Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Ранние стадии флавивирусной инфекции, особенно взаимодействие вирусных частиц с чувствительной клеткой изучены недостаточно полно. Посвященные изучению этого вопроса работы фрагментарны и отрывочны. Они не позволяют полно описать процесс проникновения флавивирусов в клетку, представить во всех деталях механизм проникновения вирионов через мембрану клетки и определить молекулы вируса и клетки, а также ігх основные домены, участвующие в этом процессе. Первые фазы взаимодействия вируса и клетки являтатся важнейшими в определении тропизма вирусов, их вирулентности и патогенности. Знание механизмов рецепторного взаимодействия вируса и клетки дает принципиально нозые возможности в создании новых антивирусных препаратов и разработке новых способов профилактики и лечения вирусных инфекций.
К сожалению, можно констатировать, что процесс рецепторного взаимодействия вируса клещевого энцефалита (КЭ) с клеткой во многом остается непонятным. Широкий тканевой тропизм флавивирусов, в том числе и вируса КЭ, а именно, способность реплицироваться в клетках различного видового происхождения, инфицировать насекомых, птиц и различных млекопитающих позволяет предположить, что взаимодействие вируса КЭ с клеткой значительно сложнее, чем представлялось ранее. Вполне возможно, что он способен использовать несколько различных клеточных молекул в качестве рецепторных и обладает способностью проникать в чувствительную клетку различными способами.
Цель настоящей работы заключалась в поиске и выделении клеточного рецептора для вируса КЭ при помощи антиидиотилических антител При этом решались следующие задачи:
формирование коллекции гибридом, секретируюших моноклональные антитела (МКА) против нативного гликопротеипа Е вируса КЭ
исследование антигенной структуры гликопротеина Е при помощи полученных МКА. Картирование эпитопов белка Е, предположительно участвующих в рецепторном взаимодействии с клеткой.
получение поликлональных и моноклональных АИА к рецепторным сайгам белка Е.
изучение основных свойств этих АИА и их способности моделировать рецепторныс эпигопы глігкопротеина Е вируса КЭ.
использование антирецепторных антител для выделения и идентификации клеточного рецептора для вируса КЭ методами аффинной хроматографии.
Создана коллекция гибридом, секретируюших МКА к вирусу клещевого энцефалита, штамм 205, состоящая из 14 мышиных клеточных линий. Коллекция депонирована в банке гибридом ГНЦ ВБ "Вектор". Полученные моноклональные антитела используются для проведения научно-исследовательских работ, связанных с конструированием рекомбинантных
антител против вируса КЭ и изучением экспрессии белка Е флавнвирусов в различных системах экспрессии. МКЛ используются для картирования на третичной структуре белка Е эпитопов связывания антител методами фагового дисплея. Препараты МКА использованы для конструирования диагностических тест систем для выявления антигена и антител к клещевому энцефалиту.
С помощью панели моноклональпых антител к гликопротеину Е вируса КЭ, штамм 205, изучена антигенная структура данного белка. Предложена карта антигенной структуры гликопротеина Е, включающая в себя 8 сайтов, объединяющих 12 эпитопов связывания МКЛ. Эпитопы сайтов е4, е7 и eS вовлечены в реакцию торможения гемагглготинации, а один эшггоп сайта с7 связан с нейтрализацией вируса КЭ, штамм 205.
Создана коллекция из 3 крысиных клеточных линий, секретируюшнх антиидиотипические МКА, моделирующих рецепторные эпитрпы белка Е вьруса КЭ, штамм 205. Коллекция депонирована в банке гибридом ГНЦ ВБ "Вектор". Получены поликлональные кроличьи АИА, взаимодействующие с активным центром антивирусных МКА ЕбВ и 10Н10 и моделирующих эпитопы белка Е вируса клещевого энцефалита.
Поликлональные АИА использованы для выделения клеточного рецептора вируса КЭ при помощи метода аффинной хроматографии на антиидиотипических антителах. Получены высокоочшценные препараты рецептора, анализ которых показал, что очищенные фракции содержат полипептиды с молекулярной массой 43, 67, 110 и 210 кДа.
Спот-аналнзом и ИФА при помощи панели антител к некоторым видам интегрина человека проведена иммунохимическая идентификация выделенных белковых молекул рецептора. Показано, что очищенные
препараты клеточного рецептора содержат в своем составе аЗрі шітегрин человека.
Полипептид с молекулярной массой 61 кДа предварительно идентифицирован, как ламининовый рецептор.
Впервые сформулирована гипотеза, что ламининовый рецептор и аЗрі интегрин человека могут являться клеточными молекулами, участвующими в рецепторном взаимодействии с вирионами вируса КЭ.
Подтверждено наличие специфического взаимодействия нативного белка Е в составе вириона КЭ с рекомбинантным ламининовый рецептором человека.
1 Создание коллекции гибридом, секретирующих моноклональные
антитела к вирусу клещевого энцефалита, штамм 205. Построение карты
антигенной структуры гликопротеина Е, включающей в себя 8 сайтов,
объединяющих 12 эпитопов связывания МКА.
-
Создание коллекции гибридом, секретирующих моноклональные АИА, которые моделируют эпитопы белка Е вируса КЭ, штамм 205.
-
Получение поликлональных кроличьих АИА. Установление факта, что препараты псликлональных АИА эффективно моделируют эпитопы белка Е вируса клещевого энцефалита. Они способны вызывать появление антивирусных антител при иммунизации животных, взаимодействовать с клетками СПЭВ и RH и ігх мембранными фракциями, а также вызывать гемагглютинацию гусиных эритроцитов.
-
Применение метода аффинной хроматографии на антиидиотипических
антителах для проведения выделения клеточного рецептора вируса клещевого энцефалита. Получение высокоочищенных препаратов рецептора, которые содержат полипептиды 43, 67, 110 и 210 кДа. Взаимодействие АИА с полипептидом 67 кДа в иммуноблотпшге.
-
Установление факта, что выявленный полипептид с молекулярной массой 67 кДа является ламининовым рецептором человека, и что белок Е в составе вириона КЭ эффективно взаимодействует с рекомбинантным ламининовым рецептором.
-
Предположение, что очищенный препарат клеточного рецептора содержит в своем составе альфаЗ(210кДа) бета1(110кДа)-интегрин человека, который может являться рецепторной молекулой на поверхности клеток RH для вируса КЭ.
ЛПР01ЇАЦІІЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях, симпозиумах: Вторая всесоюзная конференция "Геном человека - 91" ВИНИТИ, Москва, 1991 ; Вторая всесоюзная планово-отчетная конференция "Генная и клеточная инженерия", Москва, 1992; Межведомственная конференция. Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций, Кольцово , 1993; Третья всероссийская планово-отчетная конференция по направлению "Генная и клеточная инженерия", Москва, 1993; Vllth International conference of comparative and applied virology, Montreal, Quebec, Canada, 1994; Научная конференция. Актуальные вопросы современной медицин., Новосибирск, 1995; Xth International Congress of Virology, Jerusalem, Israel, 1996; International Scientific Conference "Tick-Borne Viral, Rickettsial and bacterial infections" Irkutsk, Russia, 1996; Научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 1998
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.
СТРУКТУРА РАБОТЫ. Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждений, выводов и примечаний. Работа изложена на 120 страницах, включая 98 страниц текста, 18 рисунков, 12 таблиц и списка литературы (205 ссылок)