Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 19
1.1 Вирус гриппа и его жизненный цикл 19
1.2 Строение и фузогенная активность гемагглютинина 21
1.3 Препараты для профилактики и терапии гриппа 23
1.4 Противогриппозные соединения – ингибиторы гемагглютинина 27
1.4.1. Ингибиторы связывания с рецептором 27
1.4.2. Ингибиторы фузогенной активности HA 35
1.5 Ингибиторы протонного насоса M2 61
1.5.1. BL-1743 и его аналоги 78
1.5.2. Каркасные гомологи адамантана и их производные 81
1.6 Биологическая активность камфоры и её производных 94
Глава 2. Материалы и методы 96
2.1. Химические соединения 96
2.2. Вирусы и клетки 96
2.3. Изучение противовирусной активности соединений 97
2.4. Титрование вирусов 97
2.5. Исследование токсичности соединений in vitrо 99
2.6. Оценка токсичности соединений in vivo 100
2.7. Оценка противовирусной активности соединений in vivo 100
2.8. Гистологические исследования 102
2.9. Изучение стадии вирусной репродукции – мишени действия соединений 103
2.10. Изучение воздействия соединений на гемагглютинин вируса гриппа 103
2.11. Компьютерное моделирование взаимодействия препаратов с рецептором 104
2.12. Получение устойчивых к камфецину вариантов вируса гриппа 104
2.13. Молекулярно-биологические методы 105
2.14. Электронно-микроскопические исследования 106
2.15. Статистическая обработка результатов 108
Глава 3. Противовирусная активность производных камфоры 109
3.1. Закономерности противовирусной активности производных камфоры по результатам первичного скрининга соединений in vitro 109
3.2. Изучение спектра противовирусной активности производных камфоры 116
3.3. Определение уровня и спектра противогриппозной активности камфецина в опытах на животных 122
3.4. Влияние камфецина на морфогенез экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей 143
3.5. Оптимизация режима и способа применения камфецина для терапии экспериментальной гриппозной инфекции 147
3.6. Токсикологическая характеристика камфецина 157
3.7. Заключение. 158
Глава 4. Исследование механизма противовирусной активности производных камфоры . 160
4.1. Изучение стадии вирусного цикла – мишени действия производных камфоры 160
4.2. Активность производных камфоры в отношении гемагглютинина вируса гриппа 161
4.3. Влияние производных камфоры на ультраструктуру клеток в ходе морфогенеза гриппозной инфекции in vitro 163
4.4. Оценка сайта связывания производных камфоры с вирусным гемагглютинином 168
4.5. Заключение 172
Глава 5. Селекция и изучение вирусных штаммов, резистентных к камфецину 173
5.1. Селекция камфецин-резистентного варианта вируса in vitro 173
5.2. Исследование свойств камфецин-резистентного вируса гриппа 174
5.3. Идентификация мутаций, обусловливающих камфецин-резистентность 176
5.4. Заключение 181
Обсуждение полученных результатов и заключение 183
Выводы 207
Cписок литературы 210
Приложение. 234
- Ингибиторы связывания с рецептором
- Каркасные гомологи адамантана и их производные
- Оптимизация режима и способа применения камфецина для терапии экспериментальной гриппозной инфекции
- Идентификация мутаций, обусловливающих камфецин-резистентность
Ингибиторы связывания с рецептором
Многие природные вещества, преимущественно полифенольной (Kim et al., 2013; Shen et al., 2013) или олигосахаридной (Liu et al., 2011; Feng et al., 2010) природы, способны взаимодействовать с вирусным гемагглютинином. Например, противовирусный эффект, обусловленный этим взаимодействием, был показан для катехинов, содержащихся в зелёном чае. Было продемонстрировано, что вещества этого класса способны ингибировать вирусный гемагглютинин, значительно угнетая этап вирусной сорбции на поверхности клетки (Song et al., 2005). Более того, повышение мембранной проницаемости EGCG при помощи жирнокислотной модификации молекулы позволило достигнуть степени ингибирования вируса гриппа, сопоставимой с эффектом осельтамивира (IC50=10-61 нМ). При этом спектр противовирусной активности полученных соединений включал также штаммы, устойчивые к адамантановым производным и ингибиторам нейраминидазы (Kaihatsu et al., 2009). Другие исследования, однако, свидетельствуют, что катехины являются эффективными ингибиторами эндонуклеазной активности полимеразного комплекса (Kuzuhara et al., 2009). Наибольшей активностью обладал b (-)-эпигаллокатехингаллат (EGCG) и (-)-эпигаллокатехин (EGC, Рис.4). Компьютерное моделирование показало, что вещества этого класса, благодаря наличию остатка галловой кислоты, связываются с активным центром субъединицы.
Эти данные подтвердились в работе Derksen et al (2014), в которой было показано ингибирующее действие экстракта щавеля Rumex acetosa L. и его компонентов в отношении вирусов гриппа А. В подавляющем большинстве экстракт был составлен проантоцианадиновыми аналогами (эпикатехинами, флавон-3-олами). Сам по себе суммарный экстракт ингибировал продукцию вируса, имея IC50=2.5 и 2,2 мкг/мл и SI=32 и 36 против вирусов A(H1N1) и A(H1N1)pdm09 соответственно. Если говорить о конкретных химических составляющих экстракта, то наибольшей активностью обладали эфиры катехинов и галловой кислоты, в частности, эпигаллокатехин-3-O-галлат и процианидин B2-дигаллат (Рис.5). Их индексы селективности против вируса A(H1N1)pdm09 составили 17 и 13 соответственно. Было показано, что эти соединения препятствуют сорбции вирусных частиц на клетку, и что мишенью их действия является рецептор-связывающий сайт гемагглютинина.
Подобными же свойствами обладали ещё несколько соединений. Так, из чёрной бузины (Sambucus nigra L.) был выделен высокоактивный флавоноид 5,7,3 ,4 -O-тетраметилкверцетин, проявивший активность против вируса A/PR/8/34 (H1N1) с IC50=0.36 M (Roschek et al., 2009). Широко распространённый пищевой краситель куркумин и его производные также способны связываться с HA этого вируса (IC50=0.47 M, Chen et al., 2010), причём связывание происходило именно в районе связывания сиаловой кислоты рецептора (Рис.6, Ou et al., 2013).
Из растения андрографис (Andrographis paniculata) было выделено соединение андрографолид, впоследствии модифицированное до аналога AL-1 (Рис.7). Как и ранее описанные вещества, оно ингибировало связывание с рецептором вирусов H9N2, H1N1 и H5N1. Важно, что противовирусная активность этого соединения сохранялась также в опытах in vivo, причём при высоких, в районе 1LD90, инфицирующих дозах вируса (Chen et al., 2009).
Пентациклические тритерпеновые соединения, описанные в 2014 г. Yu et al., также были способны блокировать сайт связывания НА с рецептором. Наибольшей активностью обладал гликозилированный тритерпеноид Y3 (Рис.8). Обусловленный таким связыванием противовирусный эффект превышал эффективность осельтамивира и проявлялся не только в клеточной культуре, но и на модели гриппозной пневмонии у мышей. В опытах использовались дозы соединения 12,5 и 25 мг/кг, при этом была достигнута 100%-ная защита животных при 80% смертности в контроле.
Важно также, что на протяжении 6 последовательных пассажей не было зафиксировано повышения резистентности вируса к Y3, тогда как в отношении референс-препарата амантадина устойчивые варианты обнаруживались уже на 4-м пассаже.
В работе Waldmann et al (2013) была продемонстрирована активность тривалентного лиганда, связывающегося с гемагглютинином H5 вируса гриппа птиц. Структура такого лиганда была рассчитана на основании пространственной модели тримера HA и включала три остатка сиаловой кислоты, присоединённые через алкильные и пептидные линкеры к центральному остатку тримезиновой кислоты (Рис.9). Преимущеста этого лиганда заключаются в способности задействовать сразу все три сайта связывания тримерной молекулы HA с мишенью (Рис.10), что повышает его аффинность по сравнению с мономерными аналогами на несколько порядков. Лиганд связывался с H5 и был способен вытеснять естественный рецептор HA, N-ацетилнейраминовую кислоту, из сайта связывания. Поскольку гемагглютинин любого подтипа, как и H5, представляет собой тример, авторы полагают, что синтезированный лиганд будет в равной степени ингибировать все подтипы вируса гриппа. Действительно, моделирование его взаимодействия с HA типа H7 при помощи метода молекулярной динамики продемонстрировало высокую аффинность и к этому подтипу.
Каркасные гомологи адамантана и их производные
Как уже упоминалось, в мутантном М2 с заменой S3 IN диаметр поры уменьшен с 8 до 6,3. Вследствие этого у такого белка имеется меньше места для проникновения и стабилизации молекулы амантадина. Учитывая это обстоятельство, были синтезированы и охарактеризованы «сокращённые» аналоги амантадина и ремантадина на основе норадамантана и биснорадамантана (60-65, Рис.63). Некоторые из них обладали вирусингибирующей активностью в микромолярном диапазоне против М2 дикого типа - от 1С5о=2.4 М для 60с до 17 М для 60Ь и 63. Эта активность, показанная в ооцитах X. laevis, была подтверждена в тестах по снижению бляшкообразования с вирусом A/Udorn/72 (H3N2). Для соединения 60а это действие было также показано для вируса A/Hong Kong/7/87 (H3N2) - оба ремантадин-чувствительные. В отношении мутантного М2, несущего замену S31N, активность была зафиксирована лишь для 51, причём она была низкой и по уровню сопоставимой с активностью амантадина (С5о=252 и 200 М, соответственно). Производные пирролидина проявили умеренную активность против M2wt (1С5о=24 М для 64).
Таким образом, из серии аминов, содержащих каркасные фрагменты, наиболее активными против М2 с мутацией S3 IN оказались те, у которых полициклическая часть имела наименьший размер. Однако даже наиболее активное из них (62) уступало амантадину (ICso=252 и 200 мкМ соответственно).
Моделирование взаимодействия с М2, проведённое Duque et al. (2011), показало, что производные пирролидина типа 64 связываются, напрямую или через молекулы воды, с S31 и V27. Из-за асимметричного расположения аминокислотных остатков четырёх мономеров М2 в этой зоне и симметричной структуре 64 связывание является нестабильным. Возможно, модификация 64 при помощи асимметричных полярных групп позволит стабилизировать молекулу в полости канала и повысить активность соединения.
Дальнейшее изучение соединений, родственных 64 (Рис.64), показало, что полициклические амины препятствуют НА-опосредованному слиянию мембран, повышая рН в эндосомах. Одни вирусы, такие как H1N1, оказались более чувствительны к этому эффекту, чем другие (Torres et al., 2013).
Вторичный амин, 3-азагексацикло[7.6.0.015.0512.0610.01115]пентадека-7,13-диен (66), ингибировал протонный канал М2 и проявлял вирусингибирующую активность против вирусов H3N2, несущих как M2wt, так и амантадин-резистентный мутантный белок. Другие полициклические амины, не блокирующие M2, проявляли активность в микромолярном диапазоне против вирусов H1N1, но не против H3N2. Мутанты, резистентные к таким препаратам, несли в гене HA аминокислотные замены, приводящие к заметному понижению pH гемолиза. Они затрагивали положения 13, 186 и 324 в HA1 и 3 и 10 – в HA2 (Рис.65). При этом замена F3L в HA2 была идентифицирована ранее у мутантов, устойчивых к 68 (Daniels et al., 1985) и CL-61917 (Plotch et al., 1999). Этот аминокислотный остаток расположен в гидрофобном пептиде слияния, и замена аминокислот на менее гидрофобные приводит к повышению pH гемолиза (Cross et al., 2001). Боковые цепи F3, расположенные в середине тримерного стебля HA, образуют несколько гидрофобных контактов друг с другом и с соседними аминокислотами. Замена этих групп на меньшие по размеру ослабляет гидрофобные взаимодействия и понижает тем самым энергетический порог, необходимый для высвобождения пептида слияния. Фенотипически это проявляется в повышении pH гемолиза.
Вирусы группы I и группы II имеют сходные pH слияния, в районе 5,0. Тем не менее, описанные полициклические амины, действуя путём защелачивания содержимого эндосом, проявляют выраженную специфичность в отношении вирусов H1N1. Такая селективность может быть вызвана тем, что по тем или иным причинам вирусы H1N1, в частности, A/PR/8/34, действительно, более чувствительны к изменениям pH, чем вирусы H3N2 (Korte et al., 1999). К сожалению, ограниченный набор вирусов, использованный в исследовании Torres et al (2013), не позволяет делать обобщения о механизме действия препаратов в масштабах целой группы вирусов гриппа.
В другой работе этой же группы исследователей (Rey-Carrizo et al., 2013) было ещё раз показано, что родственные соединения (Рис.66) ингибируют M2wt и его мутантные модификации с разной эффективностью. Так, в тестах по электрофизиологии и по снижению вирусного титра спироадамантаны (69) ингибируют мутанты L26F и V27A. При этом мутант S31N ингибируется соединениями типа 70 и 71. HO
Некоторые аналоги адамантана с сокращёнными кольцами, такие как 62 и 63 (Рис.63), обладают сходными с амантадином ингибирующими характеристиками против M2wt, однако не проявляют активности против устойчивых мутантов. Также были изучены соединения с более крупной основой – [6.4.0.02.10.03.7.04.9] додеканом (Рис.67). Интересно, что первичные амины типа 72 и 73, а также некоторые производные, такие как вторичные и третичные амины, амидины и гуанидины не ингибировали M2, тогда как более конформационно жёсткие пирролидиновые производные (64, 73) обладали высоким уровнем активности, будучи лишь немногим слабее амантадина. Помимо этого, они проявляют некоторую ингибирующую активность против мутанта V27A. На основании полученных результатов предполагают, что пирролидиновые производные бис-норадамантана с известной активностью могли бы быть активными как против M2wt, так и против V27A.
Кубиламины (65, Рис.63) можно также рассматривать как «сокращённые» аналоги адамантана. Активность их была показана для таких производных как 4-метилкубан-1-амин и ,4-диметилкубан-1-метиламин. Противовирусные свойства этих соединений были даже подтверждены на животной модели гриппозной инфекции, вызванной вирусом A/Ann Arbor/2/60 (H2N2). Так, применение аналога ремантадина 65b снижало смертность животных на (80-30)/80=63%, что характеризует его как перспективное соединение (Gregory, 1971).
Была также изучена противогриппозная активность ряда других, трудно классифицируемых, полициклических структур, в частности, аминов на основе пентацикло[5.4.0.02.6.03.10.05.9]ундекена (Рис.68). Один из них, 75, оказался эффективен против гриппа H2N2, тогда как его изомер (76) активности не имел. Амин 77 оказался активнее амантадина и ремантадина (IC50=8.16 и 10.8 M, соответственно) против M2wt в ооцитах X. laevis. Введение по соседству с аминогруппой гидроксила (78) несколько снижало активность соединения.
Оптимизация режима и способа применения камфецина для терапии экспериментальной гриппозной инфекции
Для экспериментов этой серии был использован вирус гриппа A/California/07/09 (H1N1)pdm09, чувствительный к противовирусному препарату осельтамивиру и устойчивый – к ремантадину.
Для отработки оптимального режима применения использовали камфецин в двух нетоксических концентрациях для каждого из режимов. В опытах сравнивали три режима применения камфецина: профилактический режим (применение камфецина за 24 и за 1 час до заражения), лечебно-профилактический режим (за 24 и за 1 час до заражения, через 24, 48, 72 и 96 часов после заражения), лечебный режим (через 24, 48, 72 и 96 часов после заражения). Результаты экспериментов суммированы в табл. 10-11 и для наглядности представлены на рис. 95-96.
Использованный вирус является устойчивым к ремантадину, однако высокочувствительным к осельтамивиру. Как следует из представленных данных, как камфецин в дозе 100 мг/кг/сут., так и препарат сравнения осельтамивир, снижали смертность животных по сравнению с группой, получавшей плацебо. Уровень протективной активности препаратов зависел от режима их применения. Так, при высокой инфицирующей дозе (10 LD50) достоверное снижение смертности достигалось при использовании осельтамивира по лечебной (ИЗ=71,4%, p=0.00008), лечебно профилактической (ИЗ=78,6%, p=0.00003) и профилактической (ИЗ=42,9%б p=0.002060) схемам. Камфецин достоверно снижал смертность животных, будучи использован по лечебной (ИЗ=35,7%, p=0.01659) и лечебно 149 профилактической (ИЗ=64,3%, p=0.00062) схеме и статистически достоверно не влиял на выживаемость животных в группе профилактического применения (ИЗ=28,6%, p=0.097). При низкой заражающей дозе достоверное снижение смертности было отмечено в группах, получавших Тамифлю по лечебной (ИЗ=66,7%, p=0.03390) и лечебно-профилактической (ИЗ=77.8%, p=0.01419) схеме, а также при использовании камфецина по лечебно профилактической схеме (ИЗ=66,7%, p=0.02618). Применение Тамифлю по профилактической схеме, а также камфецина - по лечебной и профилактической схемам не приводило к статистически значимому повышению выживаемости животных (p=0.344; 0.115 и 0,301 соответственно).
Полученные данные были подтверждены при помощи титрования инфекционной активности вируса в ткани легких (Табл.11, Рис.96). Уровень вирусной репродукции в ткани был изучен у животных, зараженных малой дозой вируса (1 LD50, n=5). Наибольшая эффективность противовирусной терапии была получена при лечебно-профилактическом применении камфецина (снижение вирусной репродукции на 1,9 lgID50, или в 80 раз) и лечебно-профилактическом использовании препарата сравнения – Тамифлю (2,4 lgID50, или в 250 раз).
Для отработки оптимального способа применения камфецина также был использован вирус гриппа A/California/07/09 (H1N1)pdm09, чувствительный к противовирусному препарату осельтамивиру и устойчивый – к ремантадину. В ходе опыта были сравнены пероральный, внутрибрюшинный и внутримышечный способы применения камфецина. Камфецин и препарат сравнения применяли по лечебно-профилактической схеме (см. выше). Полученные данные суммированы в табл.12-13 и для наглядности представлены на рис. 97-98.
Как следует из представленных данных, при большой инфицирующей дозе вируса все способы применения и дозы камфецина приводили к статистически достоверному снижению смертности животных. Так, при пероральном применении смертность животных понизилась на 66,7% (p=0,0003) и 33,3% (p=0,011) при дозах 100 и 50 мг/кг/сут. соответственно, при внутрибрюшинном – на 46,7 (p=0.004) и 40,0% (p=0.0009) при дозах 15 и 7,5 мг/кг/сут. соответственно, при внутримышечном способе введения - на 46,7 (p=0.0005) и 40,0% (p=0.002) при дозах 20 и 10 мг/кг/сут. соответственно. Применение препарата сравнения Тамифлю снижало смертность животных на 80% (p=0.0000). При малой инфицирующей дозе достоверное снижение смертности отмечалось при пероральном применении камфецина в дозе 100 мг/кг/сут. (ИЗ=62,5%, p=0.049) и использовании тамифлю (ИЗ=75%, p=0.013).
При сравнении эффективности камфецина в зависимости от способа применения было показано, что наибольшей эффективностью он обладает при пероральном применении (Рис.97).
Полученные данные были подтверждены при помощи титрования инфекционной активности вируса в ткани легких (Табл.13, Рис.98). Наибольшая эффективность противовирусной терапии была получена при пероральном использовании камфецина в дозе 100 мг/кг/сут. (p=0.008) и препарата сравнения – Тамифлю (p=0.008). Наибольшие дозы камфецина при внутрибрюшинном и внутримышечном применении также приводили к достоверному ограничению репродукции вируса в легких (p=0.0032 и 0,016 соответственно), хотя эффект в этих случаях был выражен слабее (Табл. 13).
Таким образом, в описанной серии экспериментов показано, что при ежедневном однократном пероральном введении камфецина в дозе 100 мг/кг/сутки смертность животных снижалась на 28,6 – 66,7 % по сравнению с контрольной группой без лечения в зависимости от инфицирующей дозы вируса и режима применения лекарственного средства. Оптимальным режимом применения камфецина является лечебно-профилактический режим. Снижение смертности животных в этом случае достигает 66,7%, а инфекционная активность вируса в ткани легких снижается на 1,9 порядка.
Из трёх изученных способов введения камфецина – пероральный, внутрибрюшинный и внутримышечный – оптимальные показатели противовирусной защиты были достигнуты при пероральном способе. В этом случае снижение смертности животных составило 66,7%, а инфекционная активность вируса в ткани легких снижалась на 1,9 порядка.
Данные по оценке токсикологических свойств камфецина свидетельствуют, что значение его LD50 при пероральном применении лежит в пределах 700-900 мг/кг, тогда как данные по специфической активности позволяют рекомендовать дозировку препарата в районе 100 мг/кг, что не даёт требуемого в фармакологии 10-кратного терапевтического «окна». Исходя из этого, в отдельной серии экспериментов была изучена протективная активность камфецина в диапазоне низких доз в режиме введения животным каждые 6 часов. Результаты приведены в табл.14.
Идентификация мутаций, обусловливающих камфецин-резистентность
Для детальной характеристики свойств камфецин-резистентных штаммов были сравнены аминокислотные последовательности исходного гемагглютинина вируса (PR8), вируса, пассированного в течение 6 пассажей без камфецина (С) и пассированного в течение 6 пассажей в присутствии нарастающих концентраций камфецина (CF). Результаты выравнивания аминокислотных последовательностей приведены на рис. 113 - 114.
Как следует из результатов секвенирования изученных вариантов вируса, у штаммов, полученных в ходе пассирования в клетках MDCK в отсутствии камфецина, отмечалась гетерогеность между клонами по положениям 455, где один из трёх клонов нёс глутаминовую кислоту вместо аспарагиновой (референс-штамм нёс аспарагиновую кислоту), и 475, где один из трёх клонов нёс аргинин вместо глицина (у референс-штамма – глицин). В положении 199 все три клона, пассированные в клетках, несли серин вместо пролина у референс-штамма, что может отражать как специфичность лабораторного штамма в конкретной вирусной коллекции, так и процесс адаптации вируса к культуре клеток.
При этом все три клона вируса, пассированного в присутствии камфецина, в дополнение к замене P199S несли замену HA2 V115L. Таким образом, селекция камфецин-резистентных штаммов сопровождается аминокислотной заменой HA2 V115L.
Для пространственной локализации описанных замен в молекуле гемагглютинина была проведена локализация этих аминокислот на его трёхмерной модели. Результаты визуализации представлены на рис.115.
Моделирование взаимодействия камфецина с вирусным гемагглютинином при помощи метода квантовой механики позволило выявить два сайта связывания. Один из них располагается на границе субъединиц HA1 и HA2, в районе пептида слияния, второй - в нижней части молекулы, в районе сайта протеолиза (Рис.116). Различия в пространственной организации именно этой зоны меняют характер взаимодействия НА с лигандом, разворачивая замещённую аминокислоту у мутанта НА2 V115L и препятствуя тем самым образованию водородных связей, необходимых для формирования прочного комплекса. Энергия связывания в этом случае составляет -16,9 ккал/моль, тогда как для HA дикого типа она вдвое выше (-29,8 ккал/моль). Эти закономерности были подтверждены при расчёте констант диссоциации комплекса камфецина с НА резистентного вируса и дикого типа, которые составили 2.5-10"8 и 1.2-1017 мкМ соответственно.
Расчеты общей энергии молекулы, проведенные при помощи метода молекулярной механики силовых полей 0PLS3 показали, что молекула НА, несущая замену НА2 V115L является более стабильной: значение общей энергии мутантного белка составило - 21898.1 ккал/М, тогда как белка дикого типа - -21869.0 ккал/М. Возможно, повышение стабильности молекулы препятствует ее конформационным перестройкам, что может как минимум вносить свой вклад в снижение патогенности камфецин-резистентного вируса по сравнению с вирусом дикого типа