Введение к работе
- I - Актуальность проблемы. Клещевой энцефалит (КЭ) - тяжелая и, в настоящее время, наиболее эпидемиологически значимая для РФ природноочаговая вирусная инфекция. Вакцинация населения природных очагов и контингеитов, профессионально связанных с риском заражения, играет основную роль в снижении ущерба, наносимого здоровью людей вирусом КЭ. Поэтому исследования по разработке и совершенствованию вакцин против КЭ не прерываются у нас в стране уже 60 лет. За это время работы по инактивированной вакцине против КЭ (ИВКЭ) ознаменовались рядом крупных этапных достижений (мозговая вакцина, тканевая вакцина, концентрированная очищенная вакцина), последовательно усовершенствовавших препарат в отношении реактогенности и антигенности (А.А. Смородинцев и соавт., 1941, Е.Н. Левкович и соавт., 1330, Л.Б.Эльберт и соавт., 1980). Однако, недостатки ИВКЭ как средства профилактики КЭ (ограниченная эпидемиологическая эффективность, двух-трехкратность инъекций при вакцинации и неоходимость ежегодной ревакцинации) не удалось преодолеть даже созданием высокоантигенной концентрированной очищенной вакцины, весьма дорогостоящего препарата. В условиях постоянно возрастающей заболеваемости КЭ, обусловленной повышением контактов населения с природными и антропургическими очагами циркуляции вируса и отменой их обработок акарицидами, нужда з более эффективной и менее дорогой вакцине очевидна.
Переболевание КЭ и, по-видимому, перенесение инфекции з наиболее часто встречающейся бессимптомной форме оставляют пожизненный иммунитет. Уже в шестидесятые годы решение проблемы профилактики КЭ связывали с разработкой живой вакцины (ЖВКЭ), но попытки аттенуации вируса КЭ не были успешными. Поэтому, в качестве более перспективного источника штаммов для ЖВКЭ стали рассматривать открытый з 1956 г. (C.E.G. Smith) вирус Лангат ТР-21 -
- 2 -
сочлен антигенного комплекса вируса КЭ со сниженной патогенностью
для лабораторных животных, в районах циркуляции которого не
регистрировались лихорадочные заболевания с неврологической
симптоматикой (C.E.G. Smith, 1961, В.И. Ильенко и соавт., 1962-1968,
W.H. Price et al., 1953-1970, V. E.H. Левкович и соавт., 1964-1973, Mayer
et а!., 1963 -1976). В опытах на лабораторных животных иммунизация
этим вирусом обеспечивала эффективную защиту против всех вирусов
комплекса КЭ. Однако реализовать эту идею в шестидесятых-
семидесятых годах не удалось. Исследования остановились, когда
среди привитых одним из штаммов - кандидатов для ЖВКЭ (Еланцев
15-20/3) были зарегистрированы случаи поствакцинального
энцефалита (1:20000), а у золотистых хомячков, выживших после интрацеребрального заражения вирусом Лангат ТР-21 и усыпленных через 3-12 месяцев, выявлена спонгиозная дегенерация нервной ткани, что позволяло предполагать у них хроническую нейроинфекцию (LZIotnik et al., 1973). Возникли сомнения в возможности получения достаточно безопасной ЖВКЗ на основе вируса Лангат и опасения, что его аттенуированные варианты могут оказаться причиной не только острых поствакцинальных зццефалитов, но и обусловленных хронической нейроинфекцией отдаленных во времени неврологических осложнений. Исследования биологических свойств ослабленных вариантов вируса Лангат в последующие годы имело весьма ограниченный характер, и указанные вопросы остаются актуальными по настоящее время.
Решение первого из этих вопросов зависит от совершенства лабораторных методов сравнительной оценки потенциальной нейровирулентности ослабленных клонов флавивирусов. За истекшее время по усовершенствованию первичного отбора штаммов-кандидатов для ЖВКЭ были сделаны ряд предложений (Е.Н. Левкович и соавт., 1973, С.Г. Дзагуров: и соавт., 1977, СП. Чунихин и соавт., 1980, М.С. Воробьева и соавт., 1982). Однако, общепризнано, что наиболее адекватным способом сравнения потенциальной нейровирулентности
- З -для человека вирусов с неирогропными свойствами являются количественные нейроморфологические исследования на обезьянах. Разработанная же для этих целей неироморфопогаческая методика сравнительной оценки нейровирулентности флавивирусов по данным ее авторов (N.Nathanson et at., 1966-1968) и по результатам ее использования в весьма близкой модификации другими исследователями (А.Е. Чигиринский, 1984) не обладает неоходимой разрешающей способностью. Таким образом, изучение возможности получения более безопасных в качестве кандидатов для ЖВКЭ, чем штамм Еланцев 15-20/3, вариантов вируса Лангат оказалось связанным с необходимостью усовершенствования контроля их потенциальной нейровирулентности на обезьянах.
Рєшєнуіи второго вопроса может быть достигнуто при адекватных
экспериментальных подходах и использовании пока еще
существующей уникальной возможности клинико-зпидемиологических исследований отдаленных результатов иммунизации людей экспериментальными ЖВКЭ. Тяжелые дегенеративные изменения нервной ткани, сочетающиеся в ряде случаев с параличами мышц шеи и конечностей, были выявлены у золотистых хомячков, перенесших после внутримозгового заражения вирусом Лангат ТР-21 острый энцефалит, причем летальность достигала 40% (I. Zlotnik et al., 1973). Вирус был предварительно пассирован на хомячках-сосунках и значительно повысил свою патогенность для ззрослых животных. Следует учитывать также, что реакция животных разных видов на заражение одним и тем же вирусом может быть весьма различной. Более адекзатным экспериментальным подходом для изучения вопроса о возможности отдаленных неврологических последствий ЖВКЭ являются, безусловно, опыты с ослабленными вариантами вируса Лангат на низших приматах, наиболее близкой по биологии человеку лабораторной модели. Изучение же состояния здоровья людей на протяжении двух-трех десятилетий после иммунизации вариантами вируса Лангат, рассматривавшимися ранее как кандидаты в вакцинные,
обеспечивает возможность оценки реальной опасности отдаленных неврологических последствий, то есть длительно скрытой хронической нейроинфекции у человека.
Цель исследования. Определение перспектив разработки ЖВКЭ на основе вируса Лангат ТР-21: изучение возможностей аттенуации вируса, исследование потенциальной опасности отдаленных неврологических последствий вакцинации, получение нового клона -кандидата в вакцинные.
Задачи исследования:
1. Изучить возможность получения стабильных и иммуногенных
вариантов вируса Лангат ТР-21 с меньшей, чем у штамма Еланцев
15-20/3, остаточной нейровирулентностыо для обезьян:
- изучить клинические и нейроморфологические особенности
экспериментальных флавивирусных энцефалитов обезьян:
усовершенствовать методику сравнительной оценки потенциальной нейровирулентности флавивирусов в опытах на обезьянах по данным количественных нейроморфологических исследований;
получить несколько клонов штамма ТР-21; дифференцировать эти клоны по биологическим свойствам in vitro и на мышах между собой и со штаммами группы Еланцев;
провести сравнительные испытания потенциальной нейровирулентности полученных клонов вируса Лангат ТР-21 и штаммов группы Еланцев в опытах на обезьянах.
2. Исследовать безопасность аттенуированных вариантов вируса
Лангат в хронических опытах на обезьянах:
- провести длительное, до одного года, клиническое наблюдение,
включающее регулярные неврологические осмотры обезьян,
зараженных в головной мозг несколькими ослабленными вариантами
вируса Лангат;
- провести вирусологическое и морфологическое исследование ЦНС
обезьян через 6 и 12 месяцев после заражения несколькими
ослабленными вариантами вируса Лангат.
3. Изучить влияние иммунизации людей ослабленными вариантами
вируса Лангат на их здоровье в последующие годы, оценить
реальность опасений хронической нейроинфекции и неврологических
осложнений в отдаленные сроки:
- сбор и анализ данных о состоянии здоровья и причинах смерти людей,
привитых штаммом Еланцев 15-20/3 в конце шестидесятых-начале семидесятых годов;
- сбор и анализ данных о состоянии здоровья и причинах смерти
пациентов психиатрических клиник г. Санкт-Петербурга, привитых
вариантами ТР-21-А и ТК 9/2 в начале шестидесятых годов.
4. Подготовить новый штамм-кандидат для ЖВКЭ. Обосновать
лабораторные критерии его отбора и безопасности.
Положения, выносимые на защиту
1. Нейроморфологические особенности флавивирусных энцефалитов
обезьян определяются различиями в тропизме вирусов к отдельным
структурам ЦНС, общей выраженностью реакции нервной ткани на
заражение, превалированием дистрофически-некробиотических или
воспалительно-пролиферативных процессов в целом или в
определенных образованиях серого вещества головного или
спинного мозга.
2. Разрешающая способность количественных нейроморфологических
исследований для сравнения нейровирулентности на обезьянах
апатогенных по клиническим данным флавивирусов значительно
повышается при использовании показателей, рассчитанных на
основе дифференцированных определений поражения нейронов,
глиоза и воспалительной реакции.
3. Ослабленные клоны вируса Лангат ТР-21 гетерогенны по
биологическим свойствам. Методом предельных разведений на
мышах из популяции штамма ТР-21 выделены потенциально более безопасные в качестве вакцинных клоны, чем штамм Еланцев 15-20/3.
4. Ослабленные варианты вируса Лангат не являются индукторами
особых форм хронических нейроинфекций у обезьян и человека.
Через 6 и 12 месяцев после заражения в ЦНС обезьян не обнаружен
вирус и не было морфологических проявлений воспалительно-
дегенеративного процесса или иных проявлений поражения нервной
ткани. Клинико-зпидемиологаческие исследования не выявили
отдаленных неврологических или иных осложнений у привитых
экспериментальными ЖВКЭ.
5. Селекционирован новый штамм-кандидат для ЖВКЗ. Клон Л1 вируса
Лангат ТР-21 по остаточной нейровирулентности близок вакцинному
вирусу полиомиелита 3 типа, иммуногенен, стабилен,
высокорепродуктивен в культурах клеток.
Научная новизна и практическая значимость исследования
Выявлены особенности морфологических изменений в ЦНС обезьян
при заражении флавивирусами с разной по клиническим данным
степенью нейровирулентности. Показано, что хотя, в среднем, при
экспериментальных флавивирусных энцефалитах в выраженности
некробиотических изменений нейронов, глиоза и воспалительной
реакции существует прямая взаимосвязь, при инфицировании обезьян
некоторыми вирусами или при использовании определенных доз
вирусов возможна диссоциация этих процессов. На основании этих
данных усовершенствовано использование морфологических
показателей для сравнительной лабораторной оценки потенциальной нейровирулентности флавивирусов.
Впервые проведено комплексное сравнительное изучение биологических свойств in vitro и in vivo, включая нейровирулентность для обезьян, нескольких вариантов вируса Лангат ТР-21. Установлено,
что ослабленные варианты этого вируса гетерогенны по остаточной кейровирулентности для обезьян. Доказано, что из штамма ТР-21 могут быть выделены иммуногенные стабильные клоны с меньшим уровнем потенциальной нейровирулентности,. чем у штамма Еланцев 15-20/3, близкие по показателям морфологического контроля вакцинному вирусу полиомиелита 3 типа. Показано, что популяция аттенуированных клонов вируса Лангат ТР-21 гетерогенна и по другим биологическим свойствам: репродукции в культурах клеток при 37 и 40С, патогенности для мышей при эктраневрзльном заражении, иммуногенности на мышах. Однако эти свойства не имеют определенной связи с нейровирулентностьго для обезьян и не могут быть существенно полезны при отборе штаммов-кандидатов для ЖВКЭ.
Показано, что чувствительность обезьян к ослабленным клокам вируса Лангат ТР-21 зависит от их физиологического состояния: неадаптированные к лабораторному содержанию животные, перенесшие транспортировку и резкую смену условий содержания непосредственно перед опытом, гораздо тяжелее переносили заражение, чем адаптированные. На таких животных различия в нейровирулентности ослабленных клонов проявлялись значительно сильнее, чем на содержавшихся в лаборатории до опыта не менее 1,5 месяцев.
Получены новые данные, опровергающие опасения отдаленных неврологических последствий при использовании ослабленных клонов вируса Лангат ТР-21 в качестве ЖВКЭ. Вирусологически и морфологически доказано, что ослабленные клоны вируса Лангат ТР-21 не вызывают у обезьян (наиболее близкой человеху биологической модели) персистентной инфекции ЦНС. Установлено, что и в столь отдаленные временные интервалы, как 16-19 лет, среди привитых штаммом Еланцев 15-20/3 не было случаев хронических нейроинфекций и не выявлялись какие-либо иные вредные последствия этих прививок. Впервые исследованы данные о состоянии
здоровья в последующие годы ( от 1 до 29 лет), пациентов психиатрических клиник, привитых штаммами ТР-21-А и ТК-9/2 у которых осложнения после прививок могли быть спровоцированы патологией ЦНС, свойственной основному заболеванию. Среди зтих лиц впоследствии тоже не были зарегистрированы случаи хронических нейроинфекций.
Доказана перспективность продолжения исследований по разработке ЖВКЭ на основе вируса Лангат ТР-21. Селекционирован ослабленный клон (Л1) не вызывающий у обезьян заболевания при введении в головной мозг в дозах до 8,5 Ід ЛД50, стабильный по патогенное при пассировании в культуре клеток КФ (селекционирующей патогенные клоны), имиуногенный на мышах и обезьянах, близкий вакцинному вирусу полиомиелита 3 типа по уровню остаточной нейровирулентности в тесте интрацеребрального заражения обезьян ( положительное решение на выдачу патента на штамм-кандидат для ЖВКЭ).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях НИИЭМ ИМ.Пастера, Санкт-Петербург, 1983,1984, 1986, , 1987, 1990,1993,1995, 1996 гг., на конференции "Биология вируса КЭ", НИИБХ СО АМН СССР, Новосибирск, 1987, на конференции "Клещевой энцефалит" Медицинского Управления СО АН СССР, Новосибирск, 1989, на заседании Проблемной комиссии "Природноочаговые заболевания" (37.05) Научного совета по медицинским проблемам Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера АМН СССР, Иркутск, 1989, на Всесоюзном симпозиуме "Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита", г. Иркутск, 1990 г., на International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and Aids, Leningrad, 1991, на юбилейных научных конференциях Омского НИИПИ (Омск, 1991) и Томского-НИИВС (Томск.1991), на заседании Президиума СО АН СССР, Новосибирск, 1990, на специальном совместном заседании Проблемной комиссии "Клещевой и другие вирусные энцефалиты" и
Ученого Совета МП и ВЭ РАМН, Москва, 1993, на Международном симпозиуме "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями, Санкт-Петербург, 1995 г.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 28страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, который включает 167 отечественных и оМ зарубежных источников. Текст иллюстрирован 42 таблицами и 22 рисунками.