкубировали при 370С 16-18 часов. Наращивание клонов проводили в 5 мл жидкой селективной среды (LB + 1,5 мкг/мл ампициллина) в течение 16-18 часов в термостатическом шейкере (37С, 180 об/мин). Обычно в опытном образце наблюдалось 10-20-ти кратное увеличение числа колоний по сравнению с контролем. Для проверки успешности лигирования проводили диагностическую рестрикцию и секвенирование соответствующих участков плазмиды.
Установление зависимости используемых вирусами рецепторов клетки от эволюционной близости вирусных штаммов
В результате использования панелей сублиний с нокаутом по отдельным рецепторам проникновения энтеровирусов в клетки нами было установлено, какие из рецепторов влияют на процесс инфицирования клеток использованными в работе энтеровирусными штаммами. Мы выяснили, что белок CXADR необходим для успешного проникновения в клетку вирусов группы Коксаки В, экспрессия белка PVR важена для полиовируса, SCARB2 –для вируса Коксаки A7, ICAM1 –для вируса Коксаки A21 и энтеровируса 75, экспрессия интегрина 21 –для эховируса 1. Fc рецептор (FcRn) важен для энтеровируса 75 и для всех исследованных представителей эховирусов, продукт гена KREMEN1 требуется только для вируса Коксаки А3. Мы нанесли на схему филогенетического родства капсидных белков исследованных энтеровирусов информацию от используемых рецепторах и установили что в целом они образуют кластеры, указывающие на возможность проведения предсказания потребности в рецепторах на основании анализа структуры вирусных капсид (Рис. 36.).
Исключение составляет рецептор ICAM1, который используется достаточно эволюционно отдаленными штаммами (энтеровирус 75 и вирус Коксаки А21). Не исключено, что приобретение сродства к данному рецептору проходило у этих вирусов независимо. Следует также отметить, что энтеровирус 75 зависит не только от ICAM1, но и от рецептора FCGRT. Менее предсказуемым оказывается потребность в ко-рецепторе CD55/DAF. Этот белок используется очень многими вирусами в широком диапазоне структурного родства, но при этом вирус Коксаки В5 его используют, а очень близкий по структуре вирус Коксаки В6 – нет. Тестирование большего числа вирусных штаммов в будущем поможет установить закономерность в характере используемых рецепторов для, что позволит проводить более надежные предсказания.