Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1 Механизмы иммунитета при африканской чуме свиней 12
2.2 Состояние исследований по разработке вакцин против АЧС 21
2.2.1 Инактивированные вакцины 21
2.2.2 Субъединичные вакцины 22
2.3 Живые вакцины 22
2.4 Гемадсорбция при африканской чуме свиней 31
2.5 Серотипоспецифический и гемадсорбирующий белок вируса африканской чумы свиней 40
2.6 Перспективы создания ДНК-вакцин против африканской чумы свиней 50
2.7 Заключение по обзору литературы 61
3. Собственные исследования 64
3.1 Материалы и оборудование 64
3.1.1 Вирус 64
3.1.2 Штаммы микроорганизмов и плазмидные векторы 64
3.1.3 Культуры клеток 64
3.1.4 Питательные среды, растворы для культивирования и антибиотики 64
3.1.5 Животные 65
3.1.6 Вирусоспецифические сыворотки 65
3.1.7 Коммерческие наборы 65
3.1.8 Реактивы и растворы 66
3.1.9 Лабораторное оборудование и расходные материалы 67
3.1.10 Программное обеспечение 67
3.2 Методы исследований 68
3.2.1 Выращивание перевиваемых линий клеток 68
3.2.2 Приготовление культуры лейкоцитов свиней 68
3.2.3 Определение инфекционной активности вируса АЧС 68
3.2.4 Определение серотиповой принадлежности вируса АЧС 69
3.2.5 Подбор олигонуклеотидных праймеров 69
3.2.6 Выделение нуклеиновых кислот 69
3.2.7 Постановка полимеразной цепной реакции 70
3.2.8 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 70
3.2.9 Выделение нуклеиновых кислот из агарозного геля и их очистка 71
3.2.10 Рестрикция ДНК 71
3.2.11 Лигирование 71
3.2.12 Трансформация клеток E. сoli 71
3.2.13 Выделение плазмидной ДНК 72
3.2.14 Количественная оценка ДНК 72
3.2.15 Секвенирование 72
3.2.16 Трансфекция плазмидной ДНК 72
3.2.17 Белковый электрофорез и иммуноблоттинг 73
3.2.18 Иммуноферментный анализ 73
3.2.19 Получение ФИТЦ-иммуноглобулинов 74
3.2.20 Реакция прямой иммунофлюоресценции 74
3.2.21 Метод иммуноферментных пятен (ELISpot) 75
3.2.22 Статистическая обработка полученных результатов 76
4. Результаты собственных исследований 76
4.1 Конструирование библиотеки генов, кодирующих белки CD2v, p30 и p54 вируса африканской чумы свиней 76
4.1.1 Расчет праймеров 76
4.1.2 Культивирование вируса АЧС 78
4.1.3 Оптимизация условий ПЦР 78
4.1.4 Клонирование ампликонов генов в плазмидный вектор 80
4.2 Биоинформатический анализ 85
4.3 Конструирование химерных генов, кодирующих эктодомены белков CD2v, p30 и p54 вируса АЧС штамма МК-200 99
4.4 Клонирование химерных генов в плазмидный вектор для экспрессии в эукариотических системах 103
4.5 Характеристика рекомбинантных (r) белков rCD2v, rp30 и rp54 вируса АЧС в иммуноблоттинге 106
4.6 Изучение антигенной активности продуктов трансляции генов методом прямой иммунофлуоресценции 110
4.7 Иммунизация свиней рекомбинантными плазмидами pCI-neo/ASFV/CD2v, pCI-neo/ASFV/p30 и pCI-neo/ASFV/p54 113
4.8 Конструирование рекомбинантных плазмид pUbb76A CD2v, pUbb76A p30 и pUbb76A p54 116
4.9 Определение иммуногенности и протективности рекомбинантных плазмид pUbb76A CD2v, pUbb76A p30 и pUbb76A p54 120
4.9.1 Клинические и патологоанатомические признаки 120
4.9.2 Динамика изменения инфекционного титра вируса АЧС в крови зараженных свиней 123
4.9.3 Иммунологический анализ 124
4.9.4 Накопление вируса АЧС в культурах клеток ЛС свиней 126
5. Заключение 128
5.1 Выводы 133
6. Список сокращений 135
7. Список литературы 137
8. Cписок иллюстрированного материала 164
9. Приложения 168
- Механизмы иммунитета при африканской чуме свиней
- Перспективы создания ДНК-вакцин против африканской чумы свиней
- Биоинформатический анализ
- Накопление вируса АЧС в культурах клеток ЛС свиней
Механизмы иммунитета при африканской чуме свиней
При острой, наиболее распространенной форме инфекции, 100 % домашних свиней и европейских диких кабанов погибают в течение 5-10 суток после начала проявления клинических признаков. В то же время, ряд высокопатогенных для домашних свиней штаммов вируса АЧС не является смертельными для восприимчивых гигантских лесных, кистеухих, кустарниковых свиней, бородавочников в Африке. Выделены в природе и получены в лабораторных условиях в процессе аттенуации в культурах клеток или направленного изменения генома вируса множество штаммов, которые не вызывают гибели домашних свиней и способны формировать защиту от последующего заражения гомологичными, но не гетерологичными, вирулентными штаммами [196, 224, 170, 230, 205].
Российскими учеными была экспериментально обоснована сероиммунотиповая классификация штаммов вируса АЧС, и получены живые культуральные вакцины из аттенуированных штаммов для временной защиты свиней от вируса АЧС I-V сероиммунотипов [19, 42, 97]. Все это свидетельствует о развитии у животных иммунной защиты против АЧС.
Гуморальный иммунитет.
Вирусоспецифические антитела рассматриваются как необходимый компонент защиты при АЧС. Перенос сыворотки или молозива от реконвалесцентов интактным свиньям может, в случае их последующего заражения вирулентным штаммом, может задержать проявление клинических симптомов болезни, уменьшить виремию и увеличить процент выживших особей [161, 210].
В частности, пассивный перенос конвалесцентной сыворотки защищал 85 % свиней от последующего заражения гомологичным штаммом Е75, при 100 % гибели контрольных животных, которым вводили иммуноглобулины от интактной свиньи [186]. Однако, механизмы реализации гуморального иммунного ответа уже длительное время остаются дискуссионными.
Вируснейтрализующие антитела.
Впервые о выявлении антител, нейтрализующих вирус АЧС in vitro, сообщили Parker J. и Plowright W. (1968) [184]. Проведенные различными научными группами в 80-х годах эксперименты позволили прийти к заключению, что вирус АЧС не индуцирует нейтрализующие антитела [237, 138]. Однако, с 90-х годов стало появляться все больше работ, отстаивающих гипотезу, что вируснейтрализующие антитела важны при формировании защиты от АЧС, что нашло отражение в исчерпывающем обзоре Escribano J. M. с соавт. [122].
Сообщалось, что сыворотка от конвалесцентной свиньи, которой инокулировали аттенуированный штамм E75CV1-4, нейтрализовала в культурах клеток Vero и макрофагах свиньи 86-97 % инфекционности вирулентных штаммов, не только исходного штамма E75, но и E70, Lisbon 60, Malawi Lil 20/1 и низкопассажного культурального штамма Е75, обозначенного E75CV/V3 [238]. Сыворотка, полученная на 9-й день после введения свиньям аттенуированных штаммов, нейтрализовала более 50 % вирусной инфекционности [178]. Неожиданным стал факт, что иммунные сыворотки не обладали способностью к нейтрализации в культурах клеток вариантов вируса АЧС на высоком уровне пассажей, в частности, из штаммов Lisbon 60, Haiti, Dominican Republic I, Dominican Republic II, Brazil II. Сходные результаты были получены с моноклональными антителами к р72. Авторы предположили, что адаптация вируса приводит к утрате специфических детерминант, связанных с нейтрализацией вируса. Однако, затем сообщили, что обнаруженные различия не связаны с антигенной структурой, а обусловлены изменением состава фосфолипидов мембран [220].
Исследование сывороток от конвалесцентных животных показало, что в ходе инфекции белки вируса р72, р30 и р54 являются наиболее активными по антигенности и иммуногенности. Сыворотка свиней против рекомбинантного белка экспрессирующей конструкции, включающей гены, кодирующие p72, p30 и p54, нейтрализовала 70 % инфекционности вируса АЧС. Антитела к р72 и р54 ингибировали прикрепление вирионов к клеткам, в то время как антитела к р30 - проникновение вируса внутрь клеток [90, 140, 226]. Интересно, что антисыворотка к рекомбинантному оболочечному белку прикрепления р12 не снижала инфекционность вируса АЧС в опытах in vitro [178].
Иммунизация свиней комбинацией вирусных белков р54 и р30-32 приводила к отсрочке начала проявления клинических симптомов болезни после инфицирования животных вирулентным штаммом возбудителя [78, 220, 177]. Российские исследователи не получили экспериментального подтверждения нейтрализации вируса АЧС. Титрование инкубированного с антителами от конвалесцентных животных и комплементом вируса АЧС штамма Франция-32 показало отсутствие какого-либо нейтрализующего эффекта, в том числе и по типу комплементзависимого виролиза [25]. По данным электронной микроскопии иммунный комплекс вирион+антитело беспрепятственно проникает в чувствительные клетки. По мнению Макарова В.В. [23, 25], специфика макрофагов, как клеток-мишеней, прежде всего их фагоцитирующая способность, исключает необходимость рецепторного механизма начального этапа взаимодействия вирус-клетка. Кроме того, размеры вируса АЧС делают его объектом «компетенции» фагоцитоза, опсонизация вирионов в результате образования иммунных комплексов на их поверхности неизбежно благоприятствует их проникновению и дезинтеграции за счет опсонинопосредованной активации фагоцитоза [23, 25].
Антителозависимая клеточная цитотоксичность.
Часть феноменов, особенно in vivo, которые пытались объяснить нейтрализацией вируса, получили иную трактовку, когда были продемонстрированы антителоопосредованный цитолиз зараженных вирусом АЧС моноцитов и макрофагов в реакциях комплементзависимого цитолиза и антителозависимой клеточной цитотоксичности [13, 179, 180]. АЗКЦ регистрировали уже на третьи-шестые сутки после инокуляции свиньям аттенуированного штамма ФК-32/135 в дозе 108,0 ГАЕ50 или умеренновирулентного штамма ФНГ в дозе 103,0 ТЦД50. Поскольку в эти же сроки методом радиоиммунопреципитации в сыворотках крови животных обнаруживали антитела к полипептидам с м.м. 14, 30, 38, 69, 95 кДа, то можно предположить, что именно они, или часть из них, и опосредуют КЗЦ и АЗКЦ. По данным Шубиной Н.Г. с соавт. (1993) иммунизация свиней очищенными белками р14, р25, р28, р31, р38, р73 индуцировало лизис зараженных вирусом АЧС клеток по механизмам КЦЗ и АЗКЦ [33]. Клеточно-опосредованный иммунитет.
Получены факты, указывающие на важную роль клеточно-опосредованных иммунных механизмов для выживания свиней при АЧС: были продемонстрированы изменение активности нормальных киллеров (N-киллеров) и формирование ЦТЛ [182, 181].
Перспективы создания ДНК-вакцин против африканской чумы свиней
Контроль над заболеванием осложняется отсутствием средств специфической профилактики [131, 118, 69].
В 60-х годах прошлого столетия представлялась обнадеживающей перспектива получения живых вакцин против большинства вирусов. В 1962-63 гг. в условиях развития эпизоотии АЧС на Пиренейском полуострове лабораторно аттенуированными штаммами вируса АЧС были привиты 550 тысяч свиней в Португалии и 18 тысяч свиней в Испании. Через несколько месяцев после вакцинации количество неблагополучных пунктов в обеих странах увеличилось в три-шесть раз, отмечали гибель 10-50 % привитого поголовья, проявление клинических признаков болезни в поствакцинальный и отдаленный периоды [189]. Причинами таких осложнений могли быть недостаточная изученность аттенуированных штаммов или их антигенное несоответствие циркулирующему вирулентному вирусу, поскольку сообщалось о выделении на Пиренейском полуострове более одного иммунологического типа вируса АЧС [96, 207, 236].
Однако от идеи создания средств специфической защиты не отказались, поскольку это имеет как прикладное, так и теоретическое значение. В настоящее время определенные надежды возлагаются на ДНК вакцины. В данной работе обсуждаются иммунологические механизмы реализации специфической защиты, потенциально протективные вирусоспецифические белки, подходы к конструированию ДНК-вакцин, несущих гены вируса АЧС, и результаты исследования их иммуногенных и протективных свойств.
Потенциально протективные белки. Исходя из локализации, структуры и функциональных свойств вирусиндуцированных белков в оболочке вирионов и плазматической мембране зараженных клеток, полипептидной специфичности антител в сыворотках крови свиней к вирусным белкам в ранний период после введения аттенуированных или вирулентных штаммов вируса АЧС, последствий иммунизации свиней очищенными из зараженных клеток или рекомбинантными белками, ДНК-конструкциями, потенциально протективными рассматривали р30, р54, р73 и CD2v [13, 33, 90, 140, 78, 220, 177, 226].
Структурно вирион вируса АЧС последовательно изнутри состоит из нуклеоида, кора, внутренней мембраны, капсида и внешней мембраны, приобретаемой при почковании вирусной частицы через плазматическую мембрану. Внутренняя мембрана вириона включает р12 (димер), р22, р54 и р30, внешняя - р12, р24 и CD2v [68, 204, 206]. Белки р12, р30 и р54 функционально важны в прикреплении и проникновении вируса АЧС в клетки-мишени. Некоторые исследователи полагают, что антитела к р54 блокируют связывание вирионов с клетками, тогда как антитела к р30 ингибируют их проникновение внутрь клеток [72, 220, 178]. По способности индуцировать антитела, как высоко иммуногенные, по данным радиоиммунопреципитации и иммуноблоттинга, были охарактеризованы р30, р54, р72 [90, 98, 76, 79, 104, 198].
Инструментально регистрируемые иммунологические процессы, определяющие исход инфицирования свиней вирусом АЧС, происходят с 3 по 10 день. У свиней, инокулированных высокими дозами аттенуированного штамма ФК-32/135 вируса АЧС, через 3-6 дней регистрировали АЗКЦ, а в период с 4 по 10 день – первичные ЦТЛ [54]. Методом радиоиммунопреципитации уже на 3-6 день после введения свиньям аттенуированного, слабовирулентного, вирулентного штаммов вируса АЧС в сыворотках крови можно обнаружить антитела к полипептидам с молекулярными массами 30 и 36-39 кДа, которые соответствуют р30 и негликозилированной форме р54, соответственно [13]. Несколько менее чувствительными методами иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга с использованием рекомбинантного р30 в качестве антигена удается выявлять антитела в сыворотках домашних свиней и диких кабанов, начиная с 7-8 суток после инфицирования животных различными по вирулентности штаммами вируса АЧС [105, 200, 215].
В качестве потенциальных антигенов для ЦТЛ рассматривали p30, p73, мажорный гликопротеин ГП 110-140 (или CD2v, НА) [41, 73, 144]. Индукцией ЦТЛ можно объяснить частичную защиту против вируса АЧС, достигнутую после иммунизации экспрессированными в бакуловирусе рекомбинантными белками p30 и p54 [220], или гемагглютинином sHA вируса АЧС, или серотипоспецифическим ГП 110-140 в липосомах [44, 204].
У оболочечных вирусов протективными, как правило, являются гликопротеины, определяющие их серотиповую специфичность [157]. У вируса АЧС свойством серотиповой специфичности обладает мажорный гликопротеин ГП 110-140 [49, 41, 43]. На основании сходства физико-химических характеристик этому белку соответствует белок CD2v, кодируемый геном EP402R, который, как известно, прямо вовлечен в феномен гемадсорбции при инфицировании чувствительных клеток вирусом АЧС [75]. В подтверждение этому было установлено, что генотипирование по генетическому локусу, кодирующему CD2v, совпадает с группировкой штаммов и штаммов вируса АЧС по сероиммунотипам [66].
Предположительно, этот белок может быть основным индуктором ЦТЛ. Критическая роль CD2v (ГП 110-140) в формировании протективного иммунитета при АЧС обоснована рядом экспериментов. Четырехкратная иммунизация свиней очищенным ГП 110-140 в составе липосом приводила к защите от гибели, но не от переболевания, 67 % животных, впоследствии зараженных вирулентным штаммом Франция-32 [44]. Иммунизация свиней рекомбинантным бакуловирусом, несущим ген СD2v вируса АЧС, защищала их от последующего контрольного заражения вирулентным штаммом вируса АЧС [204]. Внутримышечное введение свиньям ДНК-конструкции, включающей гены р30, р54 и внеклеточного домена CD2v, приводила к защите от гибели до 67 % свиней, зараженных вирулентным штаммом вируса АЧС впоследствии свиней [80, 112].
Таким образом, большинство исследователей рассматривают в качестве необходимых для индукции иммунологической защиты при АЧС белки р30, р54, CD2v.
ДНК-вакцины. Метод ДНК-иммунизации впервые был описан в 90-х годах прошлого века [107] и используется при разработке вакцин против рака, инфекционных и аутоиммунных заболеваний. Концептуально важно, что ДНК-вакцины потенциально безопасны для животных и вызывают не только гуморальный, но и клеточный иммунитет (рисунок 1) [164].
Существенным недостатком кандидатных ДНК-вакцин является относительно низкий уровень индукции иммунных реакций, особенно у крупных млекопитающих. Для преодоления этой проблемы испытано несколько подходов [233, 219, 167, 199].
Биоинформатический анализ
Аминокислотные последовательности белков p30, p54, и CD2v вируса АЧС штамма МК-200 анализировали с применением различных инструментов и алгоритмов.
При использовании программы TMHMM 2.0 были выявлены потенциальные трансмембранные области в последовательностях белков p54 (с 30 по 52 аминокислоту) и CD2v (с 218 по 240 аминокислоту), в то время как для белка p30 данные функциональные регионы не выявлены (рисунок 10)
Для прогнозирования сигнальных пептидов и их сайтов расщепления при анализе аминокислотных последовательностей вышеуказанных белков использовали сервер SignalP 5.0. Архитектура глубоко рекуррентных нейронных сетей SignalP версии 5.0 лучше подходит для распознавания последовательных мотивов различной длины (таких как сигнальные пептиды), чем традиционные нейронные сети с прямой связью. Условное случайное поле накладывает определенную грамматику на прогноз и устраняет необходимость в этапе постобработки, использовавшемся в более ранних версиях SignalP.
При анализе внеклеточного домена белка CD2v с помощью SignalP 5.0 в его последовательности выявлено наличие нативного сигнального пептида (MIIILIFLNCFKIVL) и сайта расщепления специфической пептидазой в позиции 16 и 17 с вероятностью 0,52 (рисунок 11). При анализе p30 и p54 с использованием сервера SignalP 5.0 сигнальные последовательности не выявлены (данные не показаны).
Гликозилирование является важной посттрансляционной модификацией, которая влияет на фолдинг белка, его локализацию, перенос, растворимость, антигенность, биологическую активность период полураспада, а также межклеточные взаимодействия.
Для определения сайтов гликозилирования аминокислотные последовательности белков CD2v, p30 и p54 были проанализированы с помощью онлайн-серверов NetNGlyc 1.0 и NetOGlyc 4.0. В результате анализа для CD2v выявлено наличие 13 потенциальных сайтов О-гликозилирования расположенных на участке 255-348 (данные не показаны), а также 17 сайтов N-гликозилирования, подавляющее большинство которых локализовано во внеклеточном домене белка от 24 до 198 а.о. (рисунок 12).
Сайты потенциального О-гликозилирования для p30 были определены в позициях 89, 93,108, 121, 127, 161 а.о. В последовательности p54 выявлены 19 сайтов О-гликозилирования, расположенных на внутриклеточном участке (данные не показаны).
При анализе аминокислотной последовательности белка p30 на наличие потенциальных сайтов N-гликозилирования был выявлен один сайт в позиции 102 а.о. с вероятностью 0,75 (данные не показаны). Не содержащий сигнальной последовательности белок p30, вероятно, не модифицируются по пути N-гликозилирования. Данное предположение согласуется с результатами зарубежных исследователей при изучении нативных белков вируса АЧС [194].
Анализ аминокислотной последовательности белка p54 показал наличие четырех потенциальных сайтов N-гликозилирования в позициях 72, 110, 148, 183 а.о. (рисунок 13).
В дальнейшем анализировали CD2v, p30 и p54 вируса АЧС на предмет прогнозирования T и B-клеточных эпитопов и SLA-мотивов в аминокислотных последовательностях белков.
При анализе аминокислотных последовательностей белков на наличие потенциальных Т-клеточных эпитопов с применением комбинированного алгоритма Artificial Neural Networks + Support Vector machine (CTLPred; www.imtech.res.in/raghava/ctlpred/algo.html) для CD2v на участке с 16 по 217 а.о. выявлено 55 перекрывающихся Т-клеточных эпитопов, для p30 на участке с 48 по 182 а.о. – 36 и p54 на участке с 54 по 199 а.о. – 32 (рисунок 17).
Ключевая роль в клеточно-опосредованном иммунитете отводится молекулам основного комплекса гистосовместимости (МНС-англ.), которые связывают пептиды для представления на клеточной поверхности. Анализ и отбор пептидных фрагментов белков CD2v, p30 и p54, эффективно связывающихся с МНС класса I, проводили с использованием комбинации трех актуальных методов прогнозирования связывания "MHC-пептид" таких как NetMHC, NetMHCpan и PickPocket. Анализ проводили с использованием SLA (лейкоцитарные антигены свиньи) аллелей для 9-, 10- и 11- мерных пептидов: SLA-1:0101, SLA-1:0201, SLA-1:0202, SLA-1:0401, SLA-1:0501, SLA-1:0601, SLA-1:0701, SLA-1:0702, SLA-1:0801, SLA-1:1101, SLA-1:1201, SLA-1:1301, SLA-2:0101, SLA-2:0102, SLA-2:0201, SLA-2:0202, SLA-2:0301, SLA-2:0302, SLA-2:0401, SLA-2:0402, SLA-2:0501, SLA-2:0502, SLA-2:0601, SLA-2:0701, SLA-2:1001, SLA-2:1002, SLA-2:1101, SLA-2:1201, SLA-3:0101, SLA-3:0301, SLA-3:0302, SLA-3:0303, SLA-3:0304, SLA-3:0401, SLA-3:0501, SLA-3:0502, SLA-3:0503, SLA-3:0601, SLA-3:0602, SLA-3:0701, SLA-6:0101, SLA-6:0102, SLA-6:0103, SLA-6:0104, SLA-6:0105, SLA-2:CDY.AA, SLA 2:HB01, SLA-2:LWH.AA, SLA-2:TPK.AA, SLA-2:YC.AA, SLA-2:YDL.AA, SLA-2:YDY.AA, SLA-2:YTH.AA, SLA-1:es11, SLA-2:es22, SLA-1 CHANGDA, SLA-1-HB01, SLA-1-HB02, SLA-1-HB03, SLA-1-HB04, SLA-1-LWH, SLA-1PK, SLA-1-YC, SLA-1-YDL01, SLA-1-YTH, SLA-2-YDL02, SLA-3-CDY, SLA-3-HB01, SLA-3-LWH, SLA-3PK, SLA-3-YC, SLA-3-YDL, SLA-3-YDY01, SLA-3-YDY02, SLA-3-YTH (таблицы 5-7).
Накопление вируса АЧС в культурах клеток ЛС свиней
Ранее было продемонстрировано, что культуры клеток лейкоцитов периферической крови свиней, которым инокулирован аттенуированный штамм вируса АЧС, допустимо рассматривать как модели in vitro, в которых реализуются протективные иммунологические реакции, происходящие в течение анализируемого периода in vivo [46].
На 42 сутки после начала иммунизации у всех свиней отбирали кровь для получения культур клеток ЛС с добавлением в среду культивирования 15 % полученных одновременно гомологичных сывороток. Культуры клеток ЛС от каждой свиньи вносили в 24-луночные планшеты по 1 см3 на лунку при посадочной концентрации 4 млн кл/см3 и культивировали в CO2-инкубаторе при температуре 37 С. Через 2 суток культуры клеток ЛС заражали вирусом АЧС штамма Мозамбик-78 в дозе 100 ГАЕ50 на лунку. На четвертый день после заражения, когда во всех лунках наблюдали плотную гемадсорбцию, культивирование одновременно останавливали и вируссодержащие суспензии замораживали при минус 70 С. Накопление вируса АЧС в каждой лунке определяли титрованием в культуре клеток ЛС от здоровой свиньи в 48-луночных планшетах. В результате установлено, что максимальное накопление вируса АЧС ( 107 ГАЕ50/см3) было в культурах клеток ЛС от свиней №№ 3 и 5, минимальное ( 107 ГАЕ50/см3) – от свиней № № 1, 2, 4 (рисунок 32).
В культурах клеток ЛС от свиней №№ 2 и 4 урожай вируса АЧС штамма Мозамбик-78 на 0,75-1,25 lg ГАЕ50/см3 меньше по сравнению с накоплением в культуре клеток ЛС контрольного животного (№ 5).
Таким образом, получены три рекомбинантные плазмиды, кодирующие гены EP402R(CD2v), CP204L(p30) и E183L(p54) вируса АЧС, слитых с геном убиквитина (Ubb76A). Трехкратная иммунизация четырех свиней смесью из трех рекомбинантных плазмид привела к индукции вирусоспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, но не вирусоспецифических антител. Формирования защиты от последующего заражения вирусом АЧС не зарегистрировано.