Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 18
1.1. История сравнения геномов и кариотипов позвоночных 18
1.1.1. Классическая сравнительная цитогенетика 18
1.1.2. Определение числа и морфологии хромосом 18
1.1.3. Методы дифференциальной окраски 19
1.1.4. Сравнительный хромосомный пэйнтинг 21
1.2. Происхождение и эволюция полового размножения 24
1.2.1. Недостатки и преимущества полового размножения 25
1.2.2. Типы полов 28
1.2.3. Половые конфликты и половой отбор 30
1.2.4. Различие между определением пола и половой дифференциацией 31
1.2.5. Половые хромосомы 31
1.2.6. Консервативность биохимических механизмов и генетических каскадов определения пола 33
1.2.7. Состав и эволюция половых хромосом в разных таксонах позвоночных 35
1.2.8. Дозовая компенсация 69
1.2.9. Полиплоидия и определение пола 73
1.2.10. Эволюция половых хромосом и видообразование 75
1.3. Заключение по обзору литературы 77
Глава 2. Материалы и методы 80
2.1. Приборы и материалы 80
2.1.1.Приборы 80
2.1.2. Материалы 80
2.2. Методы 84
2.2.1 Культивирование культур клеток фибробластов и получение суспензии хромосом 84
2.2.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом 85
2.2.3. GTG-бэндинг 85
2.2.4. C-бэндинг 85
2.2.5. Ag-окраска 86
2.2.6. Получение Cot ДНК 86
2.2.7. Локализация кластеров рибосомной ДНК 86
2.2.8. Получение хромосомспецифичных библиотек ДНК 87
2.2.9. Секвенирование ДНК на капиллярном секвенаторе 93
2.2.10. Селекция хромосомспецифичной кДНК 94
2.2.11. Секвенирование на Illumina MiSeq 94
2.2.12. Анализ состава библиотек 94
Глава 3. Результаты и обсуждение 95
3.1. Эволюция половых хромосом плацентарных млекопитающих. Утрата Y-хромосомы и транслокации гоносом на аутосомы 95
3.1.1. Введение 95
3.1.2. Результаты 98
3.1.3. Обсуждение 105
3.2. Сравнение систем половых хромосом однопроходных 109
3.2.1. Введение 109
3.2.2. Результаты 110
3.2.3. Обсуждение 111
3.3. Эволюция половых хромосом чешуйчатых 111
3.3.1. Введение 111
3.3.2. Результаты 116
3.3.3 Обсуждение 140
3.4. Эволюция кариотипов и определение пола у черепах (Testudines) 147
3.4.1. Введение 147
3.4.2. Результаты и обсуждение 147
3.5. Необычная система половых хромосом хвостатых амфибий 151
3.5.1. Введение 151
3.5.2. Результаты 152
3.5.3. Обсуждение 154
3.6. Многообразие систем определения пола и их быстрая эволюция у костистых рыб 158
3.6.1. Введение 158
3.6.2. Результаты 161
3.6.3. Обсуждение 167
3.7. Определение пола у осетрообразных. Пол и полиплоидия 174
3.7.1. Введение 174
3.7.2. Результаты 175
3.7.3. Обсуждение 181
Заключение 187
Выводы 189
Список литературы 192
Введение к работе
Актуальность исследования. Половое размножение уже более сотни лет является ключевой проблемой биологии, которая волновала величайших мыслителей, включая Дарвина, Холдейна, Фишера, Оно и многих других. Несомненно, и сегодня интерес к этой проблеме не угасает, поскольку появление полового размножения очень тесно связано с происхождением и эволюцией эукариот, а современные методы молекулярной генетики и последние открытия палеонтологии позволяют взглянуть на вопрос с новых сторон. Тем не менее, многие вопросы, связанные с половым размножением, так и остаются открытыми. Некоторые исследователи даже назвали половое размножение «главной неразрешенной проблемой биологии» [Williams, 1980]. Так, до сих пор не совсем понятно, каким образом возник такой сложный механизм деления клетки как мейоз и какие адаптивные свойства позволили именно этому довольно затратному типу размножения получить эволюционные преимущества. Относительно недавно было показано, что определение пола у животных контролируется довольно консервативным каскадом генов (хотя последовательность отдельных компонентов может меняться), но вот запуск этого каскада осуществляется с помощью совершенно разных механизмов в разных группах животных, а скорости эволюции определяющих пол систем очень сильно отличаются в разных филогенетических линиях.
Последние несколько десятилетий характеризовались существенным прорывом в разных областях биологии. Секвенирование сначала отдельных сегментов геномов, а затем и целых геномов про- и эукариот дало начало новому направлению науки -сравнительной геномике, направленной на сравнительное изучение содержания и функционирования геномов организмов из разных биологических таксонов. Сравнительное картирование геномов перешло с уровня отдельных генов и описания сходства участков кариотипа до масштабных полногеномных проектов с выявлением функциональных особенностей геномных районов.
Данные, полученные в процессе секвенирования геномов, указывают на особенности их эволюции – скорости фиксации замен на нуклеотидном уровне, амплификаций и делеций повторенных элементов, перегруппировке (дупликации, делеции и транслокации) протяженных сегментов разной длины от нескольких нуклеотидов до целых хромосом и, наконец, изменения плоидности геномов. Именно молекулярные методы позволили описать половые хромосомы и системы определения пола у тех видов, где методы классической цитогенетики были бессильны. В то же время сочетание данных молекулярной геномики и палеонтологии обеспечило исследователей оценками по дивергенции разных таксонов позвоночных, что позволяет еще более точно оценить времена происхождения отдельных половых хромосом (гоносом) на разных участках филогенетического древа и систем определения пола. Время от времени исследователи обобщают информацию об особенностях происхождения и эволюции половых хромосом на разных ветвях филогенетического древа позвоночных, но
новые данные заставляют пересматривать и уточнять картину эволюции гоносом, а также выдвигать новые гипотезы и формулировать новые проблемы.
Цели и задачи работы. Основной целью данной работы является анализ эволюции половых хромосом, способов определения пола и механизмов половой дифференциации у позвоночных из разных таксонов с помощью современных молекулярно-цитогенетических и биоинформатических подходов, включающих как выделение отдельных хромосом с последующим хромосомным пэйнтингом, так и высокопроизводительное секвенирование и анализ состава хромосомспецифичных библиотек ДНК. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: – исследовать стабильность высокодифференцированных половых хромосом плацентарных и выдвинуть гипотезу, объясняющую консерватизм гоносом в данном таксоне;
– изучить виды млекопитающих, представляющих собой исключения из стандартного для этого таксона способа определения пола и выяснить, может ли в данных видах осуществляться переход к другим способам с вовлечением новых генов в каскад определения пола;
– изучить возможную связь половых хромосом с другими малорекомбинирующими элементами кариотипа – добавочными хромосомами;
– изучить системы половых хромосом в таксонах с быстроэволюционирующими системами половых хромосом – рыб, амфибий и завропсид;
– исследовать случаи многократного независимого происхождения половых хромосом в разных таксонах из одной и той же синтенной группы и роли сегментных дупликаций в появлении новых способов запуска половой дифференциации.
Научная новизна. Впервые методы молекулярной цитогенетики в сочетании с технологиями секвенирования нового поколения и сравнительного анализа геномов применены для анализа эволюции половых хромосом на обширной выборке разных таксонов позвоночных (рыбы, амфибии, рептилии и млекопитающие).
Отработаны методы выделения ДНК и получения хромосомспецифичных библиотек из половых хромосом, полученных как сортингом, так и микродиссекцией с последующей амплификацией, секвенированием и анализом состава.
Подтверждена высокая консервативность синтении половых хромосом у плацентарных млекопитающих, хотя и выявлены таксоны, где половые хромосомы подвергаются значительным преобразованиям, вплоть до потери Y-хромосом и вероятного перехода на другой способ запуска половой дифференциации у нескольких видов полевковых. Показано, что транслокации Х-хромосом с аутосомами часто имеют недавнее происхождение.
Предположено, что добавочные хромосомы желтогорлой мыши (Apodemus flavicollis) произошли из псевдоаутосомного района половых хромосом, а также предположено происхождение добавочных хромосом из половых у копытного лемминга (Dicrostonyx torquatus).
Выявлены высокие темпы эволюции и наличие внутривидового полиморфизма систем половых хромосом в нескольких семействах неотропических костистых рыб
(гимнотообразных и харацинообразных). Предположен состав половых хромосом азиатской араваны (араванообразные).
С помощью секвенирования хромосомспецифичных библиотек выявлен состав и особенности эволюции половых хромосом нескольких видов игуановых. Впервые выявлено вовлечение в систему половых хромосом ящериц рода Norops района, гомологичного половым хромосомам обыкновенного удава (Boa imperator), бородатой агамы (Pogona vittiseps) и когтистой шпорцевой лягушки (Xenopus tropicalis). Предположено, что тот же район формирует половые хромосомы геккона Hemidactylus platyurus.
Выдвинута гипотеза происхождения гомоморфных половых хромосом из гетероморфных у бесхвостых амфибий и предположен сценарий этого процесса.
Предположено существование протохромосомы четвероногих, давшей начало большинству выявленных у позвоночных систем половых хромосом.
Положения, выносимые на защиту. Добавочные хромосомы желтогорлой мыши и копытного лемминга произошли из сегментов половых хромосом.
Эволюция систем половых хромосом анолисов (игуановые) включает частые транслокации с мелкими аутосомами (микрохромосомами) у некоторых видов. Транслоцированный материал подвергается постепенному вырождению на Y-хромосомах.
Участок, содержащий ген каскада определения пола RSPO1, независимо принял участие в формировании систем половых хромосом у ящериц Norops sagrei, Pogona vittiseps, Hemidactylus platyurus, а также у удава и когтистой шпорцевой лягушки.
Переход из системы гетероморфных половых хромосом в гомоморфные у хвостатых земноводных произошел путем транслокации Y-хромосомы на аутосому.
Одна из протохромосом предка четвероногих могла включать гомологи большинства выявленных у современных позвоночных систем половых хромосом.
Системы половых хромосом в группах костистых рыб отличаются высокими скоростями эволюции и могут использоваться как модели для понимания подобных процессов у позвоночных.
Состав половых хромосом малоизученных видов позвоночных может быть исследован быстрым и относительно недорогим способом секвенирования микродиссектированных хромосом и их последующим анализом с помощью программы-конвейера DOPSeq_analyzer.
Теоретическая значимость работы и научно-практическая значимость работы. Выявлены особенности строения и эволюции половых хромосом у немодельных видов позвоночных из разных таксонов (млекопитающие, черепахи, ящерицы, амфибии и рыбы). Общее понимание процессов эволюции половых хромосом позволяет понять особенности эволюции геномов эукариот в целом.
Разработанный в ходе работы метод выделения хромосом и последующего анализа генетического состава может быть использован на широком круге объектов,
включающих половые хромосомы, добавочные хромосомы, перестроенные и маркерные хромосомы человека и животных при патологиях.
Выявленные методы анализа половых хромосом могут быть использованы для исследования хозяйственно значимых видов (например, рыб в аквакультуре), где своевременное выявление пола помогло бы существенно оптимизировать производство.
Понимание процессов эволюции половых хромосом необходимо для диагностики и понимания патологических состояний, связанных с половыми хромосомами человека в медицине.
Степень достоверности и апробация результатов. Научные положения и выводы полностью обоснованы. Достоверность результатов обеспечивается внутренней согласованностью и согласием полученных в диссертации результатов с известными результатами, процитированными в диссертации. Материалы диссертационной работы были представлены на второй и третьей B-хромосомной конференции (Гранада, Испания (2004), Гатерслебен, ФРГ (2014)), втором конгрессе Международного общества цитогенетики и геномики, Кентербери, Великобритания (2006), 52-ом бразильском генетическом конгрессе (2006), Международной конференции, посвященной 90-летию академика Д.К. Беляева, Новосибирск (2007), Международной конференции Chromosome (Амстердам, Нидерланды (2007), Болонья, Италия (2013), Фоз ди Игуасу, Бразилия (2016)), 19-ом ежегодном собрании немецкого общества генетики человека, Ганновер, ФРГ (2008), Симпозиуме памяти Г.А. Левитского «Хромосомы и эволюция», Санкт-Петербург (2008), Международной конференции «Хромосома», Новосибирск (2009, 2012, 2015, 2018), 19-м международном коллоквиуме по цитогенетике животных и генетическому картированию, Краков, Польша (2010), Ежегодной конференции немецкого генетического общества, Йена, ФРГ (2010), Второй конференции бразильской цитогенетики, Агуас де Линдойя, Бразилия (2011), Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» Новосибирск (2011), 20-м международном коллоквиуме по цитогенетике животных и генетическому картированию, Кордоба, Испания (2012), 37-м конгрессе общества зоологов Италии Флоренция, Италия (2012), Европейской конференции по генетике человека, Нюрнберг, ФРГ (2012), 21-й Международном генетическом конгрессе, Сингапур (2013), Первой и второй всероссийской конференции с международным участием «Высокопроизводительное секвенирование в геномике», Новосибирск (2013, 2017), 22-м и 23-м Международном Коллоквиуме по цитогенетике и геномике животных (Тулуза, Франция (2016), Санкт-Петербург (2018)), Международной конференции «Водные экосистемы Сибири и перспективы их использования», Томск (2016), Международной мини-конференции «Хромосомы и митоз - 2016», Новосибирск (2016), 11-ой Европейской Цитогенетической Конференции, Флоренция, Италия (2017).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 статей в международных рецензируемых научных журналах, две главы в книгах, а также 54 тезиса в материалах отечественных и зарубежных конференций в 2007-2018 гг.
Вклад автора. Автор принимал участие во всех этапах исследований. В работах по получению хромосомспецифичных библиотек, их картировании, секвенировании и анализе, автор был главным организатором, а также исполнителем большей части исследований (сюда относятся работы по молекулярной цитогенетике плацентарных млекопитающих, чешуйчатых и осетрообразных). В работах по исследованию хромосом костистых рыб, черепах, амфибий, автор принимал участие в приготовлении хромосомспецифичных библиотек ДНК, в анализе результатов и подготовке публикаций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 472 ссылки. Работа изложена на 263 страницах машинописного текста и содержит 37 иллюстраций, 4 таблицы и 6 приложений.
Методы дифференциальной окраски
Следующим важным шагом стало изобретение методов дифференциальной окраски хромосом (С-, G-, R-, Ag- и прочих). На Парижской конференции 1971 года были предложены принципы стандартизации кариотипа человека, основываясь на которых можно было узнавать хромосомы и классифицировать хромосомные аномалии [Paris Conference (1971): Standardization in human cytogenetics, 1972]. Наиболее часто использовались и все еще продолжают играть огромную роль такие методы дифференциальной окраски, как G- и R- бэндинг. Эти методы позволяют получить характерные паттерны поперечных полос на хромосомах и таким образом идентифицировать гомологичные хромосомы. Основываясь на этих окрасках, были созданы хромосомные номенклатуры большинства видов млекопитающих, а также некоторых видов птиц, амфибий и рептилий. Результаты многолетней работы по стандартизации кариотипов млекопитающих были собраны в Атласе хромосом [O Brien, Menninger, Nash, 2006] (в настоящее время подготавливается новая версия этого атласа, включающая данные по сравнительной хромосомике). Несомненно, эти данные послужили основой для работ следующего уровня, сравнивающих целые геномы после их секвенирования и сборки.
Важнейшим источником вариабельности генома на уровне кариотипа являются гетерохроматиновые блоки. Если вычесть размер крупных блоков гетерохроматина, то окажется, что размеры геномов млекопитающих довольно близки по размеру (у рыб, амфибий и рептилий это не всегда так, поскольку вариабельность может обеспечиваться за счет увеличения плоидности, а также за счет экспансии рассеянных элементов генома).
Разные виды млекопитающих очень отличаются по составу, размеру и локализации блоков гетерохроматина. Крупные блоки гетерохроматина выявляются с помощью С-окраски [Hsu, Arrighi, 1971]. Именно сравнения С-окраски показали, что разница в числе хромосомных плеч между близкими видами часто вызвана добавочными плечами гетерохроматина. Гетерогенность состава повторенных последовательностей ДНК, составляющих гетерохроматин и часто попадающих во фракцию сателлитной ДНК, была показана во многих работах и подтвердила высокую эволюционную пластичность этой геномной фракции [Plohl, Metrovi, Mravinac, 2012].
Гетерохроматин может составлять значительную долю генома млекопитающих, достигая 33% ядерного генома у кенгуровых прыгунов Dipodomys [Hatch et al., 1976], 42% у антилоповых сусликов Ammospermophilus [Mascarello, Mazrimas, 1977], 60% у гоферов Thomomys, где размер генома варьирует от 2 до 6 пг [Patton, Sherwood, 1982; Sherwood, Patton, 1982]. Самым крупным размером генома среди млекопитающих (9,2 пг) обладает равнинная вискачевая крыса Tympanoctomys barrerae, для которой на основании размера генома и числа хромосом была даже предположена тетраплоидия [Gallardo et al., 1999], однако более поздние исследования показали диплоидный статус генома с помощью сравнительного хромосомного пэйнтинга [Svartman, Stone, Stanyon, 2005], а мы дополнительно выявили гигантские блоки гетерохроматина, объясняющие увеличение размера генома (наши неопубликованные данные). Недавние сравнительные геномные данные также подтвердили диплоидный статус генома равнинной вискачевой крысы [Evans et al., 2017].
Введение методов дифференциальной окраски в конце 60-х - начале 70-х годов прошлого века стало ключевым этапом в развитии как медицинской, так и сравнительной цитогенетики. Открытие было впервые сделано Касперсоном с соавторами на хромосомах садового боба Vicia faba [Caspersson et al., 1969]. Исследователи обнаружили, что интеркаляция квинакрина формирует паттерн чередующихся темных и светлых полос (Q-бэндов), выявляемых с помощью флюоресцентной микроскопии. Лора Цех вскоре обнаружила, что хромосомы человека могут быть легко отличимы друг от друга с помощью Q-бэндинга [Caspersson, Zech, Johansson, 1970]. Дифференциальная окраска хромосом после обработки трипсином (G-бэндинг) была впервые описана Мариной Сибрайт [Seabright, 1971]. Данный метод позволил довольно быстро и однозначно характеризовать каждую индивидуальную пару хромосом человека и других млекопитающих, используя обычный световой микроскоп. Широкое введение метода произвело революцию в клинической цитогенетике и повсеместно используется до сегодняшнего дня. Вскоре разные группы исследователей стали сравнивать кариотипы филогенетически близких видов, окрашенных с помощью G-бэндинга [Dutrillaux, Couturier, Fosse, 1980; Wurster-Hill, Gray, 1975], появились также работы по сравнению хромосом представителей разных отрядов [Nash, O Brien, 1982]. Близко связанные виды часто имели сходный паттерн окраски и после полувекового сравнения окрашенных бэндингом хромосом были сделаны выводы о некоторой корреляции между консерватизмом паттерна окраски хромосом и филогенетическими отношениями видов, хотя неравномерность скоростей эволюционных преобразований часто усложняет оценку филогенетических отношений, основанную только на консерватизме групп сцепления. Нужно отметить, что хотя в большинстве случаев сходство характера бэндинга отражает сходство генетического состава хромосом, имеется очень много исключений из этого правила.
Дозовая компенсация
У высших эукариот даже мелкие делеции и дупликации генетического материала часто приводят к очень серьезным последствиям, а моносомии по аутосомам практически всегда летальны. Отличия в числе копий генов половых хромосом у гетерогаметного вида требуют особых механизмов, выравнивающих экспрессию продуктов этих генов у самцов и самок.
По мере вырождения Y- и W- хромосом, неизбежно будут затрагиваться гены, чувствительные к дозе. Эту идею уже пол века назад впервые высказал Сусуму Оно [Ohno, 1966], причем он предположил, что скорей всего происходит увеличение экспрессии генов единственной Х-хромосомы самца вдвое, и что такое увеличение экспрессии постепенно включалось по отдельным генам по мере деградации их гомологов на Y-хромосоме. Но если для самцов такая стратегия оказывается выигрышной, то у самок получится избыточная экспрессия данных генов. Выключение одной из Х-хромосом у самок млекопитающих является одним из решений, как можно обойти эту проблему. Другим способом является усиление экспрессии генов с единственной Х-хромосомы у самцов, как это происходит у дрозофилы.
Для детального исследования процессов инактивации и усиления экспрессии у млекопитающих необходимо оценить огромное количество генов. Транскрипция отдельных генов обычно очень сильно варьирует в зависимости от типа ткани, этапа развития и в разные периоды времени в одной и той же клетке, и часто очень сложно определить, произошло ли усиление транскрипции или нет. Однако современные технологии, включающие высокопроизводительное секвенирование, микроарреи и т.д. наглядно показали, что экспрессия Х-хромосомных генов у самцов точно выше, чем аутосомных генов [Brockdorff, Turner, 2015; Deng et al., 2011; Lin et al., 2007]. Интерпретация этих данных усложняется тем фактом, что на Х-хромосоме выше доля тканеспецифичных генов (в том числе и вовлеченных в каскад определения пола) и таким образом значительное количество этих генов будет выключено в большинстве тканей [Meisel, Malone, Clark, 2012]. Скорей всего, усиленно экспрессируются только дозочувствительные гены и эволюционное усиление экспрессии этих генов происходило в соответствии с гипотезой С. Оно [Pessia et al., 2012]. В 1949 году Барр и Бертрам описали блок гетерохроматина, видимый в световой микроскоп на окрашенных ядрах клеток самок различных млекопитающих [Barr, Bertram, 1949]. Прошло 10 лет, прежде чем Оно с коллегами доказали, что эта структура образуется из одной из Х-хромосом [Ohno, 1966]. В 1961 году Мэри Лайон описывает генетические эксперименты по экспрессии генов окраски шерсти, сцепленных с Х-хромосомой, на самках мышей, где она предполагает, что одна из Х-хромосом инактивируется на ранних стадиях развития [Lyon, 1961]. Похоже была показана инактивация у других плацентарных млекопитающих, включая человека, а также правило инактивации всех дополнительных копий Х-хромосом, объясняющих относительную мягкость синдромов с анеуплоидией по Х-хромосоме.
Обе Х-хромосомы активны в ранней зиготе, а процессы инактивации предшествуют клеточной дифференцировке [Epstein et al., 1978]. Обычно инактивация одной из копий (отцовской или материнской) происходит случайно, но у сумчатых и в ранних эмбрионах мышей инактивируется только отцовская копия. Импринтированная инактивация у мышей поддерживается в ранних линиях трофобласта, но инактивированная Х реактивируется в клетках эмбриобласта. Однако повторная инактивация происходит в развивающихся примордиальных клетках [Brockdorff, Turner, 2015].
Инактивация Х-хромосом млекопитающих осуществляется на уровне хроматина путем модификации гистоновых хвостов, включения или исключения вариантов гистонов, метилирования ДНК и реорганизации структуры хроматина. Интересно, что система довольно сложно устроена и избыточна, так как не все компоненты системы необходимы для инактивации [Sado et al., 2004]. Некоторые гены и районы хромосомы не подвергаются инактивации. Наиболее известный пример – псевдоаутосомный район (PAR – pseudoautosomal region). Расположенные в PAR гены не требуют дозовой компенсации, т.к. присутствуют в виде двух копий у обоих полов. Более 15% генов Х-хромосомы также не инактивируются. Самое интересное, что большинство из них лежат в коротком плече предкового для плацентарных типа X-хромосомы, т.е. относительно недавно приобретенном районе [Carrel, Willard, 2005].
Инактивация Х-хромосомы начинается в центре инактивации Хic (X Inactivation Center). С гена Xist (X-inactive-specific transcript) транскрибируется длинная некодирующая РНК, обладающая способностью связываться с местом транскрипции и накапливаться по всей длине хромосомы [Brockdorff et al., 1992]. Насыщение хромосомной территории РНК Xist служит триггером для инактивации [Wutz, Jaenisch, 2000]. Вторая некодирующая РНК – Tsix – также образуется в центре инактивации и регулирует экспрессию Xist [Lee, Davidow, Warshawsky, 1999]. Гены Xist и Tsix перекрываются и считываются в противоположных направлениях. Сравнительные эволюционные исследования показали, что ген Xist образовался у предка плацентарных млекопитающих из кодирующего белок гена Lnx3 [Duret et al., 2006]. У сумчатых же возник другой локус, Rsx (RNA on the silent X), выполняющий аналогичную функцию [Grant et al., 2012].
Процесс инициации инактивации должен тщательно регулироваться. У самцов он не должен запускаться вообще, а у самок только единственная Х-хромосома должна быть вовлечена в процесс инактивации. Существуют два способа регуляции: импринтинговый способ инактивирует отцовскую Х-хромосому, а случайный может выключать как отцовскую, так и материнскую. У сумчатых происходит именно первый способ, а у плацентарных случайный способ работает на эмбриональных стадиях развития и импринтированный в постэмбриональных. Некоторые виды используют только случайный механизм [Brockdorff, Turner, 2015].
Недавно было проведено сравнение уровня транскрипции с аутосом и половых хромосом у самцов и самок представителя чешуйчатых - каролинского анолиса (Anolis carolinensis). Авторы представили доказательства наличия дозовой компенсации как между полами, так и между половыми хромосомами и аутосомами. Интересно, что район Х-хромосомы, соответствующий группе сцепления LGb, подвергается полной дозовой компенсации, тогда как другие контиги с Х-хромосомы подвергаются только частичной дозовой компенсации. Как и у млекопитающих, у игуановых происходит усиление транскрипции генов Х-хромосом у самцов. Около 10% всех кодирующих белок генов (и аутосом и половых хромосом) экспрессируются у самцов и самок дифференциально. Повышенный уровень несинонимичных мутаций в генах Х-хромосомы свидетельствует об эффекте быстрой эволюции Х-хромосом [Rupp et al., 2016].
Результаты
Мы провели хромосомный сортинг культуры фибробластов самца копытного лемминга (2n=45, плюс 9-13 добавочных хромосом) и получили 29 пиков, содержащих ДНК как отдельных хромосом, так и их смесей (рис. 4). Все полученные библиотеки мы пометили и гибридизовали на хромосомы лемминга для характеризации их состава. Добавочные хромосомы попали в восемь разных пиков (иногда в смеси с аутосомами), что свидетельствует о значительной гетерогенности этих элементов по размеру и ГЦ-составу.
Результаты пэйнтинга показали, что половые хромосомы, как и предполагалось ранеe [Fredga, 1983], оказались вовлеченными в транслокации с аутосомами. Так, произошла транслокация одной крупной аутосомы (содержащей участки гомологии хромосом 6 и 12 пашенной полевки) на Х–хромосому (с образованием крупнейшего метацентрика Х1) и, как предполагал Фредга, вероятно, той же аутосомы на Y-хромосому, причем на эту Y-хромосому дополнительно транслоцировалась мелкая аутосома (гомологичная хромосоме 18 пашенной полевки) и сформировалась система (Х1YХ2 – рис. 5 и 6).
Для изучения добавочных хромосом копытного лемминга мы создали библиотеку кДНК из культуры клеток самца и провели обогащение этой библиотеки с целью увеличения доли фрагментов, гомологичных добавочным хромосомам лемминга по описанному нами протоколу [Trifonov et al., 2013]. Полученная обогащенная библиотека пометила добавочные хромосомы более специфично, чем исходная сортинговая библиотека (рис. 7). Мы провели клонирование последовательностей из обогащенной библиотеки в плазмидный вектор. В результате секвенирования пятнадцати отобранных клонов, мы выявили в основном повторенные элементы, но некоторые клоны были гомологичны гену Ofd1 (позже еще четыре клона того же гена были обнаружены в библиотеках добавочных хромосом А.И. Макуниным).
Обсуждение
Цитогенетические исследования осетровых показали, что виды имеют высокое число хромосом, причем именно изучение цитогенетических особенностей обыкновенного лопатоноса (Polyodon spathula) повлияло на формирование гипотезы С. Оно о роли полиплоидии в эволюции животных, что сильно противоречило представлению об эволюции как о медленном и постепенном процессе [Ohno, 1970]. Позже было показано, что полиплоидизация была важным эволюционным механизмом у большинства современных позвоночных [Dehal, Boore, 2005; Lynch, 2002; Taylor, Raes, 2004]. Интересно, что среди позвоночных полиплоидия чаще всего отмечается у рыб и амфибий, и в этих группах важно проследить, насколько процессы полиплоидизации связаны с генетическими системами определения пола.
Осетровые являются группой, где процессы полиплоидизации имели место несколько раз в разных линиях [Birstein, DeSalle, 1998; Ludwig et al., 2001] (рис. 36) и факты обнаружения спонтанных полиплоидов подтверждают, что этот процесс все еще продолжается.
Осетровые представляют большой интерес благодаря общей консервативности как внешних морфологических признаков, так и генома. Вероятно, именно с этим связано то, что в этой группе так много межвидовых гибридов (описано более 20 [Havelka et al., 2011]). Причем часть из этих гибридов сформировалась в естественных условиях обитания видов. Конечно, предполагается, что в естественных условиях существуют серьезные барьеры для скрещивания видов, поскольку в некоторых местах ареала много видов существует симпатрично.
Предположив, что 120-хромосомные кариотипы осетров и веслоносов состоят из гомологичных элементов, можно оценить время возникновения первого этапа полиплоидии в этой группе как 200 млн. лет назад – время дивергенции отрядов [Peng et al., 2007]. При этом гаплоидный предок скорей всего содержал 30 пар хромосом, что очень близко к предковому кариотипу костных рыб, реконструированному Накатани с соавторами [Nakatani et al., 2007]. Очень похожим кариотипом обладает и панцирная щука – базальный вид костистых рыб с 29 парами хромосом [Braasch et al., 2016], и наши данные по секвенированию хромосом стерляди подтверждают консерватизм синтении между осетровыми и панцирниковыми. С другой стороны, в последнее время накапливается все больше данных о том, что события удвоения генома могли произойти независимо у осетровых и веслоносовых [Symonov et al., 2017].
Еще три события полиплоидизации произошли впоследствии в семействе осетровых. Так, в тихоокеанской кладе дополнительное удвоение генома привело к 250-хромосомным кариотипам, наблюдаемым сегодня у семи видов. Независимое удвоение генома произошло в атлантической линии около 50 млн. лет назад, когда сформировались кариотипы шести современных видов с 250 хромосомами. Наконец, еще одно дополнительное удвоение генома случилось в линии малого осетра, где сформировался кариотип с 372 хромосомами [Kim et al., 2005] (рис. 35). Спонтанные случаи полиплоидизации описаны в популяциях сахалинского осетра [Zhou et al., 2011], сибирского осетра [Havelka et al., 2016], стерляди [Havelka et al., 2013] и белого осетра [Drauch Schreier et al., 2011].
Консерватизм систем определения пола можно предположить на примере бестера (гибрида между белугой и стерлядью [Burtzev, 1969]), где показан нормальный мейоз и соотношение полов в потомстве, несмотря на 85 млн. лет эволюции, разделяющих эти виды [Peng et al., 2007].
Большинство экспериментов с использованием индуцированного гиногенеза у осетрообразных показали, что потомство состояло как из самок так и из самцов, что свидетельствовало в пользу определения пола ZZ/ZW [Flynn et al., 2006; Fopp-Bayat, 2010; Omoto et al., 2005; Saber, Hallajian, 2014; Shelton, Mims, 2012; Van Eenennaam et al., 1999]. Однако эксперименты по андрогенезу на сибирском осетре неожиданно привели к появлению одной самки [Grunina et al., 2011], впрочем, гиногенез у этого вида тоже привел к появлению разнополого потомства. Учитывая высокую скорость смены систем определения пола у разных видов костистых рыб, можно предположить, что у разных видов осетровых также могут действовать разные системы определения пола, однако, это создало бы трудности при межвидовом скрещивании.
Недавние работы по сравнительной геномике и транскриптомике осетровых позволили оценить роль генов, вовлеченных в процессы развития пола [Hale et al., 2009; Vidotto et al., 2013; Yue et al., 2015]. В этих работах были обнаружены дифференциально экспрессирующиеся гены в гонадах самцов и самок озерного, адриатического и китайского осетров. То, что ген-определитель пола так и не был обнаружен, может быть связано с его очень коротким действием в определенный период развития, после чего активируются каскады, консервативные у всех позвоночных. Кроме того, все изученные животные относятся к группе тетраплоидов, что сильно затрудняет анализ. Мы надеемся, что работы на диплоидных осетровых с применением таких чувствительных методов как RAD-секвенирование смогут значительно улучшить наши знания об определении пола в этой реликтовой группе рыб.
Связь полиплоидного статуса и предположительно консервативной системы пола должны быть рассмотрены отдельно. Механизм определения пола должен быть настроен очень четко, поскольку любые промежуточные варианты будут менее приспособленными. Анеуплоидии по половым хромосомам, описанные у позвоночных, известны своей высокой жизнеспособностью по сравнению с анеуплоидиями по аутосомам, однако часто связаны со стерильностью. Если у осетровых имеется предполагаемая система ZZ/ZW, то удвоение такого генома приведет к автополиплоидным ZZ и ZW яйцеклеткам (если предположить, что WW гаметы будут нежизнеспособны) и ZZ сперматозоидам, а потомство во втором поколении будет ZZZW/ZZZZ. Альтернативно, процесс может пойти через ZZW триплоидных самок, с таким же результатом. Случайное расхождение Z- и W-хромосом приведет к увеличению частоты самок в популяции, но селекция на отношение полов будет слабее чем, в системе XX/XY [Wertheim, Beukeboom, Zande van de, 2013] (рис. 37). Дополнительная пара Z-хромосом может стать избыточной и перестать синаптировать с W-хромосомой, что приведет к функциональной диплоидизации. Самая главная особенность такой системы это сохранение полоопределяющей функции W- хромосомы. Поскольку дозовая компенсация была бы очень проблематичной для видов с сильно вырожденной W-хромосомой, похоже что W сильно похожа на Z-хромосому (скорей всего отличается минимально). Однако мы не можем исключить, что в данном случае имеет место ситуация, описанная у лососевых, где локализация главного локуса определения пола очень вариабельна и каждая линия получала новый вариант расположения этого локуса при видообразовании [Phillips, 2013]. Однако эксперименты по межвидовой гибридизации лососевых были не такими удачными, как при гибридизации осетровых [Makhrov, 2008], что может указывать на влияние лабильности локуса определения пола.