Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 33
1.1 Структурно-функциональная организация хроматина 33
1.1.1 Уровни упаковки эукариотической ДНК 33
1.1.2 30-нм фибрилла 34
1.1.3 Активный хроматин и гистоновый код 39
1.1.4 Создание областей, свободных от нуклеосом, на регуляторных элементах ДНК 41
1.1.5 Декомпактизация хроматина и доступность ДНК 48
1.1.6 Хроматиновые домены в трехмерном пространстве ядра 50
1.2 Коммуникация удаленных регуляторных элементов генома 52
1.2.1 Сближение промоторов и энхансеров: активаторный хроматиновый блок и экспрессионный центр 52
1.2.2 Стабильность промотор-энхансерного взаимодействия: динамический контакт или прочный комплекс? 57
1.2.3 Движущие силы коммуникации в клеточном ядре 61
1.2.4 Свободная диффузия и макромолекулярное скопление 78
1.3 Функциональная компартментализация клеточного ядра 81
1.3.1 Хромосомные территории 84
1.3.2 Ядерный матрикс 87
1.3.3 Ламино- и ядрышко-ассоциированные домены 90
1.3.4 Функциональные ядерные компартменты 1.4 Взаимосвязь между компартментализацией ядра и пространственной организацией хромосом 106
1.5 Заключительные замечания 114
Глава II. Материалы и методы 115
II.1 Работа с клеточным материалом 115
II.1.1 Ведение клеточных культур 115
II.1.2 Индукция эритроидной дифференцировки клеток HD3 115
II.1.3 Выделение эмбриональных эритроидных клеток и фибробластов кур 115
II.1.4 Выделение эмбриональных эритроидных клеток и клеток мозга мыши 116
II.1.5 Получение Ter119+ и Ter119– клеток мыши 116
II.1.6 Окрашивание клеток бензидином для выявления гемоглобина 117
II.2 Работа с ДНК и РНК 117
II.2.1 Выделение геномной ДНК из эукариотических клеток 117
II.2.2 Выделение бакмидной ДНК из клеток E. сoli 118 II.
2.3 Приготовление эквимолярной смеси продуктов лигирования на основе бакмиды 119
II.2.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле 119
II.2.5 Выделение тотальной РНК из эукариотических клеток 120
II.2.6 Обратная транскрипция-ПЦР 121
II.2.7 Флуорометрическое измерение концентрации нуклеиновых кислот 122
II.3 Полимеразная цепная реакция 122
II.3.1 Простая жидкостная ПЦР 122
II.3.2 ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами
II.4 Клонирование 123
II.5 3С-анализ
II.5.1 Фиксация клеток и изоляция ядер 123
II.5.2 Рестрикция и лигирование ДНК 124
II.5.3 Очистка продуктов лигирования 125
II.5.4 Количественный анализ продуктов лигирования 125
II.6 M3C-анализ 127
II.6.1 Выделение нуклеоидов 127
II.6.2 Получение ядерных матриксов и лигирование ямДНК 128
II.6.3 Количественный анализ продуктов лигирования 129
II.7 INGRID-анализ 130
II.7.1 Получение сшитых фрагментов хроматина 130
II.7.2 ПЦР в геле 131
II.8 4C-анализ 133
II.8.1 Фиксация клеток, первичная рестрикция и лигирование 133
II.8.2 Вторичная рестрикция, лигирование и третичная рестрикция 134
II.8.3 Амплификация продуктов лигирования 134
II.8.4 Подготовка 4С-библиотек для секвенирования 135
II.8.5 Биоинформатический анализ 4C-данных 1 II.9 ChIP-seq 138
II.10 Иммуноцитохимия 139
II.11 Флуоресцентная гибридизация in situ 141
II.12 Электронная микроскопия 142
II.13 Иммуноблотинг белков и окрашивание Кумасcи 142
II.14 Программное обеспечение 143
II.15 Последовательности праймеров и флуоресцентных проб для ПЦР 144
Глава III. Результаты 155
III.1 Структура индивидуальных активаторных хроматиновых блоков 155
III.1.1 Активаторный хроматиновый блок домена бета-глобиновых генов кур 155
III.1.2 Объединенный активаторный хроматиновый блок альфа-глобиновых генов и гена TMEM8 166
III.2 Механизмы контактов удаленных регуляторных элементов генома 173
III.2.1 Переосмысление процедуры 3С: лигирование в ядре, а не в растворе 173
III.2.2 Абсолютные частоты лигирования в процедуре 3С 193
III.2.3 Количественный анализ взаимодействия удаленных элементов генома с помощью метода молекулярных колоний 201
III.2.4 Изучение роли ядерного матрикса в поддержании контактов удаленных элементов генома 228
III.3 Механизмы поддержания трехмерной организации генома 241
III.3.1 Полногеномный анализ пространственных взаимодействий СpG-островков,
содержащих промоторы генов домашнего хозяйства 241
Глава IV. Обсуждение результатов 265
IV.1 Пространственная организация домена бета-глобиновых генов кур в эритроидных клетках на разных стадиях эмбрионального развития 265
IV.2 Регуляция транскрипции альфа-глобиновых генов и гена TMEM8 посредством сборки альтернативных активаторных хроматиновых блоков 271
IV.3 Пересмотр ключевых этапов техники фиксации конформации хромосомы и предложение новой модели позиционирования геномных элементов в ядре 274
IV.4 Абсолютные частоты лигирования в процедуре 3С 284
IV.5 Выявление прямых контактов между геномными элементами методом молекулярных колоний 287
IV.6 Ядерный матрикс как платформа для взаимодействия удаленных регуляторных элементов генома 291
IV.7 Кластеризация CрG-островков как важный фактор пространственной организации интерфазных хромосом 298
Заключение 303
Выводы 307
Список литературы
- Сближение промоторов и энхансеров: активаторный хроматиновый блок и экспрессионный центр
- Окрашивание клеток бензидином для выявления гемоглобина
- Объединенный активаторный хроматиновый блок альфа-глобиновых генов и гена TMEM8
- Регуляция транскрипции альфа-глобиновых генов и гена TMEM8 посредством сборки альтернативных активаторных хроматиновых блоков
Введение к работе
Актуальность проблемы. Активация транскрипции генов – это многоступенчатый процесс, включающий привлечение к промотору гена комплекса белков базальной транскрипции в совокупности с изменением структуры хроматина – ремоделированием нуклеосом и посттрансляционными модификациями гистонов. Энхансеры и области контроля локуса, удаленные от контролируемых ими генов, привлекают белковые комплексы, осуществляющие эти изменения, и, в ряде случаев, рекрутируют РНК-полимеразу II. Вопрос, каким образом удаленные регуляторные элементы генома взаимодействуют с подконтрольными генами, изучается достаточно давно, но и в настоящее время остается дискуссионным. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что активирующее действие энхансеров связано с формированием доменов модифицированных гистонов и осуществляется через посредство прямого контакта энхансеров и промоторов генов с выпетливанием разделяющего участка ДНК. Доказательства модели выпетливания получены с использованием метода фиксации конформации хромосомы 3C (chromosome conformation capture). В пионерской работе по 3С-анализу было показано, что активные бета-глобиновые гены физически взаимодействуют в ядерном пространстве с многочисленными цис-регуляторными элементами, что послужило основанием для модели активаторного хроматинового блока регуляторных элементов, иначе – хроматинового хаба (Tolhuis et al., 2002). Согласно этой модели, формирование активаторного хроматинового блока обеспечивает корректную экспрессию генов и требует присутствия белковых факторов, обладающих афинностью друг к другу и связывающихся с соответствующими участками на ДНК.
Развитие методов высокопроизводительного секвенирования сделало возможным создание панели так называемых С-методов, позволяющих проводить анализ пространственных взаимодействий удаленных последовательностей ДНК в полногеномном масштабе. С использованием метода HiC были открыты общие принципы укладки интерфазного генома. Было установлено, что хромосомы млекопитающих и дрозофилы организованы иерархически. В масштабе миллионов пар нуклеотидов хромосомы компартментализуются с образованием активного и неактивного компартментов. В более мелком масштабе хромосомы подразделяются на топологически-ассоциированные домены, которые, по всей видимости, представляют собой хроматиновые глобулы (Gibcus and Dekker, 2013). Было показано, что организация хромосом в серию топологически-ассоциированных доменов отличается эволюционной консервативностью и независимостью от типа клеток. В то же время, механизмы, ответственные за пространственную сегрегацию активных и неактивных участков генома, и принципы организации топологически-ассоциированных доменов остаются неясными.
В других исследованиях с использованием С-методов были обнаружены специфичные для клеточных типов взаимодействия генов и удаленных регуляторных элементов, реализующиеся в масштабе целого генома. Было показано, что на уровне пространственной организации генома могут регулироваться различные процессы: от активации и репрессии транскрипции и геномного импринтинга (Misteli, 2007) до клеточного старения (Chandra et al., 2015) и циркадных ритмов (Aguilar-Arnal et al., 2013). Однако приходится констатировать, что большинство исследований в области пространственной организации генома носят аннотационный характер.
Получаемая статичная картина пространственной организации генома позволяет установить взаимное расположение регуляторных элементов генома, подтвердить или опровергнуть роли уже картированных регуляторных элементов, однако аспекты механики взаимодействия геномных элементов, природа этих взаимодействий, их частота и стабильность остаются не выясненными. Хотя модель активаторного хроматинового блока в научном сообществе общепринята, она остается лишь гипотезой, потому что метод 3С позволяет анализировать лишь попарные взаимодействия геномных элементов и с его помощью в принципе невозможно продемонстрировать существование многокомпонентных комплексов, включающих более двух фрагментов ДНК. Более того, метод 3С и другие методы, основанные на принципе лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК в клеточном ядре, не дают возможности подсчитать долю клеток, в которых изучаемые последовательности ДНК расположены в пространственной близости. Наконец, как и любой биохимический подход, метод 3С позволяет получить лишь усредненную картину того, что происходит в различных клетках, присутствующих в популяции. Все это определяет актуальность настоящего исследования, направленного на изучение функционально-зависимой архитектуры эукариотического генома и расширение методической базы для исследований в области пространственной организации генома.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизмов взаимодействия удаленных регуляторных элементов генома и выяснение роли этих взаимодействий в регуляции экспрессии генов. Особое внимание в работе было уделено доработке и оптимизации существующего протокола 3С-метода, а также созданию новых методов изучения пространственной организации генома, преодолевающих внутренние ограничения метода 3С и его производных.
Для достижения этих целей в работе были поставлены следующие задачи:
1. С использованием метода 3С охарактеризовать пространственную организацию геномных
доменов открытого и закрытого типов на примере доменов альфа- и бета-глобиновых генов.
Изучить молекулярные механизмы активации транскрипции глобиновых и ряда других генов
удаленными энхансерными элементами. Исследовать механизмы переключения программы транскрипции глобиновых генов в ходе эмбрионального развития.
-
Провести анализ основных этапов метода 3С и изучить механизм предпочтительного лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК в этой экспериментальной процедуре. Изучить механизмы поддержания пространственной близости удаленных элементов генома в клеточном ядре.
-
Разработать технику количественного анализа абсолютных частот лигирования в процедуре 3С и оценить действительные частоты взаимодействия удаленных регуляторных элементов in vivo.
-
На основании метода молекулярных колоний разработать метод прямого анализа комплексов геномных элементов, не использующий процедуру лигирования и основывающийся на амплификации фрагментов ДНК в геле. С использованием этого метода проанализировать возможность сборки нескольких элементов в единый комплекс и проверить справедливость модели активаторного хроматинового блока. Оценить частоту сборки элементов ДНК в единый комплекс и определить стабильность взаимодействия элементов в составе комплекса.
-
Разработать метод анализа пространственной близости фрагментов ДНК, связанных с ядерным матриксом. Изучить возможную роль ядерного матрикса во взаимодействии удаленных элементов генома и пространственной организации протяженных участков ДНК.
-
С использованием метода 4С провести полногеномный анализ пространственных взаимодействий промоторов генов домашнего хозяйства. Изучить особенности организации генов домашнего хозяйства и тканеспецифичных генов в общие транскрипционные фабрики для осуществления скоординированной транскрипции.
Научная новизна работы. Использование в настоящей работе широкого спектра методов
и модельных систем позволило нам уточнить механизмы пространственного взаимодействия
удаленных регуляторных элементов генома, а также исследовать движущие силы
позиционирования геномных элементов в клеточном ядре и выявить факторы, определяющие
специфическую пространственную организацию интерфазных хромосом. В работе исследованы
молекулярные механизмы, контролирующие экспрессию тканеспецифичных генов, предложены
новые модели активации генов удаленными регуляторными элементами, изучена
пространственная организация транскрипционного аппарата в клеточном ядре. С использованием
принципиально новых подходов для изучения пространственных взаимодействий удаленных
регуляторных элементов генома (INGRID и M3C) были значительно расширены и уточнены
существующие представления о механизмах работы эукариотических энхансеров и принципах
формирования функционально-зависимой пространственной организации генома. В работе
уточнен принцип работы метода фиксации конформации хромосомы (3С). Продемонстрировано, что один из основных постулатов, положенных в основу данной экспериментальной процедуры, является неверным. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости переосмысления результатов исследований, проведенных с использованием метода 3С другими авторскими коллективами. В частности, наши результаты показывают, что простраственная организация генома в клеточном ядре является чрезвычайно динамичной: фактически постоянно происходит перебор различных вариантов, некоторые из которых временно фиксируются посредством дополнительных взаимодействий между связанными с регуляторными элементами генома белками.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Настоящая работа является существенным шагом вперед на пути к пониманию, каким образом пространственная архитектура генома связана с его функционированием. В работе показано, что пространственная организация ДНК является важным фактором регуляции экспрессии генов высших эукариот. Вместе с тем, работа представляет интерес и с практической точки зрения: новые знания о механизмах, контролирующих экспрессию генов, могут быть с успехом использованы в медицине и биотехнологии. В более узком плане работа значима еще и потому, что раскрывает ряд важных особенностей регуляции экспрессии именно глобиновых генов, нарушения в функционировании которых вызывают тяжелые заболевания человека и хозяйственно-важных домашних животных.
Положения и результаты, выносимые на защиту
-
Домен бета-глобиновых генов кур имеет сложную пространственную организацию в эритроидных клетках, предполагающую возможность сближения промоторов глобиновых генов с удаленными энхансерными элементами. Пространственная организация домена отличается в клетках различного происхождения и на разных этапах эмбрионального развития. При этом корреляция между транскрипционной активностью индивидуальных глобиновых генов и их привлечением к активаторному комплексу не является абсолютной.
-
Транскрипция альфа-глобиновых генов кур и эритроидспецифичного гена TMEM8, локализованного за кластером альфа-глобиновых генов, регулируется за счет сборки альтернативных активаторных комплексов, в составе которых имеются как общие, так и специфичные регуляторные элементы.
-
Для поддержания взаимного позиционирования удаленных регуляторных элементов генома важно сохранение целостности клеточного ядра. Стадия рестрикции и лигирования в экспериментальном протоколе метода 3С осуществляется внутри ядра, а не в растворе после
лизиса клеток, как предполагалось ранее. Для активации транскрипции гена существенно сближение промотора и удаленных регуляторных элементов в одном функциональном компартменте, где они не обязательно объединены в единый регуляторный комплекс.
-
Разработанная нами количественная техника позволяет определять абсолютный выход продуктов лигирования в процедуре 3С-анализа. Низкие частоты лигирования фрагментов, предположительно входящих в состав одного активаторного хроматинового блока, свидетельствуют о низкой частоте прямого взаимодействия регуляторных элементов ДНК in vivo.
-
Разработанный новый подход для изучения пространственных взаимодействий удаленных регуляторных элементов генома (метод INGRID), основанный на амплификации в геле фрагментов ДНК, выделенных из фиксированных клеток, демонстрирует, что в большинстве клеток, экспрессирующих глобиновые гены, промоторы глобиновых генов и их энхансерные элементы не организованы в единый ДНК-белковый комплекс.
-
Созданная нами экспериментальная процедура (метод М3С) позволяет исследовать вопрос о пространственной сближенности прикрепленных к ядерному матриксу фрагментов ДНК. Связанные с ядерным матриксом промоторы ряда генов домашнего хозяйства, расположенных во фланкирующих областях домена альфа-глобиновых генов кур, образуют единый комплекс на ядерном матриксе и составляют основу транскрипционной фабрики.
-
CpG-островки, ассоциированные с промоторами генов домашнего хозяйства и участками начала репликации ДНК, взаимодействуют в пространстве ядра в масштабе всего генома, что является одним из факторов, определяющих специфическую пространственную организацию интерфазных хромосом, в том числе сегрегацию активного и неактивного хроматиновых компартментов.
Степень обоснованности и достоверности результатов и выводов работы. Работа выполнена на высоком методическом уровне; научные результаты, изложенные в диссертационной работе, основаны на экспериментальных данных, полученных с использованием новейших методических подходов. Достоверность результатов определяется использованием современного оборудования, отработанных методов обработки и анализа данных и подтверждается высокой воспроизводимостью результатов. Выводы, полученные в ходе работы, обоснованы и соответствуют целям и задачам исследования.
Личный вклад автора. Большинство экспериментальных данных получено автором лично. Ему принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. Эксперименты по использованию метода молекулярных колоний для
анализа частоты взаимодействия между удаленными геномными элементами проведены в сотрудничестве с А.Б Четвериным и Е.В. Четвериной. Электронно-микроскопический анализ выполнен при участии И.И. Киреева. Работы по секвенирование 4С-библиотек проведены в сотрудничестве с М.Д. Логачевой. Биоинформатический анализ 4С-данных осуществлен при участии А.В. Артемова.
Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на международных и отечественных научных конференциях, конгрессах и симпозиумах: Workshop «Protein-nucleic acid interactions» of the International Research Training Group 1384 (Вильнус, Литва, 2010); International Symposium «Control of gene expression and cancer» (Москва, 2010); Symposium «Enzymes and multienzyme complexes acting on nucleic acids» (Гессен, Германия, 2010); International Symposium «Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies» of Transregional Collaborative Research Centre 81 (Гессен, Германия, 2011); EMBO Conference «Nuclear Structure and Dynamics» (Л'Иль-сюр-ла Сорг, Франция, 2011, 2013); Международной конференции «Хромосома 2012» (Новосибирск, 2012); Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology «Genomic Instability and DNA Repair» (Банф, Канада, 2013); 38-th FEBS Congress «Mechanisms in biology» (Санкт-Петербург, 2013); FEBS EMBO Conference (Париж, Франция, 2014).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 52 печатные работы: 34 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ по биологии (из них 29 в изданиях Web of Science), и 18 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 385 страницах, содержит 68 рисунков, 16 таблиц и состоит из введения, 4-х глав, заключения и выводов. Список использованной литературы включает 697 наименований.
Сближение промоторов и энхансеров: активаторный хроматиновый блок и экспрессионный центр
В соответствии с современной парадигмой, расположение промоторов и энхансеров в ядре в пространственной близости является необходимым условием активации транскрипции соответствующих генов в клетках нужного типа и на нужной стадии развития (Gorkin et al., 2014). Однако сущность общеиспользуемого термина «пространственная близость» (равно как и терминов «контакты удаленных элементов генома», «дальние взаимодействия в хроматине» и т.п.) остается пока не ясной. В исследованиях, проведенных за последние 15 лет, накоплено большое количество экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что значительные геномные расстояния между промоторами и выше- или нижележащими регуляторными элементами компенсируется за счет сближения этих элементов в ядерном пространстве путем выпетливания расположенных между ними фрагментов хроматиновой фибриллы. Пространственную близость удаленных элементов генома можно регистрировать с использованием методов фиксации конформации хромосомы (chromosome conformation capture, 3С) (de Wit and de Laat, 2012) или многоцветной флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) (Amano et al., 2009). Наиболее популярная структурная модель постулирует, что регуляторные элементы ДНК и подконтрольные промоторы образуют общий ДНК-белковый комплекс – активаторный хроматиновый блок, или хаб, как его именуют в англоязычной литературе (de Laat and Grosveld, 2003), – стабилизируемый прямым контактом между транскрипционными факторами, компонентами комплекса Mediator (Kagey et al., 2010) и особыми «коммуникационными белками», связанными с промотором и энхансером (Maksimenko and Georgiev, 2014) (рис. 3). Отметим, что в настоящее время отсутствуют прямые доказательства существования подобных комплексов, однако некоторые экспериментальные данные косвенно поддерживают модель активаторного хроматинового блока. Так, ранние электронно-микроскопические исследования реконструированных in vitro комплексов общего транскрипционного фактора Sp1 c ДНК указывают на то, что этот транскрипционный фактор, связывающийся и с промоторами, и с энхансерами, может организовывать ДНК в петли и связывать две отдельные молекулы ДНК друг с другом посредством собственной олигомеризации при сохранении контакта с ДНК (Li et al., 1991; Su et al., 1991). Похожие наблюдения были
Классическая модель промотор-энхансерной коммуникации. Энхансер (E) и промотор (P) организованы в общий ДНК-белковый комплекс, стабилизированный прямым взаимодействием между транскрипционными факторами и «коммуникаторными белками», связанными с геномными элементами (фигуры в центре). сделаны и для инсуляторного белка GAGA (GAF) дрозофилы (Mahmoudi et al., 2002). GAF, связанный с одиночными молекулами ДНК, способен объединять их в общий ДНК-белковый комплекс путем мультимеризации, которая опосредуется POZ-доменом белка. Схожим образом лимфоцито-специфичный OCA-B-зависимый энхансер, включенный в состав плазмиды, способен активировать подконтрольный промотор гена Igh, расположенный на другой плазмиде, посредством прямого контакта между энхансер-связанным активатором OCA-B и промотор-связанным транскрипционным фактором TFII-I (Ren et al., 2011). Мутации в участках связывания белка OCA-B подавляют этот эффект. Примечательно, что транскрипционный активатор OCA-B и гистондеацетилаза HDAC3, которая участвует в эпигенетическом сайленсинге промотора Igh, конкурируют за связывание с TFII-I. С учетом этих данных, возможно предположить, каким образом выпетливание ДНК между энхансером и промотором обеспечивает активацию транскрипции: расположение OCA-B-зависимого энхансера вблизи промотора гена Igh создает повышенную концентрацию фактора OCA-B в области промотора, что приводит к вытеснению HDAC3 и дерепрессии гена.
Важность прямого контакта между белками, связанными с промотором и энхансером, в установлении промотор-энхансерной коммуникации была продемонстрирована и на модели домена бета-глобиновых генов человека. В данном случае эритроидспецифичный транскрипционный фактор GATA-1 опосредует выпетливание ДНК между областью контроля локуса (LCR, c англ. locus control region), главного регуляторного элемента домена, и промотором взрослого бета-глобинового гена (Vakoc et al., 2005). GATA-1 связывается с промотором и LCR и инициирует сборку белковых комплексов, включающих Ldb1. Этот кофактор формирует олигомеры, и его «нокдаун» нарушает пространственное взаимодействие между LCR и промотором бета-глобинового гена (Song et al., 2007). В своем недавнем исследовании Денг и соавт. показали, что искусственное закрепление олигомеризационного домена белка Ldb1 на бета-глобиновом промоторе с использованием ДНК-связывающего модуля типа «цинковые пальцы» восстанавливает петлю ДНК между LCR и промотором в эритроидных клетках, в которых отсутствует GATA-1 (Deng et al., 2012). Более того, искусственное привлечение Ldb1 на расположенный по соседству неактивный ген эмбрионального бета-глобина приводит к «переброске» петли хроматина на эмбриональный ген и его активации, тогда как уровень транскрипции взрослого бета-глобинового гена падает (Deng et al., 2014). Таким образом, ясно, что Ldb1 играет роль коммуникаторного белка в бета-глобиновом локусе.
Согласно другой модели, именуемой моделью экспрессионного центра, или «экспрессионного хаба» (Kosak and Groudine, 2004), энхансеры и контролируемые ими промоторы сосредотачиваются относительно близко друг от друга в пределах одного ядерного компартмента (Bickmore, 2013). Такое расположение может способствовать поддержанию локально высокой концентрации транскрипционных факторов и комплексов ремоделирования хроматина в окрестностях промоторов и энхансеров и установлению множественных контактов между ними, приводящих к альтернативной активации различных промоторов, как это наблюдается в локусе бета-глобиновых генов человека (Wijgerde et al., 1995). Экспрессионный центр, таким образом, может быть рассмотрен как относительно небольшой ядерный компартмент, который формируется и сохраняет свою целостность благодаря специфической укладке достаточно протяженного участка хроматиновой фибриллы, включающего весь комплекс взаимодействующих энхансеров и промоторов. Из описания модели возможно предсказание, что формирование экспрессионного центра должно сопровождаться реконфигурацией обширного хроматинового домена. Это действительно наблюдается в локусе альфа-глобиновых генов человека: в клетках линии K562, экспрессирующих альфа-глобиновые
Окрашивание клеток бензидином для выявления гемоглобина
Для приготовления эквимолярной смеси продуктов лигирования рестриктных фрагментов исследуемой области генома 10 мкг ДНК искусcтвенной бактериальной хромосомы, несущей эту область, переваривали подходящей рестриктазой/ами, очищали ДНК экстракцией фенол-хлороформом и преципитацией этанолом, религировали при концентрации ДНК 100 нг/мкл и вновь очищали ДНК. Использовали следующие эндонуклеазы рестрикции и бакмидные клоны: BamHI и BglII для переваривания бакмиды CH261-75C12; Sau3A (изошизомер MboI, нечувствительный к dam-метилированию) или NlaIII для переваривания бакмиды TAM32-28J3; HindIII или Sau3A для переваривания бакмиды RP24-79I7. Полученный образец использовали в качестве стандарта при определении относительных количеств продуктов лигирования в экспериментах по 3С-анализу и M3C-анализу. 0.7–2% раствор агарозы в буфере ТАЕ (40 мМ Трис (pH 8.0), 40 мМ ацетат натрия, 1 мМ EDTA) прогревали в СВЧ-печи до расплавления агарозы, охлаждали до 50–55С, в ряде случаев добавляли 1% (W/V) раствор бромистого этидия до концентрации 0.5 мкг/мл, заливали в форму и выдерживали до застывания. К образцу ДНК добавляли 1/5 V буфера для нанесения проб на гель (0.025% бромфеноловый синий, 40% (W/V) сахарозы). Электрофорез проводили в буфере ТАЕ при напряженности электрического поля 8–10 В/см. По завершении электрофореза гели без бромистого этидия выдерживали 1 час в буфере ТАЕ, содержащем 0.5 мкг/мл бромистого этидия, затем трижды по 20 минут промывали чистым буфером ТАЕ или ddH2O. ДНК визуализировали, используя источник ультрафиолетового излучения при длинах волн 312 или 366 нм. В качестве маркера длины использовали смесь фрагментов ДНК от 0.1 до 10 т.п.н. (Fermentas, SM0331).
Для выделения ДНК из геля использовали набор колонок и реагентов «QIAquick PCR Purification Kit» согласно инструкциям производителя.
Клеточный осадок, содержащий 106 клеток, суспендировали в 1 мл реактива TRIzol (Helicon), выдерживали 5 минут при комнатной температуре до полного лизиса и гомогенизации образца. Затем к раствору добавляли 200 мкл хлороформа, встряхивали и выдерживали 3 минуты при комнатной температуре, после чего центрифугировали 15 минут при 16000g и 4С. Водную фазу отбирали и осаждали из нее РНК. Для этого к раствору добавляли 1 V изопропанола, выдерживали 10 минут при комнатной температуре, после чего раствор центрифугировали 10 минут при 16000g и 4С. Супернатант удаляли, осадок РНК промывали 1 мл 70% этанола (приготовленного на DEPC-H2O), центрифугировали 10 минут при тех же условиях. Осадок РНК подсушивали на воздухе при комнатной температуре и растворяли в 50 мкл DEPC-H2O. Для очистки от ДНК полученный препарат РНК обрабатывали 1 ед. ДНКазы I, свободной от РНКаз (Thermoscientific), в присутствии 120 ед. ингибиторов РНКаз (Thermoscientific) в течение 30 минут при 37С. Далее добавляли 1/10 V 3М раствора ацетата натрия (рН 5.2) и 1 V фенола (рН 5.0), встряхивали и центрифугировали 10 минут при 16000g и 4С. Водную фазу отбирали, добавляли к ней 1 V смеси фенола с хлороформом (1:1), повторяли центрифугирование при тех же условиях. К водной фазе добавляли 1 V хлороформа и повторно центрифугировали. Водную фазу отбирали и осаждали РНК по описанной выше методике. Полученный осадок РНК растворяли в 50 мкл DEPC-H2O, препарат хранили в холодильнике при -70С.
Реакционную смесь, содержащую РНК (от 100 до 1000 нг), 0.2 мкг гексануклеотидных праймеров (Силекс), реакционный буфер для ревертазы M-MuLV (50 мМ Трис (рН 8.3), 50 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 10 мМ DTT), 20 нмоль каждого dNTP (Силекс), 20 ед. ингибиторов РНКаз (Thermoscientific) и 200 ед. ревертазы M-MuLV (Thermoscientific), инкубировали 1 час при 42С. Для инактивации ревертазы образец выдерживали при 70С 10 минут. В качестве отрицательного контроля вместо ревертазы добавляли эквивалентный объем DEPC-H2O.
Количественный анализ кДНК проводили методом ПЦР в реальном времени с TaqMan пробами. На одну реакцию амплификации использовали 1 мкл смеси после обратной транскрипции. Для построения калибровочной кривой проводили амплификацию нескольких последовательных разведений геномной ДНК (100, 10, 1 и 0.1 нг на реакцию). Последовательности праймеров и TaqMan-проб представлены в таблицах 1 и 2, размещенных в конце главы «Материалы и методы».
Реакцию амплификации проводили в 20 мкл ПЦР-буфера (50 мM Трис (pH 8.6), 50 мM KCl, 1.5 мM MgCl2, 0.1% Tween 20), содержащего матричную ДНК, 0.5 мкМ каждого праймера, 0.25 мкМ TaqMan-пробы, 0.2 мМ каждого dNTP, 1 ед. Taq-полимеразы горячего старта (СибЭнзим), по следующей схеме: 94С – 5 минут, 1 цикл; 94С – 15 секунд, 60С – 60 секунд, детектирование флуоресценции, 50-60 циклов. Реакцию проводили на приборе CFX Realime System (BioRad) или StepOne Plus (Applied
Клонирование осуществляли в штамме DH5a E. coli по стандартной методике (Maniatis et al., 1982). В качестве вектора использовали плазмиду pUC18. Наработку вставок осуществляли путем амплификации соответствующих участков геномной ДНК. На 5 -концы праймеров были добавлены некомплементарные последовательности, содержашие сайты связывания эндонуклеаз рестрикции, по которым впоследствии осуществляли лигирование вставки в вектор. Последовательности праймеров представлены в таблице 3.
Клетки в количестве 107 фиксировали в 10 мл PBS, содержащем 10% фетальной бычьей сыворотки и 2% формальдегида, в течение 10 минут при комнатной температуре и покачивании. Реакцию останавливали добавлением 2 М глицина до концентрации 0.125 М, после чего суспензию клеток охлаждали во льду и центрифугировали в течение 10 минут при 300g и 4С. Осадок клеток промывали 10 мл холодного буфера PBS, содержащего 10%-ную фетальную бычью сыворотку, и повторяли центрифугирование. Для изоляции ядер осадок суспендировали в 5 мл буфера для лизиса клеток (10 мM Трис (pH 8,0), 10 мM NaCl, 0,2% NP-40, ингибиторы протеаз (Thermoscientific)) и инкубировали 10 минут во льду. Ядра собирали центрифугированием в течение 5 минут при 600g и 4С и при необходимости замораживали в жидком азоте и хранили при -70С.
Объединенный активаторный хроматиновый блок альфа-глобиновых генов и гена TMEM8
Хотя механизмы работы транскрипционных энхансеров во многом остаются не ясными, большинство современных моделей предполагают, что энхансеры напрямую взаимодействуют с подконтрольными промоторами, в то время как сегмент хроматиновой фибриллы, разделяющий промотор и энхансер, выпетливается (Bartkuhn and Renkawitz, 2008; Bulger and Groudine, 1999, 2010). Единичный энхансер может активировать несколько промоторов. К примеру, в эритроидных клетках мыши на поздне-эмбриональной стадии развития область контроля локуса домена бета-глобиновых генов стимулирует экспрессию двух бета-глобиновых генов (Hbb-b1 и Hbb-b2). Промоторы этих генов расположены на расстоянии 14 т.п.н. друг от друга и не могли бы одновременно взаимодействовать с LCR, если бы образовывалась только одна петля хроматина. Поэтому было предположено, что одновременное взаимодействие LCR c несколькими промоторами осуществляется в составе мультикомпонентного комплекса, из которого выпетлено несколько сегментов хроматиновой фибриллы (модель активаторного хроматинового блока (de Laat and Grosveld, 2003; Tolhuis et al., 2002)). Хотя данная модель получила широкое признание в научном сообществе (de Laat et al., 2008; Kooren et al., 2007; Palstra et al., 2008a; Zhou et al., 2006), она остается гипотезой, поскольку 3С-анализ позволяет проводить лишь попарный анализ взаимодействия геномных элементов и не может ответить на вопрос, происходят ли два или более попарных взаимодействий в одном месте в одной и той же клетке. Те же результаты могут быть объяснены альтернативным взаимодействием энхансера поочередно с каждым из активируемых промоторов (Gribnau et al., 1998; Wijgerde et al., 1995). Соответственно, в каждый момент времени различные попарные взаимодействия могут реализовываться в различных суб-201 популяциях клеток. Более того, ни 3С-метод, ни его производные методы, основанные на принципе предпочтительного лигирования (Dostie et al., 2006; Fullwood et al., 2009; Lieberman-Aiden et al., 2009; Simonis et al., 2006; Zhao et al., 2006), не могут быть использованы для подсчета доли клеток, в которых две определенные последовательности ДНК взаимодействуют друг с другом (Hagege et al., 2007; Splinter et al., 2004). Таким образом, даже наиболее типичная пространственная конфигурация локуса остается неизвестной. Количественный анализ 3С-данных затруднен тем обстоятельством, что каждый конец рестрикционного фрагмента может быть лигирован к любому концу неизвестного числа других рестрикционных фрагментов, представленных в том же хроматиновом комплексе или локализованных поблизости.
Среди существующих методов только флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) может быть использована для обнаружения мультикомпонентных комплексов удаленных фрагментов генома в клеточном ядре. Однако разрешение данного метода не высоко. Хотя в ряде недавних работ сообщалось об успешном использовании FISH для разрешения хромосомальных элементов, расположенных на расстоянии 50 т.п.н. (Eskeland et al., 2010) или даже меньше (Markaki et al., 2012), FISH редко используется для анализа конфигурации единичных локусов, имеющих длину менее 150 т.п.н. (Simonis and de Laat, 2008). Кроме того, необходимо подчеркнуть, что 3С-метод и FISH позволяют выявить лишь сближение геномных элементов в клеточном ядре; вопрос о том, собираются ли эти элементы в единый ДНК-белковый комплекс, так и остается открытым.
В нашем исследовании мы разработали новый экспериментальный подход, названный INGRID (in-gel replication of interacting DNA segments – репликация в геле взаимодействующих сегментов ДНК), позволяющий осуществлять прямую детекцию мультикомпонентных комплексов геномных элементов и определять доли комплексов различного типа.
Принцип метода INGRID проиллюстрирован рис. 31. Главное отличие INGRID от 3С-метода и производных С-методов заключается в том, что фиксированные фрагменты хроматина, высвобожденные из ядер, не лигируются. Вместо этого они распределяются в тонком слое полиакриламидного геля (рис. 31А), и интересующие фрагменты амплифицируются прямо в геле. Как было показано ранее, вследствие ограниченной подвижности в геле, ПЦР-продукты остаются поблизости с матричной молекулой ДНК, образуя так называемые молекулярные колонии (Chetverin and Chetverina, 2008; Chetverina et al., 2002) (рис. 31Б). Рост молекулярных колоний отслеживается в режиме реального времени (Samatov et al., 2006) с использованием, к примеру, проб типа Molecular Beacon («молекулярные маячки») (Tyagi and Kramer, 1996), несущих различные комбинации флуорофор–тушитель для каждого из амплифицируемых фрагментов (рис. 31В; см. также рис. 34). Фрагменты хроматина, которые были сшиты в одном комплексе, колокализуются в геле и дают начало мультикомпонентным колониям, тогда как несшитые фрагменты распределяются в геле независимо друг от друга и, как правило, образуют монокомпонентные колонии. Таким образом, метод INGRID позволяет визуализировать и подсчитывать количество индивидуальных комплексов элементов ДНК путем перевода их в мультикомпонентные ДНК-колонии.
Регуляция транскрипции альфа-глобиновых генов и гена TMEM8 посредством сборки альтернативных активаторных хроматиновых блоков
Как отмечалось выше, природа ядерного матрикса остается не ясной, а некоторые исследователи даже ставят под сомнение его существование. Однако ряд недавних исследований, направленных, в частности, на описание протеома ядерного матрикса (Albrethsen et al., 2009; Ishii et al., 2008; Mika and Rost, 2005) и детальное изучение его ультраструктуры с использованием новых методов (Barboro et al., 2003; Barboro et al., 2010), все-таки поддерживают идею о том, что ядерный матрикс существует в живых клетках и поддерживает функциональную компартментализацию клеточного ядра (обсуждено в (Berezney, 2002; Elcock and Bridger, 2008)). По результатам ранних исследований в нашей лаборатории была выдвинута гипотеза, что эукариотический геном организован в петли, прикрепленные к ядерному матриксу (см. (Razin et al., 1995)).
Многие исследователи изучали специфичность этой организации, но результаты противоречили друг другу. Было показано, что определенные последовательности обладают способностью специфично связываться с изолированными ядерными матриксами in vitro. Эти последовательности были названы MAR (Matrix Attachment Region, участки прикрепления к матриксу) (Cockerill and Garrard, 1986). Те же последовательности ДНК, изолированные с использованием другой экспериментальной процедуры, включающей экстракцию ядер дииодо-салицилатом лития (LIS), получили название SAR (Scaffold Attachment Region – участок прикрепления к скафолду) (Mirkovitch et al., 1984). В современной литературе данные элементы часто именуют S/MAR-элементами (Bode et al., 1995). Хотя общепринятым считается, что S/MAR-элементы опосредуют прикрепление петель ДНК к ядерному матриксу, это никогда не проверялось экспериментально. Напротив, было показано, что последовательности S/MAR электроэллюируются из инкапсулированных, обработанных эндонуклеазой рестрикции ядер при физиологических солевых условиях (Hempel and Stratling, 1996) – наблюдение, не стыкующееся с предположением о том, что S/MAR-элементы вовлечены в заякоривание петель ДНК на ядерном матриксе. Чтобы выяснить, какие участки ДНК связаны с ядерным матриксом in vivo, некоторое время назад в нашей лаборатории был разработан протокол картирования участков прикрепления петель, основанный на вырезании петель ДНК топоизомеразой II ядерного матрикса в условиях подавления лигирующей активности фермента специфическими ингибиторами (Gromova et al., 1995). Достоверность предложенного протокола была подтверждена прямой визуализацией связанных с ядерным матриксом петель ДНК, которые изначально были картированы с использованием протокола выщепления петель при ингибировании топоизомеразы II (Iarovaia et al., 2004). В контексте нашего обсуждения важно отметить, что участки прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу, картированные по протоколу вырезания петель топоизомеразой II, часто локализуются в CpG-островках, включая CpG-островок гена NPRL3 кур (Razin et al., 1991) и CpG-островок гена c-Myc человека (Gromova et al., 1995).
Нам представлялось интересным выяснить, существует ли связь между петлями ДНК, ассоциированными с ядерным матриксом, и петлями ДНК, которые могут быть картированы с помощью процедуры 3С. Протокол M3C опирается на операционное определение ядерного матрикса (Berezney and Coffey, 1977). Если ядерный матрикс и комплексы ДНК с ядерным матриксом устойчивы к экстракции 2M раствором NaCl, тогда частоты лигирования связанных с ядерным матриксом фрагментов ДНК можно анализировать без процедуры фиксации. Следует отметить, что то обстоятельство, что экспериментальный протокол, основанный на свойствах ядерного матрикса, позволил идентифицировать специфические взаимодействия между определенными участками генома, уже само по себе косвенно поддерживает концепцию ядерного матрикса.
Протокол M3C был использован для изучения роли ядерного матрикса в пространственной организации участка хромосомы 14 кур длиной около 130 т.п.н., который включает домен альфа-глобиновых генов. В наших предыдущих экспериментах ((Gavrilov and Razin, 2008) и раздел III.1.2) был осуществлен анализ пространственной организации этого участка генома с использованием стандартного протокола 3С. В текущей работе мы решили применить метод M3C для анализа того же модельного участка и сопоставить результаты, полученные с использованием двух методов. Полученные нами данные свидетельствуют о взаимодействии нескольких CpG-островков, представленных в изучаемой области генома, на ядерном матриксе. Это – СpG-островки, ассоциированные с промоторами генов домашнего хозяйства NPRL3, MPRL28 и AXIN1. Они локализуются на ядерном матриксе в пространственной близости друг от друга в лимфоидных и эритроидных клетках. Вероятно, группа CpG-островков на ядерном матриксе представляет собой транскрипционную фабрику (или часть транскрипционной фабрики), которая может включать CpG-островки, несущие промоторы других генов, лежащих вне анализируемой области генома. В данной связи важно отметить, что гены NPRL3, MPRL28 и AXIN1 транскрибируются и в эритроидных, и в неэритроидных клетках. Напротив, CpG-островок, локализованный между генами MPRL28 и AXIN1 и не ассоциированный с каким-либо геном, не привлечен к указанной группе CpG-островков. Отсюда следует, что взаимодействие CpG-островков на ядерном матриксе коррелирует с транскрипцией генов домашнего хозяйства, ассоциированных с этими CpG-островками.
Об организации транскрипционных фабрик известно сравнительно мало (Papantonis and Cook, 2013; Sutherland and Bickmore, 2009). Основным доказательством в пользу их существования является кластеризация транскрибирующих молекул РНК-полимеразы II. Сообщалось, что транскрипционные фабрики собираются на ядерном матриксе (Jackson, 1997). Наши данные согласуются с этим наблюдением. Исследования по анализу пространственной организации домена альфа-глобиновых генов мыши предполагают, что промоторы альфа-глобиновых генов привлекаются к предсуществующей транскрипционной фабрике, опосредующей транскрипцию окружающих генов домашнего хозяйства в ответ на активацию глобиновых генов (Zhou et al., 2006). Полученные нами результаты (см. рис. 46Б и более раннюю работу (Gavrilov and Razin, 2008)) предполагают, что это же верно и для домена альфа-глобиновых генов кур. Однако, эритроидспецифичные взаимодействия между промоторами глобиновых генов и CpG-островками фланкирующих генов домашнего хозяйства, детектируемые с использованием обычного протокола 3С, в наших M3C-экспериментах выявлены не были. Это наблюдение согласуется с низким содержанием эритроидспецифичных регуляторных элементов в ядерном матриксе, выделенном из эритроидных (HD3) или неэритроидных (DT40) клеток (см. рис. 47).