Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 9
1.1 Классификация аденовирусов 9
1.2 Структурные особенности аденовирусов 11
1.3 Организация генома аденовирусов 15
1.4 Жизненный цикл аденовирусов
1.4.1 Взаимодействие аденовируса с рецепторами клеточной поверхности 23
1.4.2 Проникновение аденовирусов в клетку 25
1.4.3 Транспорт генома аденовируса в ядро клетки-хозяина 26
1.4.4 Особенности репликации генома аденовируса 26
1.4.5 Сборка вирусных частиц и выход вируса из клетки
1.5 Заболевания, вызываемые аденовирусами человека 30
1.6 Противоаденовирусные препараты 31
1.7 РНК-интерференция
1.7.1 История открытия РНК-интерференции 34
1.7.2 Механизм РНК-интерференции
1.8 Проблемы применения и доставки малых интерферирующих РНК 39
1.9 Химические модификации РНК 41
1.10 Доставка малых интерферирующих РНК в клетки-мишени
1.10.1 Липидные системы доставки 45
1.10.2 Лентивирусные векторы 49
2 Материалы и методы 51
2.1 Материалы 51
2.1.1 Линии клеток 51
2.1.2 Плазмиды 51
2.1.3 Вирусы 52
2.1.4 Реактивы 52
2.1.5 Растворы 55
2.1.6 Пластиковая посуда, другие материалы 58
2.1.7 Оборудование 58
2.2 Методы 59
2.2.1 Культивирование клеток 59
2.2.2 Пассирование перевиваемых культур клеток млекопитающих з
2.2.4 Трансформация компетентных бактериальных клеток E.coli DH5-a 61
2.2.5 Малые интерферирующие siРНК 61
2.2.6 Гибридизация химически синтезированных олигорибонуклеотидов 64
2.2.7 Трансфекция siРНК-дуплексов 64
2.2.8 Малые шпилечные shРНК 65
2.2.9 Получение псевдолентивирусных частиц 65
2.2.10 Определение титра псевдолентивирусных частиц 66
2.2.11 Трансдукция клеток псевдолентивирусными частицами 66
2.2.12 Селекция клеток, трансдуцированных псевдолентивирусными частицами 67
2.2.13 Получение модельных сублиний методом предельных разведений 67
2.2.14 Выделение суммарной РНК из клеток перевиваемых культур 68
2.2.15 Переосаждение суммарной РНК 69
2.2.16 Обратная транскрипция - построение цепей кДНК 70
2.2.17 Полимеразная цепная реакция в реальном времени 70
2.2.18 Определение количества копий генома аденовируса человека методом количественной ПЦР 71
2.2.19 Проточная цитофлуориметрия 72
2.2.20 Вестерн-блот 73
2.2.21 Тест МТТ 76
2.2.22 Определение инфекционности аденовирусного потомства 76
2.2.23 Исследование антивирусной активности соединений 77
2.2.24 Статистическая обработка результатов 77
3 Результаты и обсуждение 78
3.1 Получение модельных линий клеток, геном которых содержит ген ДНК-полимеразы
pol-D36 или Е1А-D36 аденовируса типа 36 человека 78
3.1.1 Внесение последовательностей экспрессирующих кассет «промотор - целевой ген - IRES - маркерный ген флуоресцентного белка dTomato» в геном клеток-мишеней 79
3.1.2 Оценка уровня экспрессии генов pol-D36 и E1A-D36 в клетках модельных линий 81
3.2 Подавление экспрессии генов pol и Е1А аденовируса группы D типа 36 человека с
помощью siРНК в клетках модельных линий 85
3.2.1 Дизайн последовательностей siРНК 86
3.2.2 Оценка эффективности подавления экспрессии гена pol-D36 с помощью siРНК в клетках модельных линий 86
3.2.3 Оценка эффективности подавления экспрессии гена E1A-D36 с помощью siРНК в клетках модельных линий 88
3.3 Подавление экспрессии гена pol-D36 с помощью модифицированных siРНК 91
3.4 Подавление экспрессии генов pol и Е1А аденовирусов группы D человека с помощью лентивирусных векторных частиц, кодирующих shРНК
3.4.1 Получение лентивирусных векторных частиц, кодирующих shРНК 94
3.4.2 Оценка эффективности подавления экспрессии гена pol-D36 c помощью лентивирусных векторных частиц, кодирующих shРНК 95
3.4.3 Подавление экспрессии гена E1A-D36 с помощью лентивирусных частиц, кодирующих shРНК 97
3.4.4 Подавление репликации аденовирусов группы D человека с помощью shРНК 98
3.5 Противоаденовирусная активность 5-амино производных урацила 100
Заключение 105
Выводы 107
Список сокращений 108
Благодарности 111
- Взаимодействие аденовируса с рецепторами клеточной поверхности
- Пластиковая посуда, другие материалы
- Выделение суммарной РНК из клеток перевиваемых культур
- Оценка эффективности подавления экспрессии гена E1A-D36 с помощью siРНК в клетках модельных линий
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Причиной большого числа инфекционных заболеваний человека являются аденовирусы – безоболочечные вирусы, геном которых представлен линейной несегментированной двухцепочечной ДНК. В настоящее время известно 65 типов аденовирусов человека (HAdV), которые подразделяют на группы А-G по их морфологическим и онкогенным свойствам, по способности к гемагглютинации, размеру генома и последовательности ДНК.
Аденовирусы вызывают поражения дыхательной и пищеварительной систем, а также глазные инфекции. Особенную опасность аденовирусные инфекции представляют для людей с нарушениями иммунной системы: заболевания протекают более тяжело и могут привести к летальному исходу. Наиболее тяжелые формы офтальмологической инфекции (конъюнктивит – воспаление слизистой оболочки глаза конъюнктивы и аденовирусный эпидемический кератоконъюнктивит – сочетанное воспаление конъюнктивы и роговицы) вызывают HAdV 8, 19, и 37, относящиеся к группе D. Эпидемическим кератоконъюнктивитом в России ежегодно страдают более 300000 человек. Последствиями данного заболевания могут быть длительная нетрудоспособность, а также временная или стойкая утрата зрения.
Разработанность темы исследования. В настоящее время не существует препаратов селективно и эффективно воздействующих на аденовирусы человека. Недостаточная эффективность существующих подходов к лечению аденовирусной инфекции диктует необходимость разработки терапевтических средств с избирательным механизмом действия на возбудителей данного заболевания.
Актуальным является поиск генов-мишеней, подавление которых может купировать развитие
аденовирусной инфекции. Перспективным подходом исследования и регуляции
функциональной активности генов является РНК-интерференция. Нам представляется возможным применить метод РНК-интерференции для подавления экспрессии ранних генов Е1А и ДНК-полимеразы pol, а, следовательно, и репликации аденовирусов группы D человека, которые вызывают поражения глаз и дыхательных путей.
Большой интерес также представляют разработка и поиск новых потенциальных лекарственных средств для высокоэффективной анти-аденовирусной терапии – низкомолекулярных соединений, способных селективно подавлять репликацию аденовирусов человека.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка подхода для эффективного подавления репликации аденовирусов человека.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Получение модельных линий клеток, экспрессирующих ген ДНК-полимеразы pol аденовируса группы D типа 36 человека или ген Е1A аденовируса группы D типа 36 человека;
-
Дизайн и оценка эффективности действия siРНК, предназначенных для подавления активности гена ДНК-полимеразы или гена Е1A аденовирусов группы D человека в модельных линиях клеток;
-
Конструирование и оценка эффективности действия лентивирусных векторов, несущих в своем геноме последовательности, кодирующие shРНК – предшественники siРНК, предназначенные для подавления активности гена ДНК-полимеразы pol или гена Е1A аденовирусов группы D человека на модельных линиях клеток, а также с использованием репликационно-компетентных аденовирусов группы D;
-
Анализ активности 5-амино производных урацила как потенциальных ненуклеозидных ингибиторов репликации аденовирусов человека.
Научная новизна работы. Нами сконструирована оригинальная модельная система, позволяющая оценивать ингибирующую активность малых интерферирующих РНК в отношении ключевых факторов репликации аденовирусов группы D человека – ДНК-полимеразы и продуктов гена Е1А – предполагаемых мишеней для разработки противовирусной терапии, подавление которых может купировать развитие аденовирусной инфекции.
При исследовании ингибиторного действия 5-амино производных урацила были выявлены
новые соединения – 1-[4-(фенокси)бензил]-5-(N-морфолино)урацил и 6-аза-1-[4-
(фенокси)бензил]-5-(фениламино)урацил – активные в отношении аденовирусов человека.
Научно-практическая значимость работы. Нами разработан подход к эффективному подавлению репликации аденовирусов группы D человека с помощью РНК-интерференции. С целью оценки ингибирующей активности siРНК, специфичных в отношении генов ДНК-полимеразы pol и E1A HAdV 8, 19, 36 и 37, а также лентивирусных векторов, направляющих в клетках синтез аналогичных shРНК, мы получили модельные линии клеток, геном которых содержит экспрессирующую кассету «промотор – ген ДНК-полимеразы pol или E1A HAdV 36– IRES – маркерный ген dTomato – ген устойчивости к пуромицину». Такие модельные линии клеток позволяют быстро определять эффективность действия интерферирующих РНК, комплементарных различным участкам мРНК целевого гена.
С использованием первичных клеток лимба человека, входящих в состав роговицы глаза человека, которая поражается при эпидемическом кератоконъюнктивите, а также HAdV 8 и 37, основных возбудителей данного заболевания, мы получили модельную систему аденовирусной
офтальмологической инфекции in vitro, в которой с высокой эффективностью применили shРНК, направленные против ранних генов аденовирусов группы D человека, в качестве предполагаемых терапевтических агентов.
Показано, что 5-амино производные урацила – 1-[4-(фенокси)бензил]-5-(N-морфолино)урацил и 6-аза-1-[4-(фенокси)бензил]-5-(фениламино)урацил – значительно подавляют репликацию HAdV 5.
Таким образом, результаты нашего исследования будут полезны для разработки и создания современных лекарственных средств, эффективных при заболеваниях человека, вызываемых аденовирусами.
Методология и методы исследования. В работе были использованы современные биологические методы проточной цитофлуориметрии, ПЦР в реальном времени, количественной ПЦР, флуоресцентной микроскопии, Вестерн-блота, трансдукции клеток лентивирусными частицами, трансфекции малых интерферирующих РНК и плазмид, а также методы генной инженерии.
Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты работы были представлены на 3 российских и 3 международных конференциях. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.
Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах и включают 42 рисунка и 6 таблиц. Диссертация состоит из разделов: « Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список сокращений», «Список литературы», который содержит 342 ссылки.
Взаимодействие аденовируса с рецепторами клеточной поверхности
Домен CR1 требуется для связывания Е1А с несколькими белками клетки, участвующими в ремоделировании хроматина: P300/CBP, PCAF, GCN5 и p400 [84]. Взаимодействие белков Е1А с p300 и CBP, а также с белками семейства ретинобластомы RB1, RBL1 (p107), и RBL2 (p130) является необходимым условием для индукции синтеза клеточной ДНК в ходе аденовирусной инфекции [85-87]. Образование тримерного комплекса белками семейства RB, Е1А и p300 или СВР (рис. 6А) требуется и для трансформации первичных клеток почек крысят [88].
К функциям домена CR2 относят взаимодействие с опухолевыми супрессорами – белками семейства ретинобластомы и обеспечение отсоединения этих белков от гетеродимерного фактора транскрипции E2F/DP, что приводит к активации E2F-зависимой транскрипции (рис. 6Б) [89]. Известно, что экспрессия генов Cdc6 и циклина A, участвующих в регуляции клеточного цикла, контролируется факторами транскрипции семейства E2F. Во время ареста клетки в фазе G0 промоторные области этих генов связаны с фактором транскрипции E2F4, репрессирующим их экспрессию. В свою очередь E2F4 ассоциирован с RBL2 (p130), который взаимодействует c комплексом деацетилирования гистонов, включающим гистоновые деацетилазы HDAC1/2 и белок mSin3B [90, 91].
Рисунок 6. Модель тримерного комплекса E1A/RB1/CBP. А – В формировании комплекса участвуют а.о. 37-129 белка Е1А (показаны оранжевым), домен-карман RB1 (показан коричневым) и домен TAZ2 белка CBP (показан синим) [88]. Б – Схема активации E2F/DP-зависимой транскрипции [92].
Кроме того, промоторные области генов Cdc6, циклин-зависимой киназы 2 и циклинов A/E взаимодействуют с гистоновой метилтрансферазой Suv39H1, которая метилирует гистон Н3 по а.о. лизина в 9 положении (H3K9), создавая, таким образом, участки связывания с репрессорным белком HP1 (heterochromatin protein 1) [92, 93]. Экспрессия Е1А приводит к распаду комплекса RBL2 и фактора транскрипции E2F4, последующей замене респрессорного E2F4 факторами активации транскрипции E2F1, 2, 3, а также ацетилированию H3K9 [72]. Таким образом, Е1А стимулирует переход покоящихся клеток в S-фазу клеточного цикла посредством ремоделирования структуры хроматина.
По размеру 13S и 12S различаются на 46 а.о., которые формируют домен CR3 изоформы 13S. Белок 13S повышает уровень транскрипции Е1А примерно в 5 раз, гена Е1B – более чем в 10 раз, а регионов E2, E3, и E4 – более чем в 100 раз [72]. Для этого необходимо стабильное и высокоспецифичное взаимодействие уникального CR3 домена белка 13S с субъединицей MED23 медиатора транскрипции человека [94]. Взаимодействие CR3 и MED23 приводит к стимуляции образования преинициаторных комплексов на промоторах и элонгации транскрипции [95, 96]. Кроме того, активации транскрипции ранних генов способствует взаимодействие домена CR3 c белком p300. Тем не менее, отсутствие домена CR3 у белка 12S не влияет на его способность стимулировать трансформацию и переход инфицированной клетки в состояние пролиферации [84]. Таким образом, обе изоформы Е1А могут стимулировать переход клеток, арестованных в фазах G0 и G1 в S-фазу клеточного цикла в отсутствии других митогенных сигналов [97]. Это объясняет возможность развития полноценной инфекции при заражении аденовирусом полностью дифференцированных покоящихся клеток эпителия верхних дыхательных путей человека [72].
Домен СR4 расположен в С-концевой области белков Е1А. СR4 содержит сигнал ядерной локализации (NLS), состоящий из 5 а.о., а также домен репрессии транскрипции [98, 99]. Репрессия транскрипции происходит в результате связывания одного из двух близкородственных клеточных белков CtBP1 или 2 с высококонсервативной последовательностью PXDLS, расположенной рядом с сигналом ядерной локализации [100-102]. Сравнительно недавно была открыта способность CR4 взаимодействовать с белком DREF (DNA replication-related element binding factor), также называемым ZBED1 (zinc finger BEDype containing). До этого было выявлено только 5 белков, способных взаимодействовать с С-концом Е1А. DREF связывается c а.о. L272 и L273, расположенными в домене CR4. Роль DREF в ходе аденовирусной инфекции многогранна и до конца не изучена: с одной стороны, он действует как активатор транскрипции вирусных генов на ранних стадиях жизненного цикла вируса, с другой, способен ограничивать размножение вируса [83].
Стимуляция клеточного цикла белками Е1А приводит к активации опухолевого супрессора p53, что является сигналом к запуску p53-зависимого апоптоза. Развитию апоптоза в зараженной клетке препятствуют белки, кодируемые областью Е1В [103, 104]. Помимо этого, белки Е1В-19K и E1B-55K препятствуют транспорту клеточной мРНК и способствуют транспорту вирусных мРНК. Е1В-19K гомологичен белкам семейства BCL-2. Он взаимодействует с белками BAK и BAX, препятствуя их олигомеризации, тем самым предотвращая образование пор в наружной мембране митохондрий и высвобождение проапоптотических белков – цитохрома c и Smac/DIABOLO, активирующих каспазу-3 и каспазу-9. На сегодняшний день известно несколько механизмов, позволяющих Е1В-55K блокировать развитие p53-зависимого апоптоза. Основными являются непосредственная стабилизация p53 и ингибирование активации его транскрипции. Участок связывания Е1В-55K с опухолевым супрессором расположен на N-конце p53, где также находятся домен активации и область взаимодействия с убиквитинлигазой MDM2, которая регулирует процесс разрушения p53 в протеосомах [72].
Область Е2 кодирует белки, участвующие в репликации вирусной ДНК: ДНК-связывающий белок DBP (DNA-binding protein), кодируемый геном Е2А, ДНК-полимеразу pol и предшественник pTP концевого белка TP (ген Е2В).
Участок Е3 кодирует белки, которые участвуют в подавлении иммунного ответа инфицированного организма [105-107]. Количество белков, способных модулировать иммунный ответ варьирует от шести до девяти в зависимости от типа аденовируса [108]. Наиболее подробно изучены продукты гена Е3 аденовирусов человека, относящихся к группе С. Установлено, что гликопротеин Е3-19К препятствует распознаванию зараженных клеток Т-клетками инфицированного организма: Е3-19К предотвращает транспорт молекул главного комплекса гистосовместимости класса I (MHC I) из эндоплазматического ретикулума (ЭПР) к плазматической мембране клетки [109]. Однако такие клетки все еще могут быть уничтожены натуральными киллерами (natural killer cells). Е3-19К блокирует выход из ЭПР и презентацию на поверхности зараженной клетки двух лигандов рецептора натуральных киллеров NKG2D (Natural Killer Group 2D) – белков MICA и MICB (MHC class I chain-related proteins) [110, 111]. Это затрудняет узнавание и уничтожение инфицированных клеток натуральными киллерами. Известно, что по крайней мере четыре продукта транскрипционной области Е3 (белки E3-6.7K, E3-10.4K, E3-14.5K и E3-14.7K) способны ингибировать развитие апоптоза в зараженной клетке. Этот эффект достигается, главным образом, путем подавления рецепторов плазматической мембраны, задействованных в развитии ФНО--опосредованного апоптоза: рецептора ФНО 1, рецепторов TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) 1 и 2 и рецептора Fas/Apo-1 (CD95), а также за счет модуляции функций белков FIP 1-3 (fourteen.7K-interacting-protein), обладающих ГТФазной активностью и участвующих в сигнальных путях ФНО-, при их взаимодействии с аденовирусным белком Е3-14.7К [112-116]. На более поздних стадиях жизненного цикла аденовируса наблюдается повышенная экспрессия белка E3-11.6K, что способствует лизису зараженных клеток и, следовательно, выходу вирусного потомства (на сегодняшний день механизм данного явления до конца не изучен).
Предполагают, что соответствующие продукты транскрипционной области E3 аденовирусов человека, не относящихся к группе С, обладают аналогичными свойствами. Тем не менее, некоторые аденовирусы экспрессируют белки не гомологичные таковым у HAdV группы С. Установлено, что белок Е3-49K продуцируют только аденовирусы группы D человека [35]. В отличие от других продуктов региона Е3, его экспрессия продолжается в течение всего инфекционного цикла аденовируса. По молекулярному весу (80–100 кДа) он превосходит все известные белки, закодированные в участке E3. Е3-49K представляет собой трансмембранный белок, состоящий из трансмембранного домена и проксимального мембранного домена, имеющего иммуноглобулин-подобную структуру, а также множества N-гликанов и нескольких O-гликанов [117]. Впервые E3-49K был обнаружен в аппарате Гольджи и ранних эндосомах. Все описанные на сегодняшний день белки аденовирусов выполняют свои функции, не покидая пределов зараженной клетки. В отличие от них E3-49K под действием клеточных протеаз переходит в секретируемую форму sek49K (секретируется большая часть проксимального мембранного домена белка). Sek49K обладает иммуномодулирующими свойствами: на это указывает его способность взаимодействовать с первичными лейкоцитами и лимфоидными клетками, но не с эпителиальными клетками или фибробластами in vitro [118]. Было показано, что sek49K, связываясь с CD45 – представителем семейства тирозиновых протеинфосфатаз рецепторного типа, участвующих в регуляции передачи сигнала, активации и дифференцировки лимфоцитов, оказывает влияет на функции Т-клеток и натуральных киллеров (рис. 7)
Пластиковая посуда, другие материалы
Липоплексы на основе диметилгидроксиэтиламинопропанкарбамоилхолестерина (DMHAPC-Chol) и DOPE успешно использовали для доставки siРНК, направленной против мРНК фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), в клетки линий A431 (эпидермоидный рак человека) и MDA-MB231 (рак молочной железы человека). Введение комплексов DMHAPC-CholDOPE, содержащих анти-VEGF-siРНК, приводило к снижению экспрессии целевого гена более чем на 90%. Такие наночастицы обладали большей эффективностью трансфекции, чем при использовании Lipofectamine 2000 (Life Tecnologies). При трансфекции плазмиды, содержащей GFP, и анти-GFP-siРНК оказалось, что липоплексы на основе DMHAPC-CholDOPE более эффективны для транспортировки siРНК, чем плазмидной ДНК [231, 322].
K. Un и соавт. предложили использовать липоплексы, ассоциированные с маннозой и чувствительные к ультразвуковому воздействию [323-326], для селективной доставки малых интерферирующих РНК в клетки печени. Подобный метод доставки siРНК сочетает в себе преимущества липофекции и сонопорации: значительное количество переносимых нуклеиновых кислот может проникать непосредственно в цитоплазму благодаря образованию пор в клеточной мембране под действием ультразвука. В данной работе были использованы siРНК, направленные против мРНК гена белка внутриклеточной адгезии ICAM-1, экспрессия которого повышена в эндотелиальных клетках печени на ранних стадиях развития гепатита. В результате экспрессия ICAM-1 существенно снижалась как in vitro в эндотелиальных клетках печени, так и in vivo на мышиных моделях воспаления печени, индуцированного липополисахаридами, диметилнитрозамином, четыреххлористым углеродом, ишемией-реперфузией. Кроме того, in vivo отмечали мощный противовоспалительный эффект. Предложенный способ доставки siРНК считается перспективным для терапии заболеваний печени [231, 326].
Стабильные частицы нуклеиновая кислота-липид (stable nucleic acid-lipid particles – SNALP) (рис. 19Б) сравнительно недавно были разработаны Tekmira Pharmaceuticals Corporation. SNALP представляют собой полимерные наночастицы размером около 100 нм, состоящие из ионизируемых катионных липидов, таких, как DLin-DMA (1,2-дилинолеилокси-3 диметиламинопропан), DLin-КС2-DMA (2,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3] диоксалан) и холестерин, липидов с высокой температурой фазового перехода (1,2-дистеароил sn-глицеро-3-фосфохолин – DSPC) и ПЭГилированных липидов. Для сложноорганизованных SNALP характерно пролонгированные время циркуляции в кровотоке; кроме того, существует возможность присоединения химических групп различной природы с целью усовершенствования данной системы доставки без потери эффективности, что позволяет решать различные задачи при доставке siРНК [231, 317, 327].
D.V. Morrissey и соавт. показали возможность применения SNALP для эффективной системной доставки siРНК на мышиной модели вирусного гепатита В (HBV). Внутривенное введение SNALP, содержащих анти-HBV-siРНК (3 мг/кг) в течение 3 дней подряд приводило к торможению репликации вируса. Этот эффект сохранялся в течение 7 дней после инъекций комплексов SNALPанти-HBV-siРНК [231, 301].
SNAPL были использованы в качестве системы доставки siРНК, направленной против мРНК гена аполипопротеина В (ApoВ), у яванских макаков. Спустя 48 ч после однократного внутривенного введения 2,5 мг/кг анти-ApoB-siРНК, заключенных в SNALP, уровень мРНК ApoB в печени снижался на 80–90% одновременно с уменьшением концентрации холестерина в сыворотке крови на 65%. Такой подход оказывает быстрый и продолжительный эффект (до 11 дней после инъекции комплексов SNALPsiРНК) [231, 328].
Также SNAPL применяли для доставки siРНК, направленной против мРНК киназы PLK1. Сверхэкспрессия гена PLK1 играет важную роль в нарушении регуляции пролиферации опухолевых клеток различного гистологического происхождения. Внутривенное введение комплексов SNALPанти-PLK1-siРНК приводило к подавлению роста ортотопических Hep3B опухолей печени у мышей. Показано, что SNALP не иммуногенны [231, 322].
Лентивирусные векторы получают на основе вируса иммунодефицита человека 1. В процессе конструирования лентивирусного вектора транс-элементы генома ВИЧ-1 (гены gag, pol, и env) заменяют другими генами по выбору экспериментатора, в то время как все цис-элементы, необходимые для упаковки (-область), обратной транскрипции и построения второй цепи ДНК провируса (primer binding site – участок связывания тРНК-праймера, LTR (long terminal repeat, длинный концевой повтор) и обогащенный пуринами участок), интеграции (концевые аtt–последовательности) и транскрипции (энхансер/промотор 5-LTR либо заменяющий его внутренний гетерологичный промотор), как правило, не подвергаются изменениям. Лентивирусные векторы способны нести трансген размером до 8 т.п.н. Лентивирусные частицы собирают с использованием различных систем упаковывающих клеток, в которых синтезируются вирусоспецифичные белки [329].
Для снижения риска возникновения репликационно-компетентных частиц в результате рекомбинации компоненты генома вируса, необходимые для сборки лентивирусного вектора, обычно разделяют на три-четыре плазмиды: одну-две упаковочных, собственно векторную, и плазмиду, кодирующую белок оболочки вируса. В настоящее время в упаковочных системах третьего поколения используют конструкции, из которых удалены все цис-элементы, кроме RRE и донорного сайта сплайсинга, необходимого для посттранскрипционного процессинга мРНК. Вместо промотора длинного концевого повтора LTR используют также гетерологичный промотор (обычно промотор цитомегаловируса) и сигнал полиаденилирования вируса SV40. Гены rev и gag/pol вводят в клетки в составе разных экспрессирующих кассет [330].
С помощью лентивирусных векторов переносят shРНК – предшественниками siРНК. Для экспрессии shРНК используют промоторы РНК-полимеразы III – U6 или H1. Их размер, как правило, составляет около 400 п.н. Транскрипция с этих промоторов начинается с позиции +1. При конструировании лентивирусного вектора для экспрессии shРНК необходимо учитывать тот факт, что при использовании промотора U6 желательно, чтобы транскрипция начиналась с гуанина. Сигналом терминации транскрипции служит последовательности из 5-6 остатков тимина: в результате образуется двухцепочечная shРНК с неспаренными нуклеотидами на 3-конце без 5-кепа и 3-поли(А)-последовательности. Такая структура shРНК-дуплекса необходима для дальнейшего процессинга белком Dicer. Промоторы U6 и H1 обеспечивают стабильный и достаточно высокий уровень экспрессии shРНК в клетках всех типов [330]. В лентивирусный вектор часто включают маркерные гены, кодирующие флуоресцентные белки или сообщающие клеткам устойчивость к определенному антибиотику [331, 332]. Присутствие в векторе маркерных генов позволяет проводить селекцию трансдуцированных клеток и оценивать эффективность трансдукции.
Выделение суммарной РНК из клеток перевиваемых культур
Согласно данным проточной цитофлуориметрии и ПЦР в реальном времени наиболее эффективным действием на экспрессию гена Е1А-D36 обладает siЕ1А-2. Ингибирующая активность siРНК определяется группой факторов. К ним относятся: вторичная структура мРНК-мишени, уникальность последовательности siРНК, стабильность и термодинамическая асимметрия дуплексов siРНК. Известно, что вторичная структура мРНК-мишени или связанные с ней белки могут затруднять доступ для siРНК [234].
Несмотря на положительные результаты, полученные с помощью синтетических siРНК, всё ещё продолжает остро стоять вопрос о повышении их стабильности in vitro и in vivo. Период полужизни немодифицированных siРНК в сыворотке крови непродолжителен, что является серьезным препятствием для их клинического применения [284]. Распространенным методом решения проблемы стабильности siРНК является внесение химических модификаций [340].
Было проведено сравнение эффективности и продолжительности действия двух немодифицированных siРНК (siE2B-1 и siE2B-2), направленных против разных районов мРНК гена ДНК-полимеразы HAdV 8, 19, 36 и 37, и их модифицированных аналогов: siE2B-1 mod и siE2B-1 fork, а также siE2B-2 mod и siE2B-2 fork.
Участки модифицированных siE2B-1 mod и siE2B-2 mod, чувствительные к действию нуклеаз, были защищены путем введения 2-O-метил-аналогов рибонуклеотидов по алгоритму, разработанному сотрудниками лаборатории химии РНК ИХБФМ СО РАН. Показано, что внесение таких модификаций приводит к более продолжительному подавлению экспрессии целевого гена [341], но в то же время увеличивает термостабильность siРНК (введение 2-O-метил аналогов в состав олигорибонуклеотида увеличивает температуру плавления дуплексов siРНК на 0,5-0,7оС на одну модификацию), что, в свою очередь, может сказаться на эффективности ингибирования экспрессии гена-мишени.
siE2B-1 fork и siE2B-2 fork содержат замены четырех нуклеотидов на 3-конце смысловой цепи. Молекулы с подобной структурой называют “fork-siРНК”. Как правило, такая модификация приводит к дестабилизации дуплекса siРНК и повышению ее биологической активности. Ингибирующая активность 2-O-метил-модифицированных fork-siРНК сравнима с активностью своих немодифицированных аналогов. Эти siРНК обладают также высокой стабильностью [342]. В качестве контроля использовали siScr, последовательность которой не имеет гомологии с известными вирусными мРНК и мРНК человека, мыши и крысы. Дуплексы siРНК трансфицировали в клетки модельной линии Н1299 Е2В в концентрации 200 нМ с помощью реагента Lipofectamine 2000 (Life Technologies) согласно протоколу производителя. Изменение уровня экспрессии целевого гена pol-D36 под действием siРНК оценивали в течение 12 дней после трансфекции методами проточной цитофлуориметрии (по уровню флуоресценции маркерного белка dTomato) и ПЦР в реальном времени.
Исследование ингибирующей активности siРНК показало существенные различия в эффективности и длительности действия 2-O-метил siРНК, 2-O-метил fork-siРНК и их немодифицированных аналогов. Показано, что уже через 2 суток после трансфекции происходило снижение уровня мРНК мишени (рис. 32А, В).
Рисунок 32. Эффективность подавления экспрессии гена pol-D36 с помощью siРНК. В качестве контроля использовали siScr. Относительное количество мРНК pol-D36 и средний уровень флуоресценции dTomato в контрольных образцах приняты за 1 и 100% соответственно. Все представленные значения получены в ходе трех независимых опытов (p 0,05). А – Содержание мРНК гена pol-D36 в клетках линии Н1299 Е2B под действием siE2B-1, siE2B-1 mod, siE2B-1 fork. Б – Средняя интенсивность флуоресценции белка dTomato в клетках линии Н1299 Е2В под действием siE2B-1, siE2B-1 mod, siE2B-1 fork. В – Содержание мРНК гена pol-D36 в клетках линии Н1299 Е2B под действием siE2B-2, siE2B-2 mod, siE2B-2 fork. Г – Средняя интенсивность флуоресценции белка dTomato в клетках линии Н1299 Е2В под действием siE2B-2, siE2B-2 mod, siE2B-2 fork. Наиболее значительным было изменение уровня экспрессии pol-D36 под действием siЕ2В-1 и ее аналогов через 4 дня после трансфекции: уровень мРНК pol-D36 снижался в среднем на 87,9%, 66,9% и 75,8% при использовании siE2B-1, siE2B-1 mod и siE2B-1 fork соответственно по сравнению с контролем. Установлено, что немодифицированная siE2B-1 действует не только более эффективно, но и более длительно, чем ее аналоги: через 12 дней после трансфекции этой siРНК уровень мРНК pol-D36 был снижен в среднем на 21,8% по сравнению с контролем, тогда как действие siE2B-1 mod и siE2B-1 fork к этому времени уже закончилось, и они не влияли на экспрессию гена-мишени (рис. 32А). Эти данные согласуются с результатами, полученными методом проточной цитофлуориметрии (рис. 32Б).
siЕ2В-2 mod, содержащая 2-O-метил-модификации в участках смысловой цепи, чувствительных к действию нуклеаз, оказалась заметно стабильнее своих аналогов – siE2B-2 fork и немодифицированной siE2B-2. В течение 6 дней после трансфекции эффективность ингибирующего действия siE2B-2 mod и siE2B-2 fork находилась на одинаковом уровне и несколько превышала эффективность немодифицированной siE2B-2 (на 4-й день снижение экспрессии мРНК гена-мишени составляло в среднем 65,1%, 80,1% и 79% для siE2B-2, siE2B-2 mod и siE2B-2 fork соответственно по сравнению с контролем). В период с 8 по 12 день после трансфекции только siE2B-2 mod обеспечивала стабильно высокий уровень подавления целевого гена. На 12-й день после трансфекции siE2B-2 и siE2B-2 fork не влияли на экспрессию pol-D36, тогда как siE2B-2 mod снижала уровень мРНК целевого гена в среднем на 56,4% (рис. 32В). Эти результаты согласуются с данными, полученными методом проточной цитофлуориметрии (рис. 32Г).
Изменение биологической активности siЕ2В-1 и siE2B-2 после внесения модификаций может быть связано как с изменением температуры плавления siРНК, так и с влиянием модификаций на термодинамическую асимметрию дуплекса. Модификации могли повлиять на структуру участков siРНК, которые взаимодействуют с белками, участвующими в процессе РНК-интерференции. Таким образом, эффективность действия siРНК зависит от комплекса факторов и не всегда может быть предсказана заранее. Замена нескольких нуклеотидов на 3-конце смысловой цепи siЕ2В-1 и siЕ2В-2 не привела в нашем случае к существенному усилению ингибирующей активности этих siРНК. По-видимому, это может быть связано с тем, что при выборе последовательности siРНК уже была учтена термодинамическая асимметрия дуплексов, и расположение нуклеазочувствительных сайтов в составе данных дуплексов не привело к искажению асимметрии в результате введения модификаций. С помощью 2-O-метил-модификации определенных участков молекулы siЕ2В-2, чувствительных к воздействию нуклеаз, мы получили siРНК, обеспечивающую стабильное подавление гена-мишени в течение 12 дней после трансфекции. Это позволяет рассматривать siЕ2В-2 mod в качестве потенциального лекарственного средства, обладающего специфичным и пролонгированным действием в отношении аденовирусов человека.
Оценка эффективности подавления экспрессии гена E1A-D36 с помощью siРНК в клетках модельных линий
Данные были получены с помощью метода ПЦР в реальном времени в ходе трех независимых экспериментов. Относительное количество мРНК гена Е1А-D36 под действием shE1A снизилось в среднем на 57%, 77% и 80% через 3, 6 и 10 дней соответственно по сравнению с контролем.
Мы показали, что использование лентивирусных векторов, кодирующих shРНК, приводит к существенному подавлению экспрессии целевого гена Е1А-D36. Необходимо добавить, что ингибирование экспрессии Е1А-D36, опосредованное shРНК-экспрессирующими лентивирусными частицами, в модельных клетках является стабильным в течение 10 дней. Это свидетельствует о высокой эффективности сконструированных нами лентивирусных векторов.
Было исследовано влияние shE2B, направленной против мРНК гена ДНК-полимеразы аденовирусов группы D человека, на вирусную репликацию. Клетки линии Н1299 трансдуцировали лентивирусными частицами shE2B-LeGO-G и shScr-LeGO-G, после чего заражали аденовирусами группы D человека HAdV 8 и HAdV 37 с множественностью инфекции 20 ФОЕ/клетку. Клетки культивировали в течение 6 дней после заражения: этого времени достаточно для завершения полного репликационного цикла аденовируса человека. Через 6 дней после инфекции эффективность действия shРНК оценивали по определению количества копий генома HAdV 8 и HAdV 37 методом количественной ПЦР. Количество копий генома HAdV 8 и HAdV 37 снижалось в среднем на 89,6% и 92,2% под действием shE2В соответственно по сравнению с контролем (рис. 37).
Кроме того, была исследована ингибирующая активность shРНК, направленных против мРНК ранних генов Е1А и pol аденовирусов группы D человека, в отношении вирусной репликации в первичных клетках лимба роговицы человека. Первичные клетки лимба роговицы человека Limb трансдуцировали лентивирусными векторами shE2B-LeGO-G и shE1A-LeGO-Cerulean/BSD, кодирующими shE2B и shE1A, соответственно. В качестве контроля использовали клетки Limb, трансдуцированные соответствующими псевдолентивирусными частицами, несущими shScr, последовательность которой не имеет гомологии с известными вирусными мРНК и мРНК мыши, крысы и человека.
Клетки полученных линий заражали аденовирусами человека HAdV 8 и HAdV 37, которые являются причиной эпидемического кератоконъюнктивита, с множественностью инфекции 20 ФОЕ/клетку. Клетки культивировали в течение 6 дней после заражения. Через 6 дней после инфекции эффективность действия shРНК оценивали по определению количества копий генома HAdV 8 и HAdV 37 методом количественной ПЦР.
Количество копий генома аденовируса было оценено методом количественной ПЦР. Количество копий генома аденовируса в контрольных образцах принято за 1. Все представленные данные получены в ходе трех независимых экспериментов. Различия между опытными и контрольными образцами статистически значимы во всех случаях ( p 0,01, p 0,001).
Мы наблюдали значительное подавление репликации аденовирусов человека в первичных клетках лимба человека. Количество копий генома HAdV 8 и HAdV 37 снижалось в среднем на 59% и 58% под действием shE2В, на 37% и 30% под действием shЕ1А, а также на 73% и 60% под действием одновременно shE2B и shE1A соответственно по сравнению с контролем (рис. 38).
Мы предполагаем, что в результате подавления экспрессии ранних генов аденовирусов группы D человека, цикл репликации аденовирусов останавливается на ранней стадии. Это объясняет существенное снижение количества копий геномов аденовирусов. Тем не менее, нам не удалось добиться полного подавления вирусной репликации. Это можно связать с высоким значением множественности инфекции (20 ФОЕ/клетку), временем анализа образцов – 6 дней после инфекции, тогда как максимальный эффект подавления экспрессии целевых генов с помощью shРНК наблюдается на 9-10 день, а при использовании первичных клеток лимба роговицы человека также и невысокой эффективностью их трансдукции (50-70% флуоресцирующих клеток в популяции по данным флуоресцентной микроскопии).
В ходе данного эксперимента мы использовали первичные клетки лимба человека, входящие в состав роговицы глаза человека, которая поражается при эпидемическом кератоконъюнктивите. Также мы использовали HAdV 8 и 37, которые являются основными возбудителями данного заболевания.
Подавление репликации HAdV 8 и 37 в первичных клетках лимба человека с помощью shРНК. Количество копий генома аденовируса было оценено методом количественной ПЦР. Количество копий генома аденовируса в контрольных образцах принято за 1. Все представленные данные получены в ходе трех независимых экспериментов. Различия между опытными и контрольными образцами статистически значимы во всех случаях ( p 0,05, p 0,0001).
Таким образом, нам удалось разработать модельную систему аденовирусной офтальмологической инфекции in vitro, и с высокой эффективностью применить shРНК, направленные против ранних генов аденовирусов группы D человека, в качестве предполагаемых терапевтических агентов.