Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирусные гепатиты человека представляют одну из важнейших медицинских проблем, все еще далекую от своего разрешения. На сегодняшний день, как и прежде, сохраняется высокий эпидемический потенциал всех известных вирусных гепатитов. При этом вирусный гепатит А (ГА) по своей распространенности и причиняемому экономическому ущербу в ряде стран мира , в том числе и в нашей стране (Онищенко Г. Г., 1997 ), занимает доминирующее положение. По данным ВОЗ, учтенная заболеваемость ГА в мире в первую половину 90-х годов составляла около 1,5 млн случаев в год. Однако по данным серологических исследований зарегистрированные случаи ГА составляют всего 15-20% от их общего числа ( Соринсон С.Н.,1996; Gust T.D.1992; Papaevangelou G.1992).
Сохранение высокого уровня заболеваемости ГА несмотря на многолетние изыскания путей и способов повышения эффективности мероприятий сашітарно-протавозпидемического характера для борьбы с этой инфекцией , а также применеїшя и совершенствования системы иммуноглобулинопрофилак-тики ГА (Ананьев В.А. с соавт.,1958, Алейник М. Д.,1968, Горбунов М.А., 1988; Winocur P.L., 1992) обусловили настоятельную необходимость разработки препаратов для диагностики и вакцинопрофилактики этой инфекции. Основой для их создания явились крупнейшие научные достижения 70-х годов, связанные с открытием вируса гепатита A (Feinstone S. et.al.., 1973) , адаптацией изолятов ВГА к размножению в культурах клеток ( Provost Ph. et.al.., 1979) и получением высокоэффективных систем репродукции ВГА in vitro.
На основе ВГА, выращенного в культуре клеток, в восьмидесятые годы за рубежом, а затем и у нас в стране были разработаны тест-системы для вы-ївлення основных маркеров ГА антигена ВГА ( АГ ВГА), иммуноглобулинов иіасса М к ВГА ( анти-ВГА IgM ), а также суммарных антител к ВГА, пред-лгавлешшгх преимущественно иммуноглобулинами класса G ( анти-ВГА антител).
Наряду с созданием диагностических препаратов проводились научные исследования по созданию вакцин против гепатита А: инактивированных, живых, а также полученных с помощью генноинженерных методов. Наиболее перспективными для внедрения в практику здравоохранения оказались целыю-вириошше инактивированные вакцины.
В нашей стране коллективом авторов ИПВЭ им .МП. Чумакова РАМН ( Балаян М.С., 1988, Кусов Ю.Ю. с соавт., 1989) в результате адаптации ВГА к линии гетероплоидных клеток почек зеленой мартышки 4647, аттестованной в соответствии с требованиями ВОЗ (Миронова Л.Л., с соавт.,1987) и рекомендованной ГИСК им.Л.А.Тарасевича для получения инактивированных вирусных вакцин, были разработаны основы технологии приготовления и созданы первые серии цельновирионной инакшвированной культуральной вакцины против гепатита А «Геп-А-ин-Вак», крупномасштабное производство которой в настоящее время освоено в НПО «Вектор» (г. Новосибирск). Параллельно аналогичные вакцины разрабатывались за рубежом (Provost P. et al.,1986; Flehmig В. et al.,1987; Andre F. et al.,1990). В настоящее время их производство освоено в Бельгии (фирма «Smith Kline Beecham Biologicals»), в США (фирма «Merk Sharp & Dohme»), во Франции (фирма «Pasteur Merieux Connaught» ).
Необходимым условием внедрения новых медицинских иммунобиологических препаратов ( МИБП) в практику здравоохранения является наличие адекватных и стандартных методов их коїггроля , а также требований к их качеству. К началу наших исследований (1986 г.) проблемы, связанные с разработкой и стандартизацией методов оценки качества препаратов для диагностики и профилактики ГА , являлись не изученными. Отсутствовали как национальные , так и международные требования к основным параметрам их качества . Не было рекомендаций ВОЗ в отношении методов их коїггроля, а также не бьши предложены соответствующие международные стандартные образцы и референс-препараты для оценки их качества. Решение этих проблем , как и многих других задач, связанных с внедрением в практику отечественного здра-
воохранения новых МИБП, возложены на ГИСК им. Л.А. Тарасевича. В соответствии с действующими законодательными актами ГИСК им. Л. Л. Тарасевича является Национальном органом контроля РФ, ответственным за качество внедренных в практику и выпускаемых в нашей стране МИБП.
Цель и задачи исследований. Исходя из вышеизложенного основная цель работы состояла в разработке и стандартизации методов контроля, а также требований к качеству препаратов для диагностики и профилактики гепатита А.
Для выполнения поставленной цели основные задачи исследования решались в трех взаимосвязанных направлениях:
1. Разработка и стандартизация средств для оценки качества препаратов для диагностики и профилактики гепатита А:
получение национальных стандартов - отраслевых стандартных образ-дов (ОСО) к основным маркерам ГА ;
сравнительное изучение различных штаммов ВГА, используемых для троизводства препаратов для диагностики и профилактики ГА с целью разработки требований к производственным штаммам.
L Разработка системы стандартизации , аттестации и методов опенки качества ірепаратов для диагностики гепатита А. в частности;
тест-систем для выявления IgM к ВГА ;
тест-систем для выявления суммарных антител к ВГА, представленных преимущественно IgG;
тест-систем для выявления антигена к ВГА.
совершенствование системы аттестации новых препаратов для диагно-
тики гепатита А по лабораторным тестам с применением разработанных
тандартов и в ктпшко-эпидемиологических испытаниях при использовании
еференс-препаратов сравнения;
составление и апробация унифицированной математической модели и
спользование ее, а также разработанной на ее основе компьютерной програм-
мы для оценки эффективности диагностических препаратов в клинико-эпидемиологических испытаниях;
изучение и сравнительная оценка диагностической эффективности
тест-систем для выявления различных маркеров ГА и определение области их
применения для практического здравоохранения.
3. Разработка системы стандартизации , методов коїпроля и требований к качеству инактивированных вакцин, в частности:
подлинности антигена ВГА в вакцинном препарате при использовании разработанных ОСО, содержащих и не содержащих антитела к ВГА:
специфической безопасности в тесте определения полноты инактивации ВГА in vitro;
специфической активности , оцениваемой in vitro и в опытах на лабораторных животных;
сравнительное изучение качества вакцин отечественного и зарубежного производства в экспериментальных и клинических исследованиях на добровольцах с целью оценки адекватности и информативности разработанных лабораторных методов и требований к основным показателям их качества.
Научная новизна.
Впервые научно обоснованы принципы стандартизации и контроля препаратов для диагностики и вакцшюпрофилактики ГА , а также разработаны национальные требования к показателям их качества. С этой целью: :
разработаны и получены первые национальные стандарты - отраслевые стандартные образцы ( ОСО) к основным маркерам гепатита А , а также ОСО панели сывороток с заданными характеристиками;
разработаны методы контроля и требоваїшя к производственным штаммам ВГА для получения диагностических и профилактических препаратов.
Применительно к препаратам для диагностики ГА:
разработаны методы контроля и впервые сформулированы лабораторные критерии оценки их качества, адекватность которых подтверждена результатами клинико - эпидемиологических исследований;
усовершенствована система аттестации тест-систем для выявления различных маркеров ГА - анти-ВГА IgM , анти-ВГА антител, антигена ВГА , включающая лабораторные тесты при использовании полученных стандартов и клинико-эпидемиологические исследования с применением ре-ференс-препаратов сравнения;
предложен и апробирован унифицированный подход к оценке качества любых диагностических препаратов при их полевых испытаниях, математический алгоритм которого явился основой разработанной компьютерной программы «ДИАТЕСТ».
при использовании унифицированной системы аттестации препаратов впервые получены сравнительные данные оценки диагностической эффективности отечественных и зарубежных тест-систем, предназначенных для выявления различных маркеров ГА, и определена область их применения для практики здравоохранения.
Применительно к инактивированным вакцинам против гепатита А:
разработан метод определения подлинности АГ ВГА в вакцинных препаратах в ИФА с помощью ОСО;
стандартизован метод контроля и сформулированы требования к специфической безопасности вакцин в тесте на полноту инактивации ВГА in vitro, эффективность которых подтверждена результатами экспериментальных и клшгаческих исследований .
разработаны методы контроля и требоваїшя к специфической активности инактивированных вакцин, определяемой по содержанию в них АГ ВГА в ИФА и иммупогениой активности в опытах на экспериментальных животных ( морские свинки, аутбредные мыши); установлена адек-
ватность экспериментальной модели на животных для оценки иммуно-генной активности вакцины против ГА.
по результатам доклинических и клинических исследований впервые получены сравнительные данные о качестве первой отечественной вакцины "Геп-А-ин-Вак" на этапах ее разработки и промышленного выпуска в сопоставлении с ее зарубежными аналогами - инактивировшшыми вакцинами против гепатита A -"HAVRIX -1440" ( фирма Smith Kline Beecham Biologicals" I Бельгия/) и «VAQTA» (фирма «Merk Sharp &Dohme» /США/).
Практическая значимость
Работа имеет практическую направленность и посвящена разработке , совершенствованию и стандартизации средств и методов, определяющих качество препаратов для диагностики и профилактики ГА.
Получены и внесены в реестр отраслевых стандартных образцов , применяемых на предприятиях Минздрава РФ и других ведомств, выпускающих МИБ1Г, первые национальные стандарты к основным маркерам ВГА: ОСО сывороток, содержащие и не содержащие суммарные антитела к ВГА , представленные неимущественно IgG (ОСО 42-28-158-89, ОСО 42-28-178-90); ОСО сывороток, содержащие и не содержащие антитела к ВГА , представленные преимущественно IgM, которые приготовлены в виде моностандартов (ОСО 42-28-162-89, ОСО 42-28-163-89) и панели сывороток (ОСО 42-28-220-96). На указанные препараты составлена и утверждена нормативная документация (НД) -"Свидетельства" и "Инструкции по применению".
Разработанные с использованием утвержденных ОСО методы контроля и требования к основным показателям качества первых отечественных препаратов для диагностики и профилактики ГА сформулированы в утвержденных Минздравом РФ нормативных документах (НД) - ВФС и ФС. ( табл.1)
Таблица 1.
Перечень утвержденных НД на препараты для диагностики и профилактики гепатита А, контроль которых осуществляется с использованием разработанных ОСО
Наименование препарата ; Используемые Номер НД
^У::-:''\': :A}/L,\-} '_'-:['- ОСО ';_':.;' ;-,. У"'J'-: :".';-]
Тест-системыиммунофермент-' ОСО42-28-162-89 . . і .'".',,,. vv нЬIe для выявления анта-ВГА : ; ОСО 42-28-163-89 /,; ; ": , '
.igM'.;7,.:. '''.:., .'''''-:' .'; :.'>';',.- :-/>-.*:-У^--^--^
' "ДЙАГНАГЕП' .. , '_'.'. .1 " -" ;ВФС 42-218 ВС-89 ,-;
;»:"ИФАанти-ВГА1М"^'\'.;: "-" ^"ВФС'^ЗЗІ-ВС-М" ;
V^BEKTOrEn^AIglyT::...'. "-" «:ВФС 42-364 ВС-92' і
ifc^'BEKTOrai-AIgM^'-;.!' .-.) -J ОСО42-28-22О-96 ^ФС. 42-3304-96.'":','.'
.' /'MOAaHTH-BrAIgMCn'; ;i "-" :*\ ВФС 42-2827 -96 "V;
Тест-системьг иммунофермент-; ОСО 42-28-158 - 88 ' /-.. ;
ные для выявления антител к " 0С042 ?8 178 90 '' - ''"'''': '
ВГА''. ,'.-'' J ;.;,/- .'К ---4. -:.",-.'.: * ." '" ' -.,'' .'.'.''"'..'^:/
"ИФЛантй-ВГАІ.-. ;; Ц:, \] -"- > ВФС42-420ВС-94 ''
'\'ВЕКТО^-Л.7о."%-.^-:--:^-,- ""- >ВФС42/Д016ВС-95:
Тест-система иммунофермент-,; -"- ,ВФС-42-3678-97- ''-.I
нал для выявления антигена к ;' ''',; :'- '-- ,,,'"* - ..''..':{
:ВГА "«Вектогеп-А-антиген".;..'[ .'.- ',. ";""";\Л . '«
Инактивированная вакцина ге- < -"- > ВФС-42-2747-96 :
'пзтата.А;^ГЩ7-А-ин-ВАК:; ,;: - Л. -,;:';'/;., .,':.'.'. : J
На основании проведенных нами лабораторных и клинико- эпидемиологических исследований препаратов для диагностики ГА в практику здравоохранения рекомендованы:
Тест-системы иммуноферментные для выявления иммуноглобулинов класса М к ВГА, предназначенные для ранней дифференциальной диагностики гепатита А:
- «ДЙАГНАГЕП» (ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН, Москва);
- « ВЕКТОГЕП-А IgM» ( ЗАО « Вектор-Майстар», Новосибирск);
« ИФА анти-ВГА IgM» (НПО «Диагностические системы» , Н.Новгород);
« ИФА анти-ВГА IgM СП» (НПО «Диагностические системы», Н. Новгород»).
Тест-системы иммуноферментные для выявления антигена вируса гепа
тита А в инфицированных ВГА клеточных культурах и их производных (в разо
вых и объединеттых вирусных сборах на производстве препаратов для диагно
стики и вакцинопрофилактики ГА):
«ИФА- антиген- ВГА» (НПО «Диагностические системы», Н. Новгород);
« ВЕКТОГЕП-А-антиген» ( ЗАО « Вектор-Майстар», Новосибирск )
Тест-системы иммуноферментные для выявления антител к ВГА в сы
воротке, иммуноглобулинах и плазме крови людей и экспериментальных жи
вотных, предназначенные для изучения иммуноструюуры населения к ВГА ,
для оценки иммуногенной активности вакцин в экспериментальных и клиниче
ских исследованиях, а также для других научно- производственных целей,
предполагающих определение уровня анти-ВГА антител в препаратах крови.
- " ИФА анти-ВГА "(НПО « Диагностические системы», Н.Новгород)
- " ВЕКТОГЕП-А-антитела" (ЗАО « Вектор-Майстар», Новосибирск).
Результаты экспериментальных и клинических исследований инактиви-
рованной вакцины против гепатита А "Геп-А-ин-Вак", свидетельствующие о ее специфической безопасности, слабой реактогенности, выраженной иммуногенной активности, а также высокой профилактической эффективности , позволили обеспечить внедрение первого отечественного препарата для активной профилактики ГА в практику здравоохранения. Регламентировшпше утвержденными на вакцину "Геп-А-ин-Вак" нормативными документами ( ВФС) методы контроля и национальные требования к инактивированным вакцинам против ГА позволяют не только осуществлять надзор за качеством серийно выпускаемого
отечественного препарата , но и проводить аттестацию аналогичных зарубежных вакцин при их регистрации в РФ.
Основные положення, выносимые на защиту
Разработка и применение национальных стандартов для оценки качества препаратов для диагностики и профилактики ГА- ОСО сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВГА ,представленные иммуноглобулинами различных классов; ОСО сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВГА , представленные преимущественно иммуноглобулинами класса М, приготовленные в виде моностандартов и панели сывороток с заданными характеристиками.
Сравнительная характеристика антигенной специфичности и репродуктивной активности производственных штаммов ВГА, используемых для получения диагностических и профилактических препаратов в промышленных условиях ; методы контроля и требования к их основным свойствам .
Критерии и методы контроля основных параметров качества препаратов для диагностики ГА:
тест-систем для выявления иммуноглобулинов класса М к ВГА ;
тест-систем для выявления суммарных антител к ВГА;
тест-систем для выявления антигена к ВГА.
Система апробации и внедрения новых диагностических препаратов для выявления различных маркеров ГА , основанная на лабораторном изучении препаратов с помощью разработанных стандартов и клинико-эпидемиологичес-ких испытаний с использованием референс-препарата сравнения.
Унифицированный подход к оценке качества диагностических препаратов на основе математического алгоритма с использованием разработанной на его основе компьютерной программы «ДИАТЕСТ».
Сравнительная характеристика отечественных и зарубежных препаратов для диагностики ГА на основе лабораторных и полевых исследований.
Система национальных требований и методов оценки основных показателей качества инактивированных вакцин против ГА:
подлинности антигена ВГА в вакцинных препаратах с помощью разработанных стандартов;
специфической безопасности в тесте на полноту инактивации ВГА in vitro;
специфической активности по определению содержания АГ ВГА по данным ИФА и иммуногешюй активности в опытах на лабораторных животных.
Сравнительные результаты оценки качества отечественной инактиви-рованной вакцин против ГА по результатам доклинических и клинических исследований в сопоставлении с зарубежными аналогами.
Апробация работы. Основные результаты диссертационных исследований были представлены на Научной юбилейной конференции ГИСК им. Л. А. Тарасевича "Состояние и перспективы профилактики и диагностики инфекционных болезней человека" (Москва, 1988); на Международном симпозиуме "Вирусные гепатиты" (Ростов, 1990); Всесоюзной конференции " Энтеро-вирусы, общетеоретические и медицинские аспекты." ( Киев, 1991 г.); на Всероссийской научно - практической конференции " Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики" ( Пермь, 1993); на Международном симпозиуме "Разработка вакцин против вирусных инфекций " (Новосибирск, 1994), на Фальк симпозиуме №92 " Новые направления в гепато-логии " ( Санкт- Петербург, 1996). В завершенном виде диссертационная работа
была доложена и обсуждена на заседании Ученого Совета ГИСК им.Л.А.Тарасевича ( Москва, 1997)
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 336 страницах и состоит из введения , обзора литературы ( 3 главы) , раздела собственных исследований (6 глав), обсуждения и выводов. Диссертация иллюстрирована 60 таблицами и 30 графическими рисунками. Библиографический указатель включает 498 источников литературы отечественных и зарубежных авторов.