Введение к работе
Актуальность темы. Известно, что из четырех болезней, протекающих с везикулярным синдромом, наибольшую угрозу представляет ящур. Однако, вероятность эпизоотического распространения остальных при современных интенсивных международных контактах сохраняется для любой страны, в том числе и для СНГ (Шажко Ж.А., 1989), поэтому программы научных и диагностических исследований в той или иной степени должны исходить из необходимости одновременной работы с возбудителями ящура, везикулярной болезни свиней (ВБС), везикулярной экзантемы свиней (ВЭС) и везикулярного стоматита, их идентификации и дифференциации друг от друга в случае изоляции от больных животных. Поскольку клинические признаки при перечисленных заболеваниях сходны (Вишняков И.Ф., 1983, Walker J.M., 1984) эти инфекции могут быть дифференцированы только при помощи лабораторных исследований, включающих вирусологические и серологические методы (Berger N. et. al., 1989).
В течение многих лет для диагностики вирусных болезней широко применялись многие методы, основанные на иммунохнмической реакции антиген-антитело. При этом был выяплен ряд недостатков этих методов, часть которых обусловлена не только методическими приемами их постановки, но и специфическими особенностями используемых иммунореагентов. Особенно важное значение при использовании некоторых методов для диагностики имеют гипериммунные сыворотки, поликлоиальные антитела в которых не всегда обладают требуемой специфичностью, особенно при классификации и систематике штаммов возбудителей, обладающих плюралитетом В этом плане наиболее перспективным направлением является усовершенствование технологии получения моноклональных антител (МАт).
Уникальность их характеристик в настоящее время широко используется при решении проблем стандартизации диагностических методов, повышения их достоверности, чувствительности и специфичности (McCullough К.С, 1986). Они позволяют выявлять искомые антигены в препаратах, содержащих смесь контаминирутоших агентов разных таксономических групп, концентрация которых может в тысячи раз
превьішаїь конпепграпию идентифицируемого возбудителя (Черных А.А. с соаві.. 1992). Использование МАт в таких градицнонных иммунохимических реакциях, как РДП. РПГА. РИГА. РТГА, реакции лагекс-агглюгинации, ПФА. иммупоблоттинге позволяет значительно улучшить их характеристики и расширить сферу применения (Дельвиг А.А. с соавт., 1987, Yewdell J.W. et. al., 1981).
В области ветеринарной вирусологии наиболее важной и методологически сложной является проблема дифференциальной диагностики вышеназванных болезней с везикулярным синдромом. Для ее решения в последние годы получены моноклональпые антитела к возбудителям ящура различных типов (Глобенко Л.А., 1987, Butchainh G. и Rao B.U., 1989, Meloen R.H. и Barteling S.I., 1983, Robertson B.H. и Morgan D.O., 1984, Simone F. et. al., 1983 и др.) и везикулярному стоматиту (De Bishnu P. et. al. 1982, Ye Z. et. al., 1985, Ogden S.R. et. al., 1986 и др.). Благодаря им удалось получить новые данные об антигенной структуре возбудителей, усовершенствовать методы лабораторной диагностики вызываемых ими болезней, проводить более точную идентификацию их эпизоотических штаммов.
В то же время сведений о получении МАт к вирусам ВБС и ВЭС в доступной нам литературе мы не обнаружили. Между тем, исходя из необходимости унификации методов диагностики не только ящура, но и других болезней с везикулярным синдромом, а также более надежной идентификации эпизоотических штаммов их возбудителей, получение моноклональиых антител к последним представляет как научный, так и научно-практический интерес.
Цели и задачи исследований. Целью настоящего исследования было получение гибридных клеток, секретирующих моноклональпые антитела к вирусам ВБС и ВЭС, а также изучение возможности их использования при дифференциальной диагностике болезней с везикулярным синдром.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
- получить высокоочищенные препараты возбудителей ВБС и ВЭС :ьпя иммунизации лабораторных животных и проведения иммунохимических реакций;
- отработать технологию получения гибридом, секретирующих МАг к
вирусам ВЭС и ВВС;
оптимизировать методики изготовления специфических
иммунореагентов на основе МАт для идентификации типовой
принадлежности возбудителей ВЭС и ВВС;
- оценить в сравнительном аспекте полученные иммунореагенты и
традиционные поликлональные диагностикумы при дифференциальной
диагностике болезней с везикулярным синдромом.
Научная новизна работы. Получены не имеющие аналогов в стране и за рубежом штаммы гибридных клеток, продуцирующих МАг к вирусу везикулярной болезни свиней типов 0-72 и Т-75 и везикулярной экзантемы свиней типов С-72 и А-48.
Отобраны клопы, секрстируюшне МАт к указанным возбудителям со строго определенной типовой специфичностью if выраженными вируснейтрализующими свойствами.
Изучены свойства этих антител в различных иммунохимических реакциях и отобраны клоны, пригодные для идентификации типовой принадлежности возбудителей ВЭС и ВВС.
Научная новизна проведенных исследований подтверждена положительным решением ВНИИГПЭ на выдачу патента РФ (приоритет № 97113822/13 (014570) от 11 августа 1997 г.).
Практическая значимость работы. Разработана "Методика получения высокоочишенных и концентрированных препаратов вируса везикулярной экзантемы свиней и вируса везикулярной болезни свиней", утвержденная директором ВНИИЗЖ 26.03.93.
Получена коллекция штаммов гибридом, секретирующих МАт к вирусам ВЭС типов С-72 и А-48 и ВВС типов 0-72 и Т-75. с высокой стабильностью и антителопродуцируюпгей активностью, часть которых депонирована во Всероссийской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН, г. Санкт-Петербург (свидетельство о депонировании от 13.05.96 г. № ВСКК (п) 6478).
Отобраны МАт, пригодные для дифференциации ВЭС и ВВС or ящура и для идентификации типовой принадлежности их возбудителей.
Основные положения, выносимые на защиту. Экспериментальные исследования по разработке методики получения препаратов вирусов ВБС и ВЭС для иммунизации доноров і ипериммунных сывороток и иммунных спленоцитов и скрининга клопов гибридных клеток, секретируюших МАт.
Результаты изучения биологических свойств МАт к вирусам ВБС и ВЭС в различных иммунохимических реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами возбудителей, вызывающих везикулярные заболевания.
Результаты использования препаратов МАт к вирусам ВБС и ВЭС для идентификации их типовой принадлежности и дифференциации от возбудителей других болезней с везикулярным синдромом.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были доложены на заседаниях Ученого совета ВНИИЗЖ в 1993-1997 гг., на Всероссийской научно-практической конференции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных" (ВНИИЗЖ, г. Владимир, 1995), международной научной конференции "Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы" (Харьков, 1995), Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию открытия вируса ящура (ВНИИЗЖ, г. Владимир, 1997). Полученные МАт успешно прошли межлабораторные комиссионные испытания, а также ведомственные комиссионные испытания на основании приказа по Департаменту ветеринарии в 1996-1998 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 183 страницах, иллюстрирована 33 таблицами и 7 рисунками. Список используемой литературы включает 325 источников, из которых 214 иностранных.