Введение к работе
Актуальность проблемы. В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) является самым распространенным лимфопролиферативным заболеванием европейского населения, на его долю приходится 30% всех злокачественных заболеваний крови. Частота встречаемости В-ХЛЛ составляет 2.3/100.000 населения [Li, F.P. et al, 1991]. О генах, вовлеченных в развитие В-ХЛЛ, к началу дданной работы было известно немного. Хромосомный маркер D13S25, расположенный в прителомерной трети длинного плеча хромосомы 13 (полоса 13ql4.3), подвержен делециям у 18 - 60 % пациентов У некоторых пациентов наблюдали делеции гена RB1 (полоса 13ql4.2), не затрагивающие локус D13S25, что указывает на присутствие гена-супрессора, специфического для В-ХЛЛ и расположенного в области между RB1 и D13S25 [Brown, A.G. et al., 1993]. С помощью метода LOH (потери гетерозиготності! микросателлитных маркеров) размер области пересечения делеций был определен в 280 т. п. н. [Devilder, М.С. et al., 1995]. Наибольшая частота делеций при В-ХЛЛ падает на хромосомный маркер D13S319 [Liu, Y. et al., 1995; Corcoran, MM. et al., 1998].
Построение физической карты, представленной в виде набора перекрывающихся последовательностей рекомбинантных ДНК, известным образом расположенных вдоль хромосомы человека, является необходимым этапом поиска гена - супрессора опухолевого роста, расположенного в исследуемом участке хромосомы и предваряет построение транскрипционной карты участка. Поэтому к началу данного исследования построение такой карты было наиболее актуальным.
До настоящей работы не существовало также ни транскрипционной карты исследуемого района хромосомы 13, ни информации об экзон-интронной структуре генов, ни информации об открытых рамках трансляции, что необходимо для выявления кандидатных генов-супрессоров. Постановка и решение таких ззадач становилась возможной и поэтому актуальной в ходе данного исследования.
Цели и задачи исследования. Целями работы являлось создание физической карты района 13ql4.3 хромосомы 13, расположенного между молекулярно-генетическими маркерами D13S1168 и D13S25, определение границ минимального участка хромосомы, утрачиваемого у пациентов с В-ХЛЛ, а также поиск и клонирование генов человека, расположенных в исследуемом районе.
Для этого были поставлены следующие задачи:
Приписать STS и EST-маркеры известной локализации и расположенные в исследуемом районе к рекомбинантным космидам. Создать контиги на основе рекомбинантных космид, соединяющих эти STS и EST-маркеры.
Используя космиды, включенные нами в контиг, построить EcoRI- и Hindlll-рестрикционную карту, перекрывающую определенный к началу данного этапа работы минимальный участок (менее 130 т.п.н.), утрачиваемый у пациентов с В-ХЛЛ.
Используя рестрикционные фрагменты установленной локализации в качестве радиоактивно меченных проб уточнить границы минимального участка, утрачиваемого у пациентов с В-ХЛЛ, с помощью гибридизации по Саузерну этих проб с геномной ДНК пациентов.
Используя космиды, перекрывающие охарактеризованную нами поврежденную область хромосомы, выявить кДНК, соответствующие этой области.
Проанализировать нуклеотидную последовательность минимального участка хромосомы, утрачиваемого у больных В-ХЛЛ с помощью существующих компьютерных программ, распознающих экспрессирующиеся последовательности генома человека.
Определить экзон-интронную структуру обнаруженных генов человека, картировать экзоны относительно границ минимального утрачиваемого участка, выявить открытые рамки считывания, провести поиск схожих нуклеотидных и
аминокислотных последовательностей среди экспрессирующихся последовательностей, хранящихся в общедоступных базах данных.
Оценить возможные гены с точки зрения их пригодности для дальнейшего анализа в качестве кандидатов на роль супрессора опухолевого роста, повреждаемого или утрачиваемого при В-клеточном хроническом лимфолейкозе.
Научная новизна и практическая значимость работы. Построен непрерывный космидный контиг, перекрывающий участок хромосомы 13, ограниченный STS-маркерами D12S1168 и D13S25. К космидам, составляющим контиг, приписаны 12 EST и STS-маркеров. "Минимальный путь" перекрывания исследуемой области хромосомы 13 составляют 19 космидных клонов. Общая длина космидного контига составляет приблизительно 620 т.п.н. Для трех космид (с32а, сЗОа, 71а11) определен порядок следования сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и Hindlll и расстояние между этими сайтами. Определены границы и размер минимального участка, утрачиваемого у пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом: размер участка составляет менее 10 т.п.н., центромерная граница проходит по фрагменту рЗО.З., а теломерная - в области, расположенной на 6 т.п.н. центромернее фрагмента р30.5. Гомозиготные потери ДНК минимального участка обнаружены у 14% исследованных случаев В-ХЛЛ (в 28 образцах из 206), а гемизиготные - в 36% случаев ( в 67 образцах из 206). Обнаружено 9 новых экспрессирующихся последовательностей человека, расположенных в районе ql4 хромосомы 13 человека. Проведено тонкое физическое картирование и определена экзон-интронная структура двух новых генов человека Leul и Leu2, являющихся возможными кандидатами на роль супрессоров опухолевого роста, повреждаемых или утрачиваемых при В-клеточном хроническом лимфолейкозе. Клонирован новый ген человека Leu5, кодирующий белок, содержащий цинк-связывающие домены RING и В-Ьох, а также так называемый «спирально скрученный» домен, что определяет принадлежность этого белка к семейству Rip, представители которого участвуют в процессах образования злокачественных опухолей, эмбриональной закладки органов и регуляции функционирования клеток иммунной системы.
Практическая ценность работы заключается в создании основы для дальнейшего мутационного скрининга клонированных в работе генов с целью выявления супрессора, ответственного за развитие В-клеточного хронического лимфолейкоза. Охарактеризованные в данной работе ДНК-пробы пригодны для ДНК-диагностики В-клеточного хронического лимфолейкоза.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в виде тезисов на 4 международных конференциях и двух отчетных конференциях Российской Программы «Геном Человека» (см. список собственных публикаций). По результатам работы опубликованы статьи в международных журналах "Oncogene" и 'TEBS Letters", статья в российском журнале "Молекулярная биология». Для раздела «Обзор литературы» был переработан и значительно расширен материал, представленный в обзорной статье, опубликованной в журнале «Молекулярная биология». Диссертация апробирована на заседании межлабораторного семинара «Молекулярные и клеточные основы генетических процессов» в Институте Общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН 4 июня 1998 года.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 200 страницах машинописного текста и состоит из 5 глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение и выводы. Список литературы, приведенный в конце диссертации, включает 308 источников. Работа содержит 19 рисунков и 4 таблицы.