Полиморфизм генов иммунного ответа и развитие рассеянного склероза Башинская Виталина Валериевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 12

Рассеянный склероз как комплексное полигенное заболевание 12

1.1. Этиопатогенез РС 12

1.1.1. Этиология РС 13

1.1.2. Основные аспекты патогенеза РС 14

1.2. Исследование генетической предрасположенности к РС 18

1.2.1. Результаты полногеномного поиска ассоциаций для РС 19

1.2.2. Ассоциированные с РС локусы, реплицированные в независимых полногеномных исследованиях 27

1.3. Генетические факторы, вовлеченные в формирование клинического фенотипа РС 37

Заключение 44

ГЛАВА 2. Материалы и методы 46

2.1. Использованные в работе реактивы. 46

2.2. Объект исследования. 46

2.3. Выделение геномной ДНК из крови 47

2.4. Геномное типирование 2.4.1. Геномное типирование локуса HLA-DRB1 49

2.4.2. Анализ полиморфного участка A G в интроне 1 гена CD58 (rs2300747) 50

2.4.3. Анализ полиморфного участка С Т в экзоне 6 гена IL7RA (rs6897932) 51

2.4.4. Анализ полиморфного участка A G в 1 интроне гена IL2RA (rs2104286) 52

2.4.5. Анализ полиморфного участка C G в 1 интроне гена CD6 (rs17824933) 54

2.4.6. Анализ полиморфного участка T C в 6 интроне гена TNFRSF1A (rs1800693) 56

2.4.7. Анализ полиморфного участка G A в 22 интроне гена CLEC16A (rs6498169) 58

2.4.8. Анализ полиморфного участка G A 61.5 kb downstream гена IRF8 (rs17445836) 60

2.4.9. Анализ полиморфного участка C T в 1 интроне гена STAT3 (rs744166) 61

2.5. Статистический анализ результатов 63

ГЛАВА 3. Результаты 64

3.1. Выбор генов для репликационного анализа 64

3.2. Анализ ассоциации полиморфизма генов иммунного ответа с предрасположенностью к РС 3.2.1. Анализ индивидуального вклада аллелей гена HLA-DRB1 в развитие РС 66

3.2.2. Анализ индивидуального вклада аллелей/генотипов не-HLA генов в развитие РС 70

3.2.3. Анализ индивидуального вклада аллелей/генотипов не-HLA генов в развитие РС у женщин 74

3.2.4. Анализ индивидуального вклада аллелей/генотипов не-HLA генов в развитие РС у мужчин 78

3.2.5. Мультилокусный анализ ассоциации аллелей/генотипов исследуемых генов с предрасположенностью к РС 82

3.3. Анализ ассоциации полиморфизма генов иммунного ответа с тяжестью РС 84

3.3.1. Анализ индивидуального влияния аллелей/генотипов исследуемых локусов на

тяжесть РС 85

3.3.2. Анализ индивидуального влияния аллелей/генотипов генов-кандидатов на тяжесть РС в группах мужчин и женщин 85

3.3.3. Мультилокусный анализ ассоциации аллелей/генотипов исследуемых генов с тяжестью РС 86

3.4. Анализ ассоциации полиморфизма генов иммунного ответа с клиническими симптомами

дебюта РС 86

3.4.1. Анализ индивидуального влияния аллелей/генотипов генов-кандидатов на клинические симптомы дебюта РС 88

3.4.2. Анализ индивидуального влияния аллелей/генотипов генов-кандидатов на клинические симптомы дебюта РС у женщин 89

3.4.3. Анализ индивидуального влияния аллелей/генотипов генов-кандидатов на клинические симптомы дебюта РС у мужчин 90

3.4.4. Мультилокусный анализ ассоциации аллелей/генотипов исследуемых генов с клиническими симптомами дебюта РС 91

ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 93

Заключение 115

Выводы 117

Список литературы 119

• Исследование генетической предрасположенности к РС
• Геномное типирование 2.4.1. Геномное типирование локуса HLA-DRB1
• Мультилокусный анализ ассоциации аллелей/генотипов исследуемых генов с предрасположенностью к РС
• Мультилокусный анализ ассоциации аллелей/генотипов исследуемых генов с клиническими симптомами дебюта РС

Введение к работе

Актуальность проблемы

Достижения молекулярной биологии в последние десятилетия привели к возникновению и развитию молекулярной медицины, благодаря которой стало возможным не только установление причин возникновения и механизмов развития ряда распространенных заболеваний, но и разработка адекватных методов их диагностики, лечения и профилактики на молекулярном и клеточном уровне.

Большинство заболеваний человека относятся к комплексным, которые развиваются
вследствие воздействия генетических, эпигенетических и внешних факторов, находящихся в
сложной системе взаимодействий и зачастую не до конца исследованных. Комплексным
заболеванием является и рассеянный склероз (РС), тяжелое хроническое заболевание
центральной нервной системы, характеризующееся аутоиммунным воспалением,

нейродегенерацией и прогрессирующей неврологической дисфункцией [Sawcer et al. 2014]. В мире насчитывается более 2.5 миллионов больных РС [Browne et al. 2014], из них в России – около 200 тыс. человек [Boiko et al. 2000]. Достаточно высокая распространенность РС в мире, поражение преимущественно лиц молодого и среднего возраста, значительная гетерогенность его клинического течения, отсутствие надежных методов прогноза заболевания и его лечения выводят проблему изучения РС в ряд важнейших задач молекулярной медицины.

Генетическая предрасположенность, - один из факторов, приводящих к развитию комплексных заболеваний, - имеет, как правило, полигенную природу [Chakravarti et al. 2013]. На ее основе проявляют свое действие остальные факторы риска, к которым относят воздействие внешней среды и эпигенетическую регуляцию [Oksenberg 2013]. Наиболее статистически мощным методом анализа генетической предрасположенности к полигенным заболеваниям является полногеномный поиск ассоциаций (genome-wide association study, GWAS). К настоящему времени высокопроизводительные GWAS, включая исследования с повышенным покрытием отдельных областей генома, позволили выявить более 100 локусов генома, ассоциированных с РС [Oksenberg 2013].

При этом результаты, полученные в разных GWAS, значительно различаются, что в первую очередь может быть обусловлено этнической гетерогенностью исследуемых больных и индивидов контрольных групп. В связи с этим возникает необходимость валидации результатов GWAS в независимых популяциях, в том числе у русских, для которых, как и для большинства славянских этносов, не было проведено полногеномных исследований ассоциации с РС.

Несмотря на успехи GWAS в выявлении новых полиморфных вариантов генов, ассоциированных с РС, обнаруженные на сегодняшний день локусы объясняют лишь около 27% наследуемости РС [Lill 2014]. Частично проблему «потерянной наследуемости» при РС решает анализ совместного вклада ряда генов, причем вклад каждого из них по отдельности может быть невелик или вовсе не проявляться [Lvovs et al. 2012].

Одной из важных характеристик РС является гетерогенность его клинического течения. Даже в пределах наиболее часто встречающейся ремиттирующей формы РС у пациентов варьируют клинические признаки, включая симптомы дебюта, тяжесть течения и др. Конкордантность в семьях по ряду клинических фенотипов, вариабельность клинического течения РС в разных этнических группах, а также данные о генетической модуляции локализации очагов поражения и тяжести заболевания, полученные при исследованиях на животных моделях РС, указывают на то, что генетический полиморфизм может влиять на клиническую картину РС [Ramagopalan et al. 2008; Ben-Nun et al. 2014]. Эти результаты свидетельствуют о необходимости изучения генетической основы клинической гетерогенности РС. Проведенные на данный момент GWAS клинического течения РС не дали совпадающих результатов, что делает актуальным поиск генетических вариантов, ассоциированных с клиническими фенотипами РС, с использованием подхода "ген-кандидат". При этом особый интерес вызывает возможная роль локусов, ассоциированных с предрасположенностью к РС, в модификации его клинического течения.

Хорошо известные различия в распространенности и клиническом течении РС у мужчин и женщин, а также результаты некоторых GWAS [Baranzini et al. 2009; Sawcer et al. 2011] указывают на возможные гендерные различия в генетической архитектуре РС, поэтому представляется обоснованным поиск специфических генетических эффектов у больных РС разного пола.

Разработанность темы исследования

В настоящее время проведено 16 независимых полногеномных исследований предрасположенности к РС, включая классические GWAS и исследования с повышенным покрытием определенных областей генома, и 7 GWAS, в которых выполнялся поиск ассоциаций с клиническим фенотипом РС. Результаты полногеномных исследований предрасположенности к РС и, в еще большей степени, клинического фенотипа РС, противоречивы и на данный момент не позволяют полностью объяснить наследуемость РС и эффективно прогнозировать его течение даже в хорошо исследованных этносах. В настоящее время активно проводятся валидационные исследования результатов GWAS в независимых гомогенных популяциях [Johnson et al. 2010, ierny et al. 2015].

Для русского этноса ранее показана ассоциация носительства группы аллелей HLA-DRB1*15 с предрасположенностью к РС как при анализе неродственных выборок больных РС и контролей [Судомоина и др. 1998, Смагина и др. 2011], так и с использованием семейного анализа [Макарычева и др. 2011]; носительство этой группы аллелей оказалось также ассоциированным с развитием оптического неврита при РС [Гусева и др. 2002]. Однако роль в развитии РС других аллелей этого высокополиморфного гена остается малоизученной. Показана ассоциация с развитием РС ряда полиморфных вариантов генов TNF, MBP, MMP9, PRNP, IL12B, VDR и сочетаний аллелей/генотипов генов иммунного ответа [Фаворова и др. 2010; Макарычева и др. 2011], а также ассоциация с клиническим течением РС вариантов генов VDR, IL18, TNF, PRNP, CTLA4 [Фаворова и др. 2010; Делов и др. 2013; Коробко и др. 2012; Башинская и др. 2012]. Однако в целом генетическая архитектура РС в русском этносе остается сравнительно малоизученной. Так, практически отсутствуют валидационные исследования результатов полногеномных исследований. На данный момент валидирована ассоциация с РС полиморфных вариантов гена CD40 [Sokolova et al. 2013], в том числе и на выборках больных РС и здоровых индивидов, включенных в настоящее исследование, а также показано отсутствие ассоциации с РС полиморфизма гена KIF1B [Kudryavtseva et al. 2011]. Варианты гена CD40 ассоциированы со скоростью прогрессирования и возрастом дебюта РС [Коробко и др. 2013].

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы было провести для этнических русских анализ ассоциации с развитием РС и характером его течения аллельных вариантов генов иммунного ответа, выбранных как наиболее перспективные исходя из данных полногеномных исследований, выполненных на других популяциях.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие конкретные задачи:

1. Разработать критерии отбора генов иммунного ответа для включения в настоящее исследование, исходя из результатов полногеномных исследований, проведенных в других популяциях европеоидов.

2. Для панели выбранных нами на основании разработанных критериев не-HLA генов CD58, IL7RA, IL2RA, CD6, TNFRSF1A, CLEC16A, IRF8 и STAT3 провести у больных РС и у индивидов контрольной группы, все русские по этнической принадлежности, сравнительный анализ частот аллелей, частот носительства аллелей и генотипов их полиморфных вариантов; для гена HLA-DRB1 провести сравнение частот носительства групп аллелей, соответствующих основным серологическим специфичностям.

3. Провести аналогичный анализ отдельно для женщин и мужчин.

4) Провести поиск ассоциаций носительства сочетаний аллелей/генотипов
исследованных полиморфных участков генов (мультилокусный анализ) с развитием РС среди
всех больных РС и здоровых индивидов и в группах, стратифицированных по полу.

5. Провести поиск ассоциаций носительства аллелей/генотипов исследованных полиморфных участков генов-кандидатов и их сочетаний с тяжестью течения РС.

6. Провести поиск ассоциаций носительства аллелей/генотипов исследованных полиморфных участков генов и их сочетаний с клиническими симптомами дебюта РС.

Научная новизна работы

Для последующей валидации результатов предшествующих полногеномных

исследований на независимых этнически гомогенных популяциях впервые предложены критерии выбора наиболее перспективных локусов риска РС из более чем 100 обнаруженных в отдельных GWAS для других этносов. Эти критерии учитывают воспроизводимость результатов GWAS и уровень значимости наблюдаемых ассоциаций. Впервые проведено валидационное исследование ассоциации 9 таких локусов, в которых расположены гены иммунного ответа, с развитием и клиническим фенотипом РС в русском этносе.

Впервые для русского этноса показана ассоциация с развитием РС полиморфных вариантов генов CLEC16A и IL2RA и групп аллелей *01, *11 и *17 гена HLA-DRB1, а также ассоциация вариантов генов CD6 и TNFRSF1A с симптомами дебюта РС. Ассоциация полиморфизма гена TNFRSF1A с тяжестью течения РС показана впервые для европеоидов.

Впервые выявлен ряд биаллельных сочетаний, позитивно или негативно

ассоциированных с развитием РС или с неблагоприятными симптомами дебюта в общих группах или отдельно у женщин или мужчин. Все найденные аллельные сочетания ассоциированы с РС с бльшим уровнем значимости, чем отдельные аллели. Помимо аллелей генов, ассоциация которых была выявлена нами поодиночке, эти сочетания указывают на вовлеченность полиморфизмов генов TNFRSF1A (во всех группах) и CD6 (у женщин) в развитие РС, а также генов IL2RA (в общей группе) и STAT3 (у женщин) в формирование клинического фенотипа РС.

Впервые показана гендерная специфичность выявленных для русского этноса ассоциаций с развитием РС полиморфных вариантов генов IRF8, CD58 и IL7RA. Впервые показана гендерная специфичность ассоциаций с различными компонентами клинического фенотипа РС, в частности, специфичная для мужчин ассоциация полиморфизма гена CD6 с симптомами дебюта РС.

Теоретическая и практическая значимость

Использование предложенных критериев для отбора из числа локусов риска РС, обнаруженных ранее в полногеномных исследованиях, тех локусов, которые перспективны для

исследования в неизученном(ых) этносе(ах), позволило более продуктивно исследовать предрасположенность к РС доступным методом «ген-кандидат». Выявлены ассоциации вариантов генов с развитием РС и его клиническим течением, что способствует лучшему пониманию генетической архитектуры РС и указывает на возможные патогенетические компоненты развития аутоиммунного воспаления. Расширение понимания патогенеза РС может послужить основой для поиска новых терапевтических мишеней при лечении РС. Обнаруженные варианты генов и их сочетания, ассоциированные с клиническим фенотипом РС, могут быть использованы в будущем как комплексные прогностические маркеры течения РС у отдельных индивидов.

Методология и методы исследования

Настоящее исследование проведено методом «случай – контроль», при котором сравниваются частоты носительства аллелей/генотипов в неродственных группах больных РС и здоровых индивидов одной этнической принадлежности; это позволяет выявлять ассоциированные с заболеванием локусы с большей, чем семейный анализ, статистической мощностью. Такой метод используется и в GWAS, и в исследованиях, основанных на подходе "ген-кандидат", в том числе в валидационных исследованиях, к которым относится настоящая работа.

Материалом исследования служила геномная ДНК, выделенная из крови неродственных больных РС и индивидов контрольной группы. Протокол исследования одобрен Этическим Комитетом РНИМУ им. Н. И. Пирогова (протокол заседания №121 от 14 ноября 2012 года). Результаты получены с использованием молекулярно-генетических методов, соответствующих поставленным целям и применяемых в аналогичных исследованиях. Генотипирование по выбранным локусам проводили с помощью различных методов на основе ПЦР, включая аллелеспецифическую ПЦР, ПЦР с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и ПЦР в реальном времени. Для статистической обработки данных использовали программное обеспечение (ПО) GraphPad InStat и ПО APSampler, позволяющее выполнять поиск сочетаний аллелей/генотипов, ассоциированных с РС.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полиморфные варианты генов CLEC16A, IL2RA и HLA-DRB1 ассоциированы с
развитием РС у этнических русских.

2. Показана гендерная специфичность ассоциаций полиморфных вариантов генов IRF8 (у женщин), а CD58 и IL7RA (у мужчин) с развитием РС в русском этносе.

3. Выявлены биаллельные сочетания, ассоциированные с РС, в которые входят как гены, ассоциация аллелей/генотипов которых была выявлена нами поодиночке, так и гены TNFRSF1A

и CD6, носительство аллелей которых поодиночке не было значимо ассоциировано с РС ни в общей группе, ни в группах, стратифицированных по полу.

4. Обнаружен гендер-специфический эффект полиморфизма генов иммунного ответа на формирование клинического фенотипа РС. Носительство аллелей/генотипов генов TNFRSF1A, CD6, IL2RA и STAT3 ассоциировано с симптомами дебюта РС поодиночке или в составе сочетаний, а гена TNFRSF1A – еще и с тяжестью РС, что позволяет считать ген TNFRSF1A важным геном-модификатором клинического течения РС.

Личное участие автора в получении научных результатов

Автором выполнены молекулярно-генетические исследования и статистический анализ полученных данных. Автору принадлежит ведущая роль в анализе данных литературы по теме диссертационной работы, в обобщении полученных результатов, в написании статей по результатам диссертации. Составление коллекции геномной ДНК и генотипирование по гену HLA-DRB1 выполнялось совместно с сотрудниками кафедры молекулярной биологии и медицинской биотехнологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

Степень достоверности и апробация результатов

О достоверности результатов свидетельствует репрезентативный объем исследуемой выборки (509 больных РС и 276 здоровых индивидов). Основные выводы работы и выносимые на защиту положения являются обоснованными и полностью соответствуют полученным результатам. Достоверность выводов подтверждается адекватной статистической обработкой данных.

Материалы работы были представлены на следующих международных научных конференциях: VI Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (24 марта 2011, Москва, Россия); XIX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (9-13 апреля 2012, Москва, Россия); VIII Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (21 марта 2013, Москва, Россия); 13^th European School of Neuroimmunology (July 3-6 2013, Porto, Portugal); VI Международная школа молодых учёных по молекулярной генетике «Геномика и системная биология» (16-21 ноября 2014, Звенигород, Россия); European Biotechnology Congress (May 7-9 2015, Bucharest, Romania); Conference for Young Scientists (September 21-25 2015, Kyiv, Ukraine). Работа была апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии и медицинской биотехнологии медико-биологического факультета ФГБОУ ВО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Минздрава РФ 3 сентября 2015 года (Протокол заседания кафедры № 2).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 6 статей в журналах, входящих в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК, и 7 материалов конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Она изложена на 140 страницах, включает 15 рисунков и 29 таблиц. Список литературы содержит 294 источника.

Исследование генетической предрасположенности к РС

Рассеянный склероз (РС) – это хроническое демиелинизирующее заболевание ЦНС, характеризующееся хроническим аутоиммунным воспалением, демиелинизацией, повреждением аксонов и олигодендроцитов и, как следствие, прогрессирующей неврологической дисфункцией [216]. По данным атласа РС (Atlas of MS, [23]), РС поражено более 2.3 миллионов человек в мире [43], при этом РС страдают в основном молодые люди (средний возраст дебюта 20-40 лет), ведущие активную трудовую деятельность [2]. Это заболевание ведёт к ранней инвалидизации больных и сокращению времени жизни в среднем на 7 лет по сравнению с общей популяцией [161].

Отмечается неоднородность частоты РС в разных популяциях: выделяют зоны высокого (частота заболевания более 50 на 100 000 населения), среднего (10 – 50 на 100 000 населения) и низкого риска (не более 10 на 100 000 населения) [43]. В последние годы отмечается возрастание распространенности [43], а в некоторых регионах – и заболеваемости РС [57]. Это можно объяснить как истинным увеличением числа заболевших РС, так и совершенствованием методов диагностики, увеличением продолжительности жизни больных благодаря успешной патогенетической и симптоматической терапии [2]. Частота РС в России составляет 30 – 70 случаев на 100 000 населения, что соответствует зонам высокого и среднего риска развития заболевания [38]. Демографические исследования подтвердили, что РС встречается примерно в 2-3 раза чаще у женщин, чем у мужчин [146]. Течение РС характеризуется выраженной клинической гетерогенностью. Примерно у 85% больных наблюдается ремиттирующая форма РС (РРС), характеризующаяся сменами периодов нарастания степени неврологического дефицита – обострениями – и угасания симптомов со снижением или исчезновением неврологического дефицита – ремиссиями. В течение 10 лет от начала заболевания примерно у половины больных РРС, а через 30 лет - у 90% больных, заболевание переходит во вторично-прогрессирующую форму РС (ВПРС), которая характеризуется неуклонным нарастанием степени неврологического дефицита. У 10-15% больных развивается первично-прогресирующая форма РС (ППРС), характеризующаяся неуклонным нарастанием дефицита неврологических функций с самого начала заболевания [233].

Среди внешних факторов, связанных с повышенным риском развития РС, чаще всего отмечают различные инфекционные агенты, и, в первую очередь, вирусы, в т.ч. вирус Эпштейна-Барр, вирус простого герпеса (Varicella zoster), некоторые полиома- и ретровирусы [22; 263; 206], однако ни в одном из описанных случаев вирусная инфекция не может полностью объяснить развитие РС [45; 246].

Другими признанными факторами риска развития РС являются дефицит витамина D, интенсивность солнечного света [112], курение [105] и баланс половых гормонов [15]. Дефицит витамина D оказывает влияние на дифференцировку регуляторных Т-клеток, что может изменять иммунный ответ клеток, в частности, на аутоантигены [49]. Исследования последних лет показали, что витамин D также влияет на экспрессию генов, модифицирующих гистоны [145], а курение затрагивает статус метилирования значительного количества генов и влияет на модификацию гистонов [144]. Эти данные указывает на вовлечение эпигенетических механизмов в развитие РС.

Ранее были выявлены ассоциации между образом жизни, характером питания и РС [236]; в настоящее время активно обсуждается связь между изменениями микробиома кишечника человека и предрасположенностью к развитию аутоиммунных заболеваний, в том числе и РС [197; 250]. Выявленные изменения в составе микробиома кишечника больных РС [196] и исследования микробиома кишечника на животных моделях указывают на вовлечение антигенов и медиаторов, продуцируемых микроорганизмами, в регуляцию процессов иммунной системы [212].

В целом, развитие РС характеризуется сложным паттерном взаимодействий генетических и негенетических факторов, что в настоящее время не позволяет однозначно предсказать возникновение РС исходя из отдельно взятого признака, однако выявление даже ограниченного эффекта того или иного фактора на развитие или характер течения РС может способствовать пониманию биологической природы заболевания и открыть новые возможности для его профилактики и лечения [13].

Многочисленные исследования позволяют считать, что в развитии РС большую роль играет аутоиммунный процесс, опосредованный, в первую очередь, Т-лимфоцитами [265]. Развитие воспалительной реакции, включающей активацию клеток иммунной системы на периферии, их проникновение через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и развитие аутоиммунного воспаления в ЦНС, дополняется нейродегенерацией, которая развивается до некоторой степени независимо от аутоиммунного воспалительного процесса [117]. Все эти процессы приводят к повреждению миелиновой оболочки (демиелинизации), разрушению олигодендроцитов, аксонов, глиозу и нейродегенерации, что, в конечном счете, вызывает необратимую неврологическую дисфункцию [94]. Основные стадии патогенеза РС показаны на рис. 1.1. Необходимым условием развития аутоиммунного повреждения является активация анергичных аутореактивных Т- и В-клеток на периферии. Активация Т-клеток (в первую очередь CD4+ Т-клеток) может осуществляться чужеродными микроорганизмами (по принципу молекулярной мимикрии), микробными суперантигенами или собственными антигенами (АГ), иммуногенность которых повышена, в частности, при хроническом воспалении, а также собственными АГ, ставшими доступными для контакта с антиген представляющими клетками (АПК) вследствие разрушения клеток, нарушения проницаемости гистогенетических барьеров и пр. [274].

Геномное типирование 2.4.1. Геномное типирование локуса HLA-DRB1

Анализ функциональной роли ассоциированных с РС генов (табл. 1.2), проведенный с помощью базы данных генов человека GeneCards [119] (http://www.genecards.org/), ресурса Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) и в других источниках информации, показал, что большая их часть напрямую вовлечена в развитие иммунного ответа. Около трети генов, ассоциированных с РС, были также ассоциированы с другими аутоиммунными заболеваниями в исследовании на Иммуночипе [214].

Практически во всех полногеномных исследованиях РС выявлена высокозначимая ассоциация с РС локуса HLA, являющегося важнейшим участником развития иммунного ответа. Уровень значимости ассоциаций достигает величины p = 4 10–225 для rs3135388 [68]. Эти результаты хорошо согласуются с аутоиммунной природой заболевания. Выявлены независимые ассоциации полиморфных вариантов HLA I и II класса [68; 224; 124], однако для более подробного описания участия всего локуса HLA в развитии РС необходимы дальнейшие исследования с более плотным покрытием этого локуса.

В пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцитов большую роль играют цитокины и рецепторы цитокинов IL12, IL7R, IL2R, а также костимулирующие молекулы CD58 и CD86. Дифференцировка Т-клеток зависит от фактора транскрипции TCF7, в активации которого, в свою очередь, участвует рецептор простагландина E2 – PTGER4. Активация Т-лимфоцитов зависит от регуляторного белка, кодируемого геном TAGAP, а поддержание активации зависит от экспрессии рецептора CD6 на поверхности Т-лимфоцитов. В свою очередь, продукт гена NDFIP1 препятствует переходу воспаления, опосредованного Т-хелперами, в хроническую фазу. В поляризации Т-хелперов участвует киназа TYK2: уменьшение активности этого фермента связано со сдвигом дифференцировки Т-хелперов в сторону Th2. Продукты другой группы генов – CD40, RGS1, CXCR5 – напрямую участвуют в функционировании В-клеток. Большая группа генов кодирует белки-участники сигнального пути NF-kB и вовлечена в развитие воспалительного ответа; это гены, относящиеся к суперсемействам фактора некроза опухолей (TNFSF14, TNFAIP3) и его рецепторов (TNFRSF1A), а также гены рецепторов цитокинов (IL22RA2) и молекул адгезии (VCAM1). Белковые продукты генов STAT3, IRF8, TYK2, ZMIZ1 участвуют в сигнальных путях JAK/STAT, регулирующих экспрессию цитокинов и влияющих на развитие иммунного ответа. Данные последних лет показали, что в молекулярной машинерии презентации антигенов молекулами HLA класса II участвует ген CLEC16A [35; 254].

Среди выявленных генов есть те, которые в большей или меньшей степени экспрессируются в тканях нервной системы: EOMES, OLIG3, GALC, AHI1, RPL5, MMEL1. Транскрипционный активатор белок эомезодермин, кодируемый геном EOMES, играет важнейшую роль в ранней дифференцировке организма и головного мозга, и в то же время принимает участие в дифференцировке CD8+ T-клеток. Продукт гена GALC – фермент галактозилцерамидаза – участвует в лизосомном катаболизме галактозилцерамида, основного гликолипида миелиновой оболочки аксонов. Эти гены впервые попали в поле зрения генетиков, изучающих РС.

Функциональная роль некоторых других выявленных методом GWAS генов в предрасположенности к РС не столь очевидна; они кодируют и факторы транскрипции (например, репрессор HHEX, участвующий в дифференцировке гемопоэтических клеток), и белки семейства цитохромов (CYP24A1, CYP27B1), и несколько важнейших белков, активно задействованных в различных сигнальных путях (например, протеинкиназа MAPK1), и многие ферменты (например, метилтрансфераза METTL1, участвующая в метилировании тРНК). Заслуживает отдельного внимания тот факт, что ряд генов, кодирующих микроРНК MIR1204, MIR1205, MIR1208 и MIR3686 и длинную некодирующую РНК PVT1, картированы в ассоциированном с РС локусе 8q24.21 (см. табл. 1.2). Эти данные скорее всего свидетельствуют о важной роли эпигенетической регуляции в патогенезе РС.

В целом результаты GWAS, как классических, так и основанных на гипотезе об ассоциации определенных локусов с РС (hypothesis-driven studies), подтверждают полигенную природу РС и соответствуют современному представлению о РС как об аутоиммунном заболевании, поражающем ЦНС, однако воспроизводимость результатов различных исследований невелика.

В первую очередь это может быть обусловлено этнической гетерогенностью исследуемых больных и индивидов контрольных групп. При этом вектор исследований GWAS направлен на увеличение размера выборок с целью повышения статистической значимости, а это, как правило, достигается путем включения в исследование людей разной этнической принадлежности. Исходя из этого, стало общепризнанным, что требуется репликация результатов GWAS в различных гомогенных по этническому составу, что позволит выявить как общие генетические детерминанты, определяющие основные молекулярные механизмы патогенеза РС, так и этноспецифический вклад в генетическую компоненту этого заболевания. В связи с этим, для различных полигенных заболеваний в мире активно развивается направление исследований, направленное на валидацию результатов GWAS в отдельных этносах, в первую очередь, с помощью подхода «ген-кандидат». Для РС такие исследования были проведены для ряда этносов, в том числе для некоторых славян, индийцев, испанцев, афроамериканцев [266; 221; 279; 130]. Как уже указывалось, разнообразие клинических форм РС может быть связано с генетическими различиями между больными [33; 233]. Тот факт, что в выборки для отдельных исследований GWAS попадают больные разными формами РС, может быть дополнительной причиной недостаточной воспроизводимости результатов.

Дополнительной проблемой, возникающей при анализе генетической архитектуры РС, является проблема «потерянной наследуемости», поскольку последние результаты исследований сибсов [241] дают основание предполагать, что известные на сегодняшний день локусы риска объясняют лишь около 27% от общей наследуемости; при этом HLA-DRB1 15:01 (основной аллель риска РС) в одиночку объясняет около 20% наследуемости [165]. Частично проблему «потерянной наследуемости» решает анализ совместного вклада множества аллелей и генотипов риска в развитие РС, между которыми могут возникать взаимодействия по модели аддитивности или эпистаза [177; 62]. Биоинформатический анализ, используемый в GWAS в настоящее время, не позволяет проводить поиск факторов риска, формирующихся в результате нелинейных (эпистатических) взаимодействий между аллелями в индивидуальном наборе аллелей [177], а также взаимодействиями генотипа с негенетическими факторами. Недавно были предложены новые подходы к анализу данных GWAS, направленные на выявление аддитивных эффектов множества локусов, каждый из которых может внести небольшой вклад в фенотип [122; 126]. Также развиваются методы, основанные на анализе номинально значимых ассоциаций и исследовании генов в контексте биологических сетей [188], что также позволяет использовать номинальную (sub-genome-wide) статистическую значимость ассоциаций индивидуальных локусов, а возрастающая при этом статистическая мощность исследования позволяет определять новые ассоциации (зачастую ассоциации с изучаемым признаком целых молекулярных путей) и функциональные связи между генами [286].

Мультилокусный анализ ассоциации аллелей/генотипов исследуемых генов с предрасположенностью к РС

Для выбора наиболее перспективных генов-кандидатов для репликационного анализа на русской популяции результатов GWAS, проведенных на популяциях других европеоидов, разработаны критерии, по которым отбирали наиболее значимые локусы, а именно: ассоциация локуса с РС должна была найдена хотя бы в двух независимых исследованиях; при этом хотя бы в одном из них должен быть достигнут порог полногеномного уровня значимости результатов р = 5 10-8; в другом/других исследовании/ях уровень значимости ассоциации должен быть не менее 110-5. В целом, к маю 2015 года, выявлен 41 локус и 53 картированных на них гена, ассоциированных с РС у европейцев, которые соответствуют нашим критериям.

При выборе локусов, ассоциацию которых необходимо в первую очередь реплицировать в русской популяции, мы исходили из представления о РС как об аутоиммунном заболевании и учитывали возможную роль выявленных в GWAS генов в развитии иммунного ответа. Также мы опирались на результаты исследований подходом «ген-кандидат» клинического фенотипа РС: предпочтение отдавалось генам, для которых хотя бы в двух исследованиях были найдены ассоциации с теми или иными клиническими характеристиками РС.

В результате проведенного анализа данных литературы для репликационного анализа ассоциации с РС в русской популяции были выбраны девять генов иммунного ответа, соответствующие предложенным нами критериям. В панель вошли гены, кодирующие рецепторы цитокинов IL7RA (rs6897932), IL2RA (rs2104286), TNFRSF1A (rs1800693); молекулы клеточной адгезии CD6 (rs17824933), CD58 (rs2300747); транскрипционные факторы, входящие в сигнальные пути интерферона STAT3 (rs744166), IRF8 (rs17445836), и лектин С-типа CLEC16A (rs6498169), а также ген HLA-DRB1, кодирующий бета-цепь молекулы HLA класса II.

Ранее в русской популяции анализ ассоциации выбранных полиморфизмов не-HLA генов с предрасположенностью к РС и его клиническим течением не проводился. Более подробная характеристика выбранных нами не-HLA генов, включающая сведения о GWAS, в которых они были выявлены, информацию о выбранных нами полиморфизмах (их локализации и возможных функциях), а также уровень значимости выявленных ассоциаций; представлена в таблице 3.1.

Выбор конкретных SNP в отобранных генах-кандидатах мы ограничили теми полиморфными участками, ассоциация которых с РС была найдена в полногеномных исследованиях, при этом частота минорного аллеля (MAF) для них должна быть не менее 5%. Для генов CD58, IL7RA, IL2RA, TNFRSF1A и STAT3 выбранные SNP соответствуют всем выдвинутым нами критериям, и в таблице указаны только они. В генах CD6, CLEC16A и IRF8 в разных полногеномных исследованиях были тестированы разные SNP; все они приведены в таблице, включая выбранные в наше исследование. Результаты GWAS, касающиеся гена HLA-DRB1 представлены в таблицах 1.1 и 1.2.

Ген; Локус SNP ID Значение p Ссылка ID, нуклеотид-ная замена, локализация в гене Аллель риска Эффект замены CD58 ІрІЗ rs2300747 З.ІХІ0-10 б.ОхЮ-9 [68] [224] rs2300747; A G, интрон 1 A Носительство генотипа АА ассоциировано с пониженной экспрессией мРНК в мононуклеарных клетках крови больных РС [67]. IL7RA 5р13 rs6897932 2.9xl(T7 1.7ХІ0-6 1.7ХІ0"8 [123][68][124] rs6897932; ОТ, экзон 6 С Носительство аллеля C ассоциировано с повышенной продукцией растворимого IL7R [99]. IL2RA 10р15-р14 rs2104286 2.2ХІ0-7 7.4ХІ0"6 9.3ХІ0-8 7.6ХІ0"23 [123] [25] [68] [121] rs2104286; A G, интрон 1 A Носительство аллеля A ассоциировано с повышенным уровнем растворимого IL2RA в сыворотке [178]. CD6 llql3 rsl7824933rs650258rs34383631 З.8ХІО-9 1.7ХІ0"9 3.7ХІ0-23 [68][124][121] rsl7824933; OG, интрон 1 G Носительство аллеля G ассоциировано со сниженной пролиферативной активностью CD4+ клеток после неспецифической стимуляции [148] TNFRSF1A 12р13 rsl800693 1.6x10-" 1.8ХІ0"10 6.9ХІ0"16 [68][124][121] rsl800693; T C, интрон 6 С Носительство аллеля C коррелирует с повышенным уровнем растворимого sTNFR1 [98]. CLEC16A ІбрІЗ rs6498169 rsll865121 rs7200786 rsl2927355 4.0x10 2.0ХІ0-7 б.ЗхЮ-14 6.4ХІ0-46 [123] [68] [124] [121] rs6498169; G A, интрон22 G Носительство аллеля G коррелирует с повышенным уровнем экспрессии DEX1 и SOCS1 в тимусе [159]. IRF8 16q24 rsl7445836 rsl3333054 rs35929052 3.710-9 l.010"8 5.910-12 [68][124][121] rs17445836; G A, 61.5 kb downstream G Экспрессия ряда генов интерферонового пути повышена у больных РС-носителей аллеля G [68]. STAT3 17q21 rs744166 2.810"10 6.410– [129] [224] rs744166; C T, интрон 1 С Носительство аллеля C ассоциировано с предрасположенность ю к ряду других Th1/Th17-опосредованных заболеваний [52; 285].

Мультилокусный анализ ассоциации аллелей/генотипов исследуемых генов с клиническими симптомами дебюта РС

Выявленная в данном исследовании ассоциация TNFRSF1A rs1800693 с тяжестью РС находится в соответствии с результатами исследования, проведенного на афроамериканцах [130]. В двух других исследованиях, проведенных на больших выборках испанцев и бельгийцев [58; 90], выявлена ассоциация с тяжестью РС носительства мутантного аллеля в SNP rs4149584, ассоциированного с увеличением количества растворимой формы рецептора [267]. Носительство выявленного в GWAS аллеля риска TNFRSF1A rs1800693 С, ассоциированного в нашем исследовании с более тяжелым течением РС, ведет к образованию особой растворимой изоформы рецептора, 6NFR1, способной оставаться внутри клетки или секретироваться [98; 219]. Несмотря на отсутствие сильного неравновесия по сцеплению между этими двумя SNP у европеоидов [68], можно предположить, что полиморфные варианты гена TNFRSF1A, влияющие на функционирование рецептора путем увеличения количества его растворимых изоформ [267; 98], ведут к формированию более тяжелого фенотипа РС, имитируя описанный в литературе эффект ингибиторов TNF, применение которых часто ведет к серьезным побочным эффектам при РС [262].

Растворимые формы рецепторов цитокинов, в том числе TNFR1, могут действовать как ингибиторы цитокинов, в данном случае связывая часть секретируемого TNF [98]. Полиморфные варианты гена TNFRSF1A, ведущие к образованию большего количества растворимых форм, могут вести к снижению степени иммуносупрессии аутореактивных Т-лимфоцитов вследствие менее интенсивной активации апоптозного пути через TNFR1 [48]. Кроме того в ряде исследований было показано, что в условиях воспаления эффекторные Т-клетки, экспрессирующие TNF, способствуют пролиферации регуляторных Т-клеток, главным образом через TNFR2-опосредованный сигналинг [100; 26; 95]. Связывание TNF растворимыми изоформами рецептора и уменьшение количества свободного цитокина, ведущего и к уменьшению TNFR2-опосредованного сигналинга, может привести к менее интенсивной индукции пролиферации Treg и, как следствие, к более интенсивному воспалению, в том числе аутоиммунному воспалению в ЦНС при РС.

В целом, результаты, полученные при оценке вклада генов в формирование клинических фенотипов РС, позволяют считать ген TNFRSF1A важным геном-модификатором клинического течения РС.

В нашем исследовании не найдено значимых ассоциаций аллелей гена HLA-DRB1 с клиническим фенотипом РС. Это отличается от результатов некоторых исследований «ген-кандидат», где были показаны ассоциации полиморфных вариантов этого гена с некоторыми характеристиками клинического течения РС, в том числе с тяжестью течения, с объемом и распределением очагов поражения, выявленных с помощью МРТ [233; 164; 261]. Тем не менее, это согласуется с результатами полногеномных исследований, в которых была показана ассоциация HLA-DRB1 15:01 только с ранним возрастом дебюта [124], характеристикой, не исследованной в данной работе. Можно сделать предварительный вывод, что в русском этносе HLA-DRB1 является локусом риска РС, но не является модификатором его клинического течения, за исключением (возможно) возраста дебюта.

На данный момент результаты исследований клинической гетерогенности РС слишком малочисленны, чтобы можно было делать выводы о согласованности ассоциаций того или иного SNP с клиническим фенотипом РС в разных популяциях, однако немногочисленные примеры согласующихся результатов (как видно на примере генов CD6 и TNFRSF1A) позволяют предполагать существование общих молекулярных механизмов, участвующих в модификации клинического течения РС.

На основании аннотации Gene Ontology (GO) с использованием базы данных AmiGO (http://amigo.geneontology.org/amigo/landing) мы провели анализ молекулярно-биологических процессов с участием генов, ассоциация полиморфных вариантов которых с развитием и клиническим течением РС выявлена в нашей работе. Биологические функции, которыми значимо обогащен исследуемый набор генов, включают в себя регуляцию активации Т-клеток, воспаление, ответ на действие цитокинов, лейкоцитарную адгезию и иммунный ответ. Полученные результаты анализа GO функций указывают на важнейшую роль активации и дифференцировки Т-клеток в патогенезе РС. При детальном анализе функций исследованных генов оказалось, что они все в той или иной степени вовлечены в эти процессы.

На рис. 4.1. представлена схема активации и дифференцировки CD4+ Т-лимфоцитов, на которой показаны этапы преимущественной экспрессии и наиболее активного функционирования генов HLA-DRB1, CLEC16A, CD6, CD58, IL7RA, IL2RA, IRF8, STAT3 и TNFRSF1A.

Продукты генов CLEC16A и HLA-DRB1 играют важнейшую роль в процессировании антигенов АПК, в формированиии репертуара распознаваемых антигенов и в презентации антигенов Т-клеткам, что в конечном счете определяет репертуар Т-клеточных рецепторов [61; 254; 277]. Для активации наивных CD4+ Тh0-лимфоцитов, помимо взаимодействия Т-клеточного рецептора с антигеном в контексте молекулы HLA класса II, необходимо взаимодействие ряда корецепторов, экспрессируемых на АПК и Т-лимфоцитах [74]. Кроме основных костимулирующих молекул CD28-СD80/86, к их числу относятся экспрессируемые на АПК CD2 и CD6, взаимодействующие с Т-клеточными CD58 и CD166 (ALCAM), соответственно [257; 242]. В развитии и функционировании лимфоцитов важную роль играет активация рецепторов ряда цитокинов: так, активация и пролиферация Т-лимфоцитов зависит от взаимодействия IL-2 со своим рецептором IL2R [91], а функционирование рецептора IL7R необходимо для выживания и пролиферации всех субпопуляций лимфоцитов [87].

Дифференцировка CD4+ Тh0-лимфоцитов в различные субпопуляции происходит под действием определенных цитокинов, взаимодействие которых со своими рецепторами запускает сигнальный каскад, приводящий в конечном счете к активации специфических транскрипционных факторов и изменению профиля экспрессии многих генов. Это, в свою очередь, ведет к секреции определенных цитокинов, характеризующих субпопуляции Т-лимфоцитов. Так, для дифференцировки Тh0-хелперов в субпопуляции Th17 и Th1, активных участников аутоиммунного воспаления при РС, необходимо воздействие цитокинов IL-6/TGF и IL-12/IFN, соответсвенно [162]. Дифференцировка в субпопуляции Treg и Th2, которые регулируют воспалительный процесс, происходит под действием цитокинов TGF и IL-10/IL-4, соответственно [151]. Субпопуляция фолликулярных хелперных Т-клеток (TFH), мигрирующих в герминальные центры и влияющих на развитие В-лимфоцитов, дифференцируется под действием цитокина IL-6. [284]. Продукты некоторых генов, ассоциация которых с развитием и клиническим течением РС найдена в данной работе, также принимают активное участие в направлении дифференцировки наивных CD4+ клеток: так, IRF8 и CD6 необходимы для дифференцировки в Th1 или Th17 [115; 291; 203; 191], STAT3 – в Th17 или TFH [152; 162], IL2R – в Treg [205].

Рецептор TNFR1, кодируемый геном TNFRSF1A, экспрессируется конститутивно на многих типах клеток, в том числе на различных субпопуляциях хелперных Т-лимфоцитов, направляя клетки на развитие воспалительной реакции или на путь апоптоза [48]. На ряде субпопуляций лимфоцитов, особенно на Treg, TNFR1 коэкспрессируется с другим рецептором TNFR2; сигнальные пути, задействованные при активации этих рецепторов, частично пересекаются. Взаимодействие TNF с системой из этих рецепторов регулирует жизнеспособность и пролиферацию Treg [100; 26; 95], влияя тем самым на баланс провоспалительных и регуляторных субпопуляций Т-клеток при развитии иммунных реакций в организме.