Содержание к диссертации
Введение
1 Введение 6
1.1 Актуальность темы исследования 6
1.2 Цель и задачи исследования 8
1.3 Научная новизна 9
1.4 Теоретическая и практическая значимость работы 10
1.5 Методология и методы исследования 10
1.6 Положения, выносимые на защиту 10
1.7 Степень достоверности и апробация результатов 11
2 Обзор литературы 12
2.1 Экстремофильные белки 12
2.1.1 Белки гипертермофильного происхождения 13
2.1.2 Применение термофильных/гипертермофильных белков 16
2.2 Рибосомальные белки: белки L35Ae 18
2.2.1 Рибосомальные белки 18
2.2.2 Рибосомальный белок L35Ae (eL33) 20
2.3 Специфично связывающие белковые молекулы и их комбинаторные библиотеки 23
2.3.1 Системы селекции из комбинаторных библиотек специфично связывающих белков 24
2.3.2 Метод фагового дисплея. Основные принципы 28
2.4 Антитела 35
2.4.1 Иммуноглобулины. Классификация, строение и применение иммуноглобулинов 35
2.4.2 Фрагменты иммуноглобулинов 39
2.4.3 Комбинаторные библиотеки на основе фрагментов иммуноглобулинов. Применение фрагментов иммуноглобулинов 41
2.5 Альтернативные каркасные белки 45
2.5.1 Искусственно созданные альтернативные каркасные белки 51
2.5.2 Альтернативные каркасные белки на основе природных белковых молекул и библиотеки на их основе 52
2.5.3 Альтернативные каркасные белки, полученные на основе белковых
структур экстремофильного происхождения 60
2.5.4. Применение альтернативных связывающих белков 64
3 Материалы и методы 68
3.1 Материалы 68
3.1.1 Химические реактивы и реагенты, ферменты и белковые препараты 68
3.1.2 Буферные растворы 68
3.1.3 Среды 69
3.1.4 Бактериальные штаммы и векторы 69
3.1.5 Клеточные линии млекопитающих 70
3.1.6 Рекомбинантные гены и праймеры 70
3.1.7 Прочие расходные материалы 74
3.2 Методы 74
3.2.1 Получение мутантных форм L35Ae и анализ их структурных свойств 74
3.2.1.1 Расчет энергии электростатических взаимодействий в rWT L35Ae и его мутантных формах 74
3.2.1.2 Электрофорез в геле агарозы 74
3.2.1.3 Получение мутантных форм на основе rWT L35Ae: L35Ae 6X и L35Ae 10X 75
3.2.1.4 Экспрессия и выделение рекомбинантных L35Ae методами металл-аффинной и ионообменной хроматографии 76
3.2.1.5 Определение вторичной структуры рекомбинантных L35Ae методом кругового дихроизма 78
3.2.1.6. Определение термостабильности рекомбинантных L35Ae методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии 78
3.2.1.7 Изучение устойчивости рекомбинантных L35Ae к денатурации гуанидин гидрохлоридом 79
3.2.1.8 Изучение олигомеризации и агрегации рекомбинантных L35Ae методом химического «сшивания» глутаровым альдегидом 80
3.2.1.9 Изучение олигомеризации и агрегации рекомбинантных L35Ae методом динамического рассеяния света 80
3.2.1.10 Гель-фильтрация образцов L35Ae 81
3.2.1.11 Исследование взаимодействия рекомбинантных L35Ae с клеточной линией млекопитающих HEK 293 81
3.2.2 Конструирование и сборка комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X и оценка ее функциональности 82
3.2.2.1 In silico анализ и выбор потенциальных сайтов рандомизации L35Ae 10X 82
3.2.2.2 Конструирование, сборка и амплификация комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X 82
3.2.2.3 Характеризация комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X 84
3.2.2.4 Селекция клонов, специфичных к лизоциму куриного яйца, из комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X 85
3.2.2.5 Непрямой иммуноферментный анализ поликлональных и моноклональных фаговых частиц из комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X, обогащенной на лизоциме куриного яйца 86
3.2.2.6 Клонирование в растворимом формате АСБ L4 и L7 87
3.2.2.7 Экспрессия и выделение АСБ L4/L7 и L35Ae 10X-myc 88
3.2.2.8 Определение активности препаратов АСБ L4 и L7 методом непрямого иммуноферментного анализа 89
3.2.2.9 Сравнение устойчивости рекомбинантных АСБ L4/L7 и L35Ae 10X-myc к денатурации гуанидин гидрохлоридом 90
3.2.2.10 Сравнение склонности к олигомеризации и агрегации АСБ L4/L7 и L35Ae 10X-myc методом химического «сшивания» глутаровым альдегидом
3.2.2.11 Определение равновесных констант диссоциации АСБ L4 и L7
методом поверхностного плазмонного резонанса 90
4 Результаты и их обсуждение 92
4.1 Оптимизация структуры rWT L35Ae 92
4.1.1 Структурные свойства rWT L35Ae 94
4.1.2 Изучение взаимодействия rWT L35Ae с клеточной линией млекопитающих HEK293 101 4.1.3 Оптимизация структуры rWT L35Ae методом направленного мутагенеза с целью снижения его взаимодействия с мембранами клеток линии HEK293 и склонности к агрегации 103
4.1.4 Сравнение структурных свойств rWT L35Ae и его мутантной формы L35Ae 10X 106
4.2 Конструирование и сборка комбинаторной фаговой библиотеки вариантов
L35Ae 10X и оценка ее функциональности 109
4.2.1 Сборка и амплификация комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X 112
4.2.2 Характеризация комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X 115
4.2.3 Селекция АСБ к лизоциму куриного яйца из комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X и их характеризация 117
4.2.4 Анализ физико-химических свойств индивидуальных АСБ в растворимом формате, селектированных по сродству к лизоциму куриного яйца 1
5 Заключение 128
6 Выводы 134
7 Список основных сокращений 135
8 Список литературы 138
- Теоретическая и практическая значимость работы
- Специфично связывающие белковые молекулы и их комбинаторные библиотеки
- Клеточные линии млекопитающих
- Оптимизация структуры rWT L35Ae методом направленного мутагенеза с целью снижения его взаимодействия с мембранами клеток линии HEK293 и склонности к агрегации
Введение к работе
Актуальность работы
Незаменимым инструментом, используемым в диагностике, терапии и
лабораторных исследованиях, являются белковые молекулы, обладающие
способностью специфично связывать определенные мишени (Nygren и Skerra, 2004; Binz et al., 2005; Hosse et al., 2006; Skerra, 2007). Хотя антитела (синтетические, либо полученные путем иммунизации животных) успешно применяются для этих целей уже несколько десятилетий, они обладают рядом недостатков: крупные размеры антител ограничивают их доступ к части участков антигенов, а также сопряжены с низкой проникающей способностью; из-за сложной мульти-субъединичной структуры антител и наличия в них посттрансляционных модификаций для их наработки требуются эукариотические системы экспрессии, что приводит к высокой себестоимости антител. Эти ограничения позволяет «обойти» новая отрасль белковой инженерии, появившаяся в конце прошлого века, направленная на конструирование альтернативных связывающих белков (АСБ) на основе иммуноглобулин-подобных и неиммуноглобулиновых белковых структур, так называемых «альтернативных каркасных белков» (АКБ), или «скэффолдов» (scaffolds) (Nygren and Skerra, 2004; Binz et al., 2005; Hosse et al., 2006; Skerra, 2007).
В основе АКБ лежит сравнительно компактный стабильный белковый каркас, несущий полипептидные участки, подвергаемые генетической рандомизации для достижения широкого репертуара (105-1013) структур с нативноподобной стабильностью. Селекция из такой комбинаторной библиотеки структур, направленная на достижение максимального сродства к мишени, позволяет получать альтернативные связывающие белки (АСБ), сравнимые с антителами по сродству и селективности взаимодействия с мишенью. Простая субъединичная структура АСБ, минимальные посттрансляционные модификации и повышенная структурная стабильность позволяют эффективно нарабатывать АСБ в бактериальных системах экспрессии, обеспечивая низкую себестоимость их производства. Благодаря малым размерам АСБ они лучше проникают в здоровые и опухолевые ткани и способны взаимодействовать с эпитопами, недоступными для антител (Saerens et al., 2008), а также более селективно блокировать центры связывания отдельных лигандов в мультилигандных рецепторах. Конструирование гибридных белков из нескольких молекул одного АСБ, либо молекул АСБ, специфичных к различным мишеням, позволяет создавать мультивалентные/мультиспецифичные конструкции (Weidle et al., 2013; Jost and Pluckthun, 2014).
Привлекательные свойства АСБ объясняют появление нескольких десятков АКБ, основанных на искусственных (Boschek et al., 2009) или природных белковых структурах (Nygren and Skerra, 2004; Binz et al., 2005; Hosse et al., 2006; Skerra, 2007). К наиболее разработанным из них относят Adnectin (Koide et al., 1998; Lipovsek, 2011), Affibody (Nord et al., 1997; Lofblom et al., 2010), Anticalin (Beste et al., 1999) и DARPin (Binz et al., 2003; Tamaskovic et al., 2012). Хотя многие АКБ находятся еще на стадии разработки/испытаний, некоторые АСБ уже нашли применение в биотехнологии и биоаналитике для детекции и хроматографического разделения молекул (Skerra, 2007), в биохимических и клеточных исследованиях в качестве ингибиторов/антагонистов (Borghouts et al., 2005; Amstutz et al., 2005; Koide et al., 2002) и агентов, облегчающих кристаллизацию белков (Binz et al., 2005), а также в диагностике (Gebauer and Skerra, 2009; Skerra, 2007). Разработано несколько
терапевтических АСБ, которые в настоящее время проходят клинические испытания (Campochiaro et al., 2013; Tolcher et al., 2011). Один из АСБ (Kalbitor) уже используется для лечения острых приступов наследственного ангионевротического отёка (Williams and Baird, 2003; Lehmann, 2008; Zuraw et al., 2010).
Первые многообещающие результаты технологии АКБ показывают, что АСБ будут дополнять антитела или конкурировать с ними. По этой причине следует ожидать оптимизацию уже созданных и разработку новых АКБ. Последний вариант особенно привлекателен, поскольку он позволяет обходить уже существующие патенты, связанные с АКБ.
Поскольку создание комбинаторных библиотек на основе АКБ включает в себя экстенсивный мутагенез, способный серьезным образом нарушить структуру и стабильность белка, для конструирования АКБ подходят лишь белки, сохраняющие структурную стабильность при внесении многочисленных аминокислотных замен, делеций и вставок (Fernandez-Carneado et al., 2000; Skerra, 2000; Bloom et al., 2006). В этом отношении особенно привлекательны белки из экстремофильных организмов, обладающие структурной стабильностью, существенным образом превышающей таковую для их мезофильных аналогов (Ladenstein and Antranikian, 1998; Vieille and Zeikus, 2001; Luke et al., 2007). Некоторые из известных АКБ разработаны именно на основе белков из экстремофилов: Sso7d из Sac7d из термоацидофильных архей Sulfolobus solfataricus и Sulfolobus acidocaldarius, соответственно (Gera et al., 2011; Gera et al., 2012; Yang and Wang, 2004; Mouratou et al., 2012; Behar et al., 2013). Поскольку использование обоих белков в качестве АКБ было запатентовано, представляется перспективным создание АКБ на основе других белков из экстремофилов.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является разработка оригинального
неиммуноглобулинового альтернативного каркасного белка на основе 50S рибосомального белка L35Ae (eL33) из гипертермофильной археи Pyrococcus horikoshii. Выбор белка обусловлен рядом факторов, благоприятствующих использованию белка для разработки АКБ, включая малый размер, потенциально высокую структурную стабильность, наличие укладки цепи, не использованной ранее для создания АКБ, а также присутствию в структуре белка CDR-подобных участков. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Наработка в E. coli, выделение и физико-химическая характеризация рекомбинантного белка L35Ae дикого типа (rWT).
-
Оптимизация свойств rWT L35Ae методом точечного мутагенеза, направленная на коррекцию характеристик белка, критически важных для разработки АКБ.
-
Выбор участков оптимизированного белка L35Ae, перспективных для использования в качестве антигенсвязывающего центра белка.
-
Конструирование комбинаторной фаговой библиотеки путем рандомизации аминокислотных остатков, выбранных в качестве паратопной области оптимизированного белка L35Ae.
-
Апробация фаговой библиотеки вариантов оптимизированного белка L35Ae посредством селекции методом фагового дисплея клонов, специфичных к модельному антигену, лизоциму куриного яйца.
6. Характеризация физико-химических и функциональных свойств
полученных вариантов белка L35Ae, специфичных к лизоциму.
Научная новизна и практическая ценность исследования
В рамках представленной работы впервые были исследованы и
оптимизированы физико-химические свойства рекомбинантного 50S рибосомального белка L35Ae из гипертермофильной археи
С целью снижения сродства rWT L35Ae к поверхности клеточной линии HEK293 и склонности белка к агрегации методом рационального дизайна получена мутантная форма L35Ae 10X, сохранившая вторичную структуру и стабильность, но не проявляющая сродство к поверхности клеток HEK293, обладающая пониженной склонностью к агрегации, при повышенной предрасположенности к олигомеризации.
Впервые с применением петлевой рандомизации разработана комбинаторная фаговая библиотека вариантов L35Ae 10X с репертуаром 2108, из которой методом фагового дисплея получены два АСБ, специфичных к модельной мишени, лизоциму куриного яйца. Отобранные АСБ демонстрируют повышенную в сравнении с L35Ae 10X структурную стабильность, при возросшей склонности к агрегации.
Совокупность полученных в работе данных свидетельствует о перспективности использования белка L35Ae в качестве основы для конструирования АКБ. Поскольку белок L35Ae обладает фолдом, не использованным ранее при создании АКБ, он является оригинальным АКБ, подлежащим дальнейшей разработке и апробации с использованием других антигенраспознающих участков и более широкого спектра мишеней.
Методология и методы работы
Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной биологии (молекулярное клонирование и мутагенез), биохимии (рекомбинантная экспрессия и хроматографическое разделение белков, электрофорез белков в полиакриламидном геле, непрямой иммуноферментный анализ и т.д.) и биофизики (флуориметрия, дифференциальная сканирующая микрокалориметрия, спектроскопия кругового дихроизма и т.д.).
Положения, выносимые на защиту
-
Изучены физико-химические свойства rWT L35Ae.
-
Методом точечного мутагенеза проведена коррекция свойств rWT L35Ae, не удовлетворяющих основным характеристикам АКБ, включая склонность к агрегации и взаимодействию с поверхностью клеток HEK293.
-
Анализ консервативности первичной структуры белков L35Ae архей позволил выбрать участки аминокислотной последовательности белка L35Ae, подлежащие рандомизации с целью формирования паратопной области белка.
-
Получена комбинаторная фаговая библиотека вариантов L35Ae с рандомизированной паратопной областью.
-
Продемонстрирована функциональность полученной комбинаторной библиотеки вариантов L35Ae в ходе ее апробации на модельном антигене.
6. Полученная мутантная форма L35Ae отвечает основным требованиям, предъявляемым к АКБ, и может служить оригинальным АКБ при рандомизации CDR-подобных участков белка.
Степень достоверности и апробация результатов работы
Результаты работы опубликованы в рецензируемых научных журналах,
представлены на российских и международных конференциях, а также доложены на
расширенном семинаре Пущинского научного центра РАН.
Публикации
Результаты работы описаны в тезисах двух научных конференций и опубликованы в двух статьях в рецензируемых научных журналах (см. перечень в разделе «Список работ, опубликованных по теме диссертации»).
Структура и объем работы
Теоретическая и практическая значимость работы
Незаменимым инструментом, используемым в диагностике, терапии и лабораторных исследованиях, являются белковые молекулы, обладающие способностью специфично связывать определенные мишени. В 20 веке в качестве таких специфично связывающих белков (ССБ) применяли моноклональные и поликлональные антитела (иммуноглобулины) животных и человека. Интенсивное развитие белковой инженерии во второй половине прошлого века привело к возникновению такой отрасли биотехнологии, как инженерия рекомбинантных антител в различных форматах, в том числе, минимальных (мини-антител), а также к созданию комбинаторных библиотек мини-антител, из которых получают связывающие молекулы к различным мишеням для диагностики, терапии, тест систем и лабораторных исследований. Несмотря на большую популярность и распространенное использование, иммуноглобулины и их различные минимальные формы обладают рядом недостатков. Для получения моноклональных антител применяется довольно дорогостоящая, время- и трудо-затратная гибридомная технология; продукция рекомбинантных моноклональных антител из-за их большого молекулярного веса, сложной мульти-субъединичной структуры и обязательной посттрансляционной модификации требует дорогостоящих эукариотических систем экспрессии; крупные размеры антител ограничивают их доступ к части участков антигенов, а также сопряжены с низкой проникающей способностью; рекомбинантные мини-антитела легко экспрессируются в бактериальных системах, что значительно снижает их себестоимость, но обладают низкой структурной стабильностью, которая во многом зависит от правильности формирования внутримолекулярных дисульфидных мостиков и дополнительных стабилизирующих факторов (например, наличия в структуре константных доменов), что значительно усложняет их продуктивную наработку.
Недостатки, которыми обладают антитела, позволяет «обойти» новая отрасль белковой инженерии, появившееся в конце прошлого века, направленная на конструирование альтернативных связывающих белков (АСБ) на основе иммуноглобулин-подобных и неиммуноглобулиновых белковых структур, так называемых «альтернативных каркасных белков» (АКБ), или «скэффолдов» (scaffolds). В основе АКБ лежит сравнительно компактный стабильный белковый каркас, несущий полипептидные участки, подвергаемые генетической рандомизации для достижения широкого репертуара (105-1013) структур с нативноподобной стабильностью. Селекция из такой комбинаторной библиотеки структур, отличающихся вариабельной частью АКБ, направленная на достижение максимального сродства к мишени, позволяет получать альтернативные связывающие белки (АСБ), сравнимые с антителами по сродству и селективности взаимодействия с мишенью, но обладающие рядом преимуществ: низкой молекулярной массой (ниже, примерно, на порядок величины, характерной для антител), простой субъединичной структурой, повышенной стабильностью, отсутствием необходимости посттрансляционных модификаций и малой предрасположенностью к агрегации. Перечисленные свойства позволяют эффективно нарабатывать АСБ в бактериальных системах экспрессии, обеспечивая низкую себестоимость их производства. Благодаря малым размерам, АСБ лучше проникают в здоровые и опухолевые ткани, способны взаимодействовать с недоступными для антител эпитопами, а также более селективно блокировать центры связывания отдельных лигандов в мультилигандных рецепторах.
Эти привлекательные свойства АСБ объясняют появление нескольких десятков АКБ, основанных на искусственных (Top7) или природных белковых структурах. К наиболее разработанным из них относят Adnectin, Affibody, Anticalin и DARPin. Хотя многие АКБ находятся еще на стадии разработки/испытаний, некоторые АСБ уже нашли применение в биотехнологии и биоаналитике для детекции и хроматографического разделения молекул, в биохимических и клеточных исследованиях в качестве ингибиторов/антагонистов и агентов, облегчающих кристаллизацию белков, а также в диагностике. В настоящее время несколько терапевтических АСБ проходят клинические испытания: Angiocal (PRS-050, для лечения твердых опухолей за счет связывания VEGF-A), MP0112 (для лечения диабетического отека макулы и экссудативной формы возрастной макулярной дегенерации за счет связывания VEGF), Angiocept (CT-322/BMS-844203, для лечение твердых опухолей путем ингибирования VEGFR-2 рецептора) и т. д. Одно из лекарственных средств на основе АКБ, Kalbitor/Ecallantide, предназначенное для купирования острых приступов отёка Квинке, уже вышло на мировой рынок.
Доказанная способность АСБ дополнять антитела или конкурировать с ними делает актуальным оптимизацию существующих и разработку новых АКБ. Последний вариант особенно заманчив, так как позволяет обходить существующие патенты, связанные с АКБ.
Поскольку создание комбинаторных библиотек на основе АКБ включает в себя экстенсивный мутагенез, способный серьезно нарушить структуру и стабильность белка, для конструирования АКБ подходят лишь белки, успешно сохраняющие стабильность при внесении многочисленных аминокислотных замен, делеций и вставок. В этом отношении особенно привлекательны белковые молекулы, происходящие из экстремофильных организмов, обладающие структурной стабильностью, существенным образом превышающей таковую для их мезофильных аналогов. Некоторые из известных АКБ были разработаны именно на основе белков из экстремофилов, включая Sso7d и Sac7d из термоацидофильных архей Sulfolobus solfataricus и Sulfolobus acidocaldarius, соответственно. Поскольку использование обоих белков в качестве АКБ было запатентовано, представляется перспективным создание АКБ на основе других белков из экстремофилов.
Специфично связывающие белковые молекулы и их комбинаторные библиотеки
Жизненный цикл М13. Заражение бактериофагом М13 культуры E. coli происходит при прикреплении его белка G3P к F-пилям бактерии (Burton et al., 2001), в этом взаимодействии участвует только N2-домен G3P (Deng et al., 1999). После связывания следует втягивание F-пили до тех пор, пока бактериофаг не достигнет поверхности оболочки бактерии, далее G3P взаимодействует с мембранным белком E. coli Tol A (Riechmann and Holliger, 1997) с последующим переносом фагового генома в бактерию и разборкой фаговой частицы: белки ее оболочки встраиваются в бактериальную мембрану (Nakamura et al., 2003). Затем бактериальные ферменты переводят фаговый геном в двуцепочечную форму, начинается синтез его белков (Kehoe and Kay, 2005). После накопления фаговых белков и одноцепочечной ДНК внутри клетки-хозяина происходит сборка фаговых частиц: белки оболочки p8, p7, p9, p6 и G3P случайным образом встраиваются во внутреннюю мембрану бактерии и «дожидаются» окончания репликации одноцепочечного генома фага (Burton et al., 2001).
При достижении достаточной концентрации в клетке, белок p5 «покрывает» всю вновь синтезированную однонитевую фаговую ДНК за исключением маленькой шпильки, содержащей в себе сигнал начала паковки, тем самым предотвращая синтез второй цепи (Kehoe and Kay, 2005). В это время шпилька захватывается белковым комплексом, состоящим из p4, p11 и p1 (Marciano et al., 1999; Opalka et al., 2003), p5 отделяется от однонитевой фаговой ДНК, которая затем упаковывается в белки оболочки p8 (Feng et al., 1997), в то время, как по пять копий p7 и p9, также участвующие в инициации сборки, размещаются на конце вириона, содержащем сигнал начала паковки (Kehoe and Kay, 2005), а пять копий G3P и p6 встраиваются в капсид на противоположном конце, причем G3P принимает участие в высвобождении фаговой частицы из бактериальной клетки (Rakonjac and Model, 1998). Ввиду того, что М13 является нелитическим бактериофагом, после заражения клетка-хозяин не лизирует, а продолжает расти и делиться неопределенное время, но с меньшей скоростью, чем незараженная бактерия (Burton et al., 2001). Система фагового дисплея на основе G3P – белка оболочки бактериофага М13. Хотя для создания системы фагового дисплея возможно использование каждого из пяти белков оболочки М13 (Jespers et al., 1995; Weidanz et al., 1998; Gao et al., 1999; Hufton et al., 1999; Sioud and Hansen, 2001; Gao et al., 2002; Kwasnikowski et al., 2005), наиболее часто для этих целей применяют G3P и p8 (Iannolo et al., 1995; Hill and Stockley, 1996; Cabilly, 1999; Burton et al., 2001; Kehoe and Kay, 2005). Благодаря своей многокопийности, белок p8 позволяет создавать систему поливалентного фагового дисплея (Kang et al., 1991; Kretzschmar and Geiser, 1995), в то время как минорный белок оболочки G3P является хорошей платформой для системы моновалентного дисплея, позволяющей отбирать высоко аффинные ССБ (Hoogenboom et al., 1998; Hoogenboom and Chames, 2000). Выбор той или иной платформы зависит от стратегии и целей селекции.
Рассмотрим подробно систему фагового дисплея на основе белка G3P M13, которую можно осуществлять в виде двух основных подходов. В первом случае ген, кодирующий ССБ, «сшивают» с геном G3P, и клонируют напрямую в геном бактериофага M13, в результате чего каждый белок G3P, представленный на поверхности бактериофага, будет химерным, связанным с ССБ (McCafferty et al., 1990). Такая система поливалентна и чаще всего используется для дисплея коротких пептидов, не влияющих на основные функции G3P (Burton et al., 2001; Kehoe and Kay, 2005; Sergeeva et al., 2006). Во втором случае происходит разделение экспрессии химерного белка G3P-ССБ и собственных белков бактериофага: ДНК-фрагмент, кодирующий ССБ, клонируют в вектор, основными элементами которого являются сайт начала репликации, сигнал паковки, ДНК-последовательность, кодирующая G3P, расположенная за полилинкером для клонирования гена ССБ. Такой вектор называется фагмидой. Данный подход позволяет упростить амплификацию комбинаторной библиотеки и получать более стабильные рекомбинантные конструкции G3P-ССБ (Schirrmann et al., 2011). В этом случае исследователь имеет дело с моновалентным фаговым дисплем (Sergeeva et al., 2006).
Фагмида может быть доставлена в клетки E. coli при помощи обычных методов трансформации, но для дальнейшей ее упаковки в рекомбинантную фаговую частицу M13 требуется бактериофаг-помощник/фаг-помощник (Barbas et al., 1991; Breitling et al., 1991; Clackson et al., 1991; Hoogenboom et al., 1991), в геноме которого закодированы все белки, необходимые для репликации фагмиды, наработки и упаковки однонитевой фаговой ДНК, а также полной сборки и секреции бактериальной клеткой-хозяином собранных фаговых частиц, за исключением G3P, и дефектный сайт начала репликации, что обеспечивает приоритетную упаковку в фаговую частицу именно фагмиды (Sergeeva et al., 2006). Применение системы фагмида/фаг-помощник позволяет получить пул рекомбинантных бактериофагов, несущих на своей поверхности химерные белки G3P-ССБ, и содержащих фагмиды, кодирующие эти ССБ, – так называемую фаговую комбинаторную библиотеку ССБ.
Для in vitro селекции из комбинаторной библиотеки ССБ (рис. 4) мишень иммобилизуют на твердой подложке (нитроцеллюлозной мембране (Hawlisch et al., 2001), магнитных шариках (Moghaddam et al., 2003), в колонке на носителе (Breitling et al., 1991), пластиковых поверхностях, например, в полистирольных тюбах (Hust et al., 2002) или 96-луночных планшетах (Barbas et al., 1991) и инкубируют с фаговой комбинаторной библиотекой ССБ. При этом можно варьировать физические (температуру, время), химические (pH, ионная сила) и биологические (конкурентное связывание) параметры взаимодействия с целью отбора ССБ, связывающих мишень при заданных условиях. Фаги, представляющие слабо- или не связывающиеся с антигеном ССБ, удаляются при помощи отмывок; фаговые частицы, несущие на своей поверхности ССБ, специфично взаимодействующие с мишенью, элюируются (при помощи трипсина, изменения pH и т. д.), с последующим заражением ими культуры E. coli, которая затем ко-инфицируется бактериофагом-помощником, в результате чего происходит наработка рекомбинантных бактериофагов, экспрессирующих ССБ, специфичные к мишени. Обогащенная таким образом библиотека применяется для новых раундов селекции: обычно 2-3, а иногда и 6 раундов селекции необходимо для достаточного обогащения фаговой комбинаторной библиотеки ССБ на мишени (Schirrmann et al., 2011). Индивидуальные ССБ из обогащенной библиотеки нарабатывают, выделяют с дальнейшим анализом их свойств (Winter and Milstein, 1991; Winter et al., 1994; Hoogenboom, 2005; Hust et al., 2007; Buckler et al., 2008).
Клеточные линии млекопитающих
Используя различные методы селекции (Kim et al., 2005), из комбинаторных библиотек мини-антител можно отбирать ССБ с заданными свойствами к определенным мишеням: гаптенам (Kobayashi et al., 2005), молекулам белков (Dai et al., 2003; Guo et al., 2003), углеводов (Ravn et al., 2004; Sakai et al., 2007), рецепторам (Galeffi et al., 2006), онкомаркерам (Shadidi and Sioud, 2001; He et al., 2002), вирусам (Hu et al., 2005) и т. д., – для последующего применения в терапии (в виде иммунотоксинов, получаемых путем их «сшивания» с цитотоксичными белками (Chowdhury et al., 1998), для адресной доставки радионуклидов (радионуклидная терапия) и лекарственных средств (Chari, 1998; Liu et al., 1998), а также генов (Ahmad et al., 2012) для генной терапии (Nakamura et al., 2005) и т.д.), диагностике, тест-системах и визуализации (Holliger and Hudson, 2005). Таким образом были получены биспецифичные мини-антитела к CD3 T-клеточныму ко-рецептору, индуцирующие концентрирование цитотоксических T-клеток в месте локализации опухоли. Продемонстрирована успешность применения этих мини-антител in vivo на животных моделях (Kipriyanov and Le Gall, 2004). Получены также мини-антитела, связывающиеся с CD16, с последующей активацией естественных киллеров и абляцией опухоли (Schlenzka et al., 2004).
Альтернативной стратегией локальной активации иммунной системы является создание химерных конструкций мини-антитело-суперантиген T/B-клеток (например, энтеротоксин Peptostreptococcus magnus белок L, PpL). Так, было показано, что scFv-PpL активирует эффекторные функции иммунной системы (Enever et al., 2005). Создан рекомбинантный ретровирус, несущий на своей поверхности мини-антитело scFv, специфичное к карциноэмбриональному антигену (CEA), и содержащий в своем геноме ген синтазы окиси азота, – такая ретровирусная частица специфично связывается и уничтожает раковые клетки, экспрессирующие CEA (Kuroki et al., 2000). Мини-антитела, связанные с липосомами, загруженными цитотоксичными лекарственными веществами, применяются для адресной доставки к опухолевым клеткам с их последующей абляцией (Brignole et al., 2004; Schnyder and Huwyler, 2005).
Химерные конструкции мини-антитело-фермент нашли применение в ферментно-пролекарственной терапии: в данном случае фермент направленно доставляется к предшественнику лекарственного вещества и осуществляет его активацию (Holliger and Hudson, 2005). Мини-антитела в различных форматах используются в иммунологических реакциях и ИФА (в виде химерных белков мини-антитело–фермент (Luka et al., 2011; Winter et al., 1994), и так называемых fluobodies – химерный белок мини-антитело–флуоресцентный белок (Griep et al., 1999; Morino et al., 2001), а также для визуализации ангиогенеза и атеросклеротических бляшек (Brack et al., 2004; Matter et al., 2004) и т. д. Существует ряд биосенсорных и микротестовых систем анализа, основанных на использовании мини-антител (Holliger and Hudson, 2005).
На сегодняшний день около 54 мини-антител находятся в клинической разработке, а 38 проходят доклинические испытания (Nelson and Reichert, 2009): Abciximab – Fab-фрагмент химерного антитела к гликопротеину тромбоцитов IIb/IIIa применяется для предотвращения тромбоза во время катетеризации артерий при инфаркте миокарда; Ranibizumab – человеческий Fab-фрагмент к фактору роста эндотелия сосудов А используется для лечения неоваскулярной (влажной) возрастной макулярной дегенерации; Efungumab/Mycograb – scFv, связывающий белок теплового шока Candida albicans, находится во второй фазе клинических испытаний (Nelson 2010); Blinatumomab – анти-CD19/anti-CD3 биспецифичный тандемный scFv способствует усилению ответов Т-клеток на В-клеточную неходжкинскую лимфому, находится во второй фазе испытаний (Dreier et al., 2002); Bispecific T-cell Engagers (BiTE) – два биспецифичных тандемных scFv для детекции онкологических заболеваний (Chames and Baty, 2009); MT110 – анти-EP-CAM/анти-CD3 биспецифичный тандемный scFv, способствующий усилению иммунного ответа T-клеток на твердые опухоли (Offner et al., 2006) и т. д.
Около 24 конъюгированных мини-антител также находятся на стадии клинических испытаний (Nelson 2010): Metuximab-131I – мышиный анти-CD147 F(ab)2, конъюгированный с 131I, применяется для лечения рака печени в Китае; анти-5T3 Fab, конъюгированный со стафилококковым энтеротоксином А (SEA), используется для стимуляции иммунной системы при лечении рака легких, находится на третей стадии клинических испытаний; VB4-845/Vicinium – анти-EpCAM scFv, конъюгированный с экзотоксином PE-38 Pseudomonas aeruginosa, применяется для лечения рака мочевого пузыря, находится на второй стадии клинических испытаний (Nelson, 2010) и т. д. Несмотря на широкое распространение, применение мини-антител имеет ряд ограничений:
1. Стабильность мини-антител зависит от внутридоменных дисульфидных связей (Worn and Pluckthun, 2001), которые не могут формироваться в восстанавливающей среде цитоплазмы E. сoli, что усложняет их рекомбинантную наработку.
2. Устройство из двух различных полипептидных цепей, тяжелой и легкой, (для малых Fv-фрагментов) опосредует нестабильную ассоциацию доменов белка, а также усложняет клонирование для последующей экспрессии (Skerra, 2007).
3. При переводе мини-антител в более крупные форматы (при слиянии с другими белками, подверженными агрегации, или в мультимеры), а также в полноразмерные IgG (для применения в терапии) недопустима их низкая биофизическая стабильность (Binz et al., 2005; Tamaskovic et al., 2012). Кроме того, сворачивание некоторых таких химерных конструкций в цитоплазме бактерий происходит неэффективно, поэтому для них требуются эукариотические системы экспрессии (de Graaf et al., 2002);
4. Наличие Fc-фрагмента (в случае Fab) опосредует эффекторные функции, что недопустимо при применении таких мини-антител в фармацевтике, так как приводит к нежелательным последствиям (Skerra, 2007).
5. Сложности, связанные с патентованием и правами собственности на технологии по производству и применению мини-антител (Binz et al., 2005).
Комбинаторные библиотеки, созданные на основе альтернативных каркасных белков, являются новым источником ССБ, не обладающих ограничениями и недостатками, характерными для антител и их фрагментов.
Оптимизация структуры rWT L35Ae методом направленного мутагенеза с целью снижения его взаимодействия с мембранами клеток линии HEK293 и склонности к агрегации
Прежде всего, методом КД в дальней ультрафиолетовой области было показано, что содержание элементов вторичной структуры L35Ae 10X соответствует белку дикого типа (таблица 3).
Для сравнения стабильности трёхмерной структуры rWT L35Ae и L35Ae 10X использовали методы ДСК и спектрофлуориметрии. Как видно из рис. 14А, температурная зависимость избыточной удельной теплоемкости, полученная в ходе ДСК-измерений для L35Ae 10X, эквивалентна таковой для rWT L35Ae: наблюдается лишь один пик теплопоглощения с максимумом T0=90С. Процесс перехода L35Ae 10X из нативного в денатурированное состояние при плавлении также, как и для rWT L35Ae, является необратимым (данные не приведены).
Несмотря на то, что оба L35Ae одинаково термостабильны, L35Ae 10X обладает сниженной устойчивостью к разворачиванию GuHCl: в результате измерения зависимости изменения нормализованной интенсивности триптофановой флуоресценции препаратов L35Ae на 314 нм от концентрации GuHCl показано, что для L35Ae 10X величина [GuHCl]1/2 снижена по отношению к rWT L35Ae на 0,6 M ([GuHCl]1/2=2,0 M; рис. 14Б, таблица 3). Полученные результаты согласуются с данными сравнения зависимости изменения max от концентрации GuHCl: в этом случае середина перехода из нативного в денатурированное состояние для L35Ae 10X достигается при 2,2 M GuHCl, что также на 0,7 M ниже, чем у rWT L35Ae (вкладка рис. 14Б).
Пониженная устойчивость L35Ae 10X к воздействию GuHCl, по-видимому, является следствием большей оптимизации заряд-зарядовых взаимодействий в мутантном белке (рис. 18Б, 19Б-В), что может увеличивать восприимчивость структуры белка к дестабилизирующему действию заряженных молекул GuHCl. Хотя величина [GuHCl]1/2 для L35Ae 10X ниже таковых для АКБ Sso7d и Sac7d (таблица 4) (Gera et al., 2011; McCrary et al., 1996) и некоторых других АКБ, она превышает величину [GuHCl]1/2=1,5 M, характерную для минимального антитела в формате scFv (Worn and Pluckthun, 1999; Gera et al., 2011). Таким образом, мутантная форма L35Ae 10X сохранила структурную стабильность на уровне, достаточном для применения белка в качестве АКБ.
Сравнение rWT L35Ae и L35Ae 10X по их склонности к олигомеризации и агрегации проводили методами ДРС, химического «сшивания» глутаровым альдегидом и гель-фильтрационной хроматографии высокого разрешения. В ходе ДРС-измерений показано, что в распределении L35Ae 10Х по мультимерным формам наблюдается единственный пик с гидродинамическими радиусами в диапазоне 2-7 нм, что соответствует формам белка от мономера до 20-мера со средней степенью олигомеризации белка, равной 6,3±0,5. Таким образом, препарат L35Ae 10X не содержит агрегатов, свойственных rWT L35Ae, но более склонен к олигомеризации (рис. 15А, таблица 3). Аналогичные результаты получены в ходе экспериментов по «сшиванию» нефильтрованных препаратов L35Ae 0,05% глутаровым альдегидом (рис. 16, таблица 5): по сравнению с rWT L35Ae, раствор L35Ae 10X содержит меньше фракций, соответствующих мономерам и олигомерам, не входящим в разделяющий ПААГ, но больше олигомеров с молекулярными массами 30-100 кДа. Увеличенная склонность к олигомеризации L35Ae 10X была также подтверждена в ходе гель-фильтрационной хроматографией высокого разрешения (рис. 15Б): значение кажущейся молекулярной массы препарата L35Ae 10X превышает таковую для rWT L35Ae (15 кДа и 13 кДа, соответственно).
В целом, несмотря на увеличенную у L35Ae 10X, по сравнению с rWT L35Ae, долю гидрофобной ЭРПБ (таблица 6), мутантный белок менее подвержен агрегации, но в большей степени склонен к олигомеризации (таблицы 3, 5). Это явление можно объяснить радикальным снижением суммарного заряда структуры L35Ae в ходе мутагенеза (рис. 18, таблица 6), что привело к понижению электростатического отталкивания между молекулами мутантного белка и, как следствие, меньше препятствовало их олигомеризации.
Из сравнения физико-химических свойств rWT L35Ae и его мутантной формы 10X, можно заключить, что оба белка обладают одинаковой вторичной структурой и сходной стабильностью третичной структуры, однако L35Ae 10X менее предрасположен к агрегации при большей склонности к олигомеризации, а также не взаимодействует с поверхностью клеток HEK293. Характеристики L35Ae 10X в целом находятся на уровне запатентованных АКБ экстремофильного происхождения Sso7d и Sac7d (таблица 4), поэтому для дальнейшего изучения возможности применения L35Ae 10X в качестве АКБ производили конструирование комбинаторной фаговой библиотеки вариантов L35Ae 10X и оценку функциональности библиотеки.