Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I Обзор литературы 11
ГЛАВА 1. Хантавирусы 12
1.1 Общие сведения 12
1.2 Морфология и молекулярная биология хантавирусов 13
1.3 Антигенные и генетические взаимоотношения 18
1.4 Специфическая лабораторная диагностика 20
1.5 Применение клеточных культур в хантавирусологии 24
ЧАСТЫ1 Собственные исследования 29
Глава 2. Материалы и методы исследований 29
2.1 Клеточные культуры 29
2.2 Вирусы 30
2.3 Иммунные сыворотки и моноклональные антитела 31
2.4 Непрямой метод иммунофлюоресценции (МФА) 31
2.5 Методы иммуноферментного анализа (ИФА) 32
2.6 Метод индикации фокусобразующихединиц (МФОЕ) 33
2.7 Реакция нейтрализации в культуре клеток (РН) 34
2.8 Изоляция хантавирусных штаммов 35
2.9 Индикация микоплазм в культуре клеток методом ПЦР 36
2.10 Санация клеточных культур ПТ-1 и 4647 от микоплазменной контаминации 36
2.11 ОТ-ПЦР 37
2.12 Методы электронной микроскопии 38
2.13 Статистические методы 40
ГЛАВА 3. Репликация патогенных хантавирусов в клеточных линиях различного происхождения 41
3.1 Сравнительная оценка эффективности методов индикации размножения 41
3.2 Адаптация хантавирусов к размножению в клеточных культурах различного происхождения 44
3.3 Динамика размножения хантавирусов в клетках наиболее пермиссивных клеточных культур 53
3.3.1 Определение оптимальной множественности заражения 54
3.3.2 Влияние различных условий на динамику накопления вируса Пуумала в КЖ 58
3.3.3 Анализ динамики размножения вируса Пуумала в течение длительного периода времени в культуре клеток VERO 62
3.3.4 Характеристика ФОЕ патогенных хантавирусов в культурах VERO и Vero Е6 64
ГЛАВА 4. Изоляция и идентификация штаммов хантавирусов 67
4.1 Изолирование хантавирусов в культуре клеток 67
4.2 Иммунологическая дифференциация штаммов хантавирусов (МФА, РН) 70
ГЛАВА 5. Морфологическая характеристика хантавирусов 74
Обсуждение 80
Заключение 90
Выводы 91
Список цитируемой литературы
- Морфология и молекулярная биология хантавирусов
- Непрямой метод иммунофлюоресценции (МФА)
- Определение оптимальной множественности заражения
- Иммунологическая дифференциация штаммов хантавирусов (МФА, РН)
Морфология и молекулярная биология хантавирусов
Хантавирусы в составе рода Hantavirus входят в семейство Bunyaviridae - одно из наиболее крупных семейств, включающих более 300 известных вирусов животных и растений, объединенных в 5 родов: Bunyavirus, Phlebovirus, Uukuvirus, Nairovirus и Hantavirus. Представители первых 4 родов являются типичными арбовирусами. Для хантавирусов какой-либо переносчик достоверно не установлен.
К настоящему времени Международным комитетом по таксономии вирусов (ICTV-2012) зарегистрировано в составе рода Hantavirus 23 вируса, однако количество серологически и генетически различающихся друг от друга хантавирусов значительно превышает это число. К ним относятся не только патогенные для человека хантавирусы, но и вирусы с неустановленной к настоящему времени эпидемиологической значимостью. По распространению они подразделяются на вирусы Старого Света (Хантаан, Пуумала, Сеул, Добрава/Белград, Тула, Хабаровск, Топографов, Таиланд, Тоттапалиам) и Нового Света (Андес, Байо, Блэк Крик Кэнал, Кано Делгадито, Ель Моро Каньон, Исла Виста, Лагуна Негра, Мулешу, Нью Йорк, Проспект Хил, Рио Маморе, Рио Секундо, Син Нобре).
Хантавирусные инфекции человека на евроазиатском континенте объединены под единым названием геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС). В структуре заболеваемости ГЛПС доказана этиологическая роль четырех хантавирусов: вирус Пуумала и три подтипа вируса Добрава/Белград в европейской части России и странах Европы; вирусы Хантаан и его подтип Амур и вирус Сеул - в российских регионах Дальнего Востока и странах Азии. На американском континенте хантавирусные инфекции объединены под названием хантавирусный пульмональный синдром (ХПС) и вызываются, в основном, вирусами Син Номбре и Андес в Северной и Южной Америке соответственно [1]. 1.2 Морфология и молекулярная биология хантавирусов
Вирионы хантавирусов имеют округлую форму с размером в диаметре от 90 до 130 нм. Липидосодержащая оболочка имеет выступы, сформированные вирионными гликопротеинами, вирусные частицы морфологически однородны [2,3,4,5].
Плавучие плотности вирусных частиц в растворах сахарозы и хлорида цезия составляют 1,16-1,17 г/мл и 1,20-1,21 г/мл, соответственно. Хантавирусы стабильны лишь в нейтральной среде при значениях рН не ниже 5 и не выше 8, инактивируются растворителями липидов и термообработкой при температуре 50 С [6]. Геном вирусов представляет собой сегментированную одноцепочечную негативную РНК. Три сегмента генома - большой (L), средний (М) и малый (S) - кодируют вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу RdRp, поверхностные гликопротеины Gn и Gc и нуклеокапсидный белок N, соответственно [7,8,9]. Каждый из геномных сегментов имеет единственную функционирующую открытую рамку считывания.
Вирусные белки -RdRp, Gn, Gc и N - имеют молекулярные массы 200, 72, 56 и 45 КД соответственно. Все три сегмента хантавирусной РНК имеют на 3 -концах одну и ту же характерную короткую последовательность 3 -AUCAUCAUCUG-... -5 , отличающую их от других буньявирусов.
Вирион проникает в клетку, прикрепляясь к ее поверхности участками одного или обоих наружных белков: Gn, Gc, с последующим эндоцитозом. Для проникновения в клетку патогенные и непатогенные хантавирусы используют различные рецепторы, ЬЗ и Ы интегрины соответственно [10,11,12]. После интернализации вирусы оказываются в составе первичной эндосомы. Далее происходит ее слияние с первичной лизосомой с образованием вторичной эндосомы, что приводит к резкому закисленню рН среды, окружающей вирусную частицу [13]. Предполагается, что для проникновения вируса в клетку необходимым условием является закисление эндосом, что приводит к изменению конформации Gn:Gc гетеродимеров и способствует слиянию клеточной и вирусной мембран [14]. Инициация транскрипции у хантавирусов, предположительно, происходит также, как у вируса гриппа [15], а именно: эндонуклеаза, входящая в состав полимеразного комплекса вириона, расщепляет мРНК зараженной клетки с образованием кэпированных фрагментов, действующих впоследствии в
качестве праймеров - затравок. Полученные праймеры гетерогенны по нуклеотидным последовательностям и имеют длину 10-18 нуклеотидов. Эти неспецифические последовательности были обнаружены на 5 -концах РНК разных буньявирусов, включая хантавирусы [16].
Геномные РНК-сегменты образуют комплексы с N-белком, формируя L-, М- и S-нуклеокапсиды. Предшественник поверхностных гликопротеинов, кодирующийся РНК М-сегмента, расщепляется в процессе синтеза белка (котрансляционно) на гликопротеины Gn и Gc, путем воздействия клеточной сигнальной пептидазы на консервативный аминокислотный мотив WAASA[17]. Было показано [18] и позже подтверждено [19], что ни Gn, ни Gc не могут покинуть эндоплазматический ретикулум при условии, что они транслированы независимо друг от друга. Есть и другие данные [20], свидетельствующие, что поверхностные гликопротеины, экспрессированные поодиночке, транспортируются в различные клеточные компартменты: GN - в комплекс Голь лжи, a Gc - в эндоплазматический ретикулум. Оба исследования, однако, сходятся в том, что формирование функционального гликопротеинового комплекса возможно только в комплексе Гольджи, куда GN и Gc транспортируются только в случае их последовательной трансляции с одного мРНК предшественника. После гликозилирования вирусные частицы созревают - почкуясь через мембрану комплекса Гольджи и образуя везикулы, которые транспортируются к плазматической мембране с последующим выходом вирионов путем слияния клеточной и везикулярных мембран [21].
Непрямой метод иммунофлюоресценции (МФА)
VERO- (АТСС CCL-81) перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки. Получена из ВОЗ (WHO VERO cellbank from ЕСАСС, Accession number 991042). Vero E6 - ( ATCC No. CRL-1586) клон VeroC1008 культуры VERO, отличается определенной степенью контактной ингибиции роста. Получена из Каролинского Института, Швеция, на 108 пассаже. Клетки VERO и Vero Е6 не секретируют альфа-интерферон в ответ на заражение вирусами, однако имеют рецепторы альфа и бета интерферонов [79]. Культуры клеток 4647, 455, 4184 и ПТ-1 были получены и охарактеризованы Л.Л.Мироновой с сотрудниками в ФГБНУ ИПВЭ им.М.П.Чумакова. 4647- линия гетероплоидных клеток почки взрослой зелёной мартышки, получена на 73 пассаже. При обследовании клеток на разных уровнях пассажей (с 35 по 218) вирусы-контаминанты, а также онкогенные агенты выявлены не были [80]. Для пассажей использовалась среда Игла MEM с 5% сыворотки новорожденного теленка, кратность рассева 1:3; 1:5. 455 - линия перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки, получена на 56 пассаже. При обследовании клеток на разных уровнях пассажей вирусы-контаминанты, а также онкогенные агенты выявлены не были[81]. Для пассажей использовалась среда Игла MEM с 5% сыворотки новорожденного теленка, кратность рассева 1:3; 1:6. 4184 - линия перевиваемых клеток почки эмбриона овцы, получена на 81 пассаже. При обследовании клеток на разных уровнях пассажей вирусы-контаминанты, а также онкогенные агенты выявлены не были [82]. Для пассажей использовалась среда Игла MEM с 5% сыворотки новорожденного теленка, кратность рассева 1:3; 1:8. ПТ-1 - перевиваемая культура клеток почки теленка, получена на 75 пассаже. На уровне 65 пассажа установлена гетероплоидность клеток ПТ-1 [83]. При обследовании клеток на уровне пассажей 9 и 81 вирусы-контаминанты, а также онкогенные агенты выявлены не были [84]. Для пассажей использовалась среда Игла MEM с 7% сыворотки новорожденного теленка, кратность рассева 1:3; 1:4. 2.2 Вирусы
В работе использованы вирусы из коллекции лаборатории геморрагических лихорадок, изолированные и поддерживаемые в пассажах в культуре Vero Е6: ПУУ, штаммы К27/ Уфа-85, ТКД/Уфа-97; Добрава/Куркино, штаммы EAT/ Липецк-07, Добрава/Сочи, штамм Ар 1584/Сочи-01; ХТН, штамм Р-88/ Хабаровск-89; СЕУ, штамм SR-11. 2.3 Иммунные сыворотки и моноклональные антитела
Сыворотки крови больных и реконвалесцентов ГЛПС, а также моноклональные антитела из коллекции лаборатории геморрагических лихорадок. Иммунные сыворотки крови лабораторных животных любезно предоставлены доктором H.W.Lee и доктором Во Niklasson.
Непрямой метод иммунофлюоресценции (МФА) Антитела в сыворотках крови мышевидных грызунов выявляли, используя культуральные антигены вирусов ПУУ, ДОБ, ХТН, СЕУ и антивидовые антитела (кроличьи IgG против мышиных IgG+IgM), меченных ФИТЦ.
Хантавирусные антигены в инфицированных клетках выявляли непрямым МФА. Для приготовления антигенных препаратов суспензии инфицированных клеток (450-550 тыс. кл/мл) вносили по 5 мкл в лунки предметных стёкол с тефлоновым покрытием. После высушивания стёкла помещали на 20 мин в охлажденный ацетон для фиксации клеток и затем высушивали при комнатной температуре. На антигенные препараты наносили соответственно референс анти-ПУУ или анти-ДОБ сыворотки крови реконвалесцентов после ГЛПС в разведениях, начиная с 1:64 и заканчивая разведением, соответствующим титру сыворотки, а также нормальную сыворотку, не содержащую антител к хантавирусам, в разведениях с 1:16 до 1:64. Препараты помещали во влажную камеру и инкубировали при 37±1 С в течение 30 мин (или при 6±2 С в течение 18
час). После окончания экспозиции препараты 3-кратно отмывали физиологическим раствором (0,85% NaCl), промывали дистиллированной водой, высушивали и наносили на антиген антивидовые антитела, меченные ФИТЦ. Препараты помещали во влажную камеру и инкубировали при 37 ±1 С в течение 30 мин, после чего их промывали 3-х кратно физиологическим раствором, 1-кратно дистиллированной водой, высушивали и исследовали с помощью люминесцентного микроскопа, используя водно-иммерсионный объектив х 65. Зараженные клетки, содержащие антиген (зернистое свечение в цитоплазме) определяли, в пяти случайных полях зрения. Результат выражали как процент заражённых клеток.
Для определения антигенов хантавирусов использовали тест-систему «Хантагност» производства ФГУП «ПИПВЭ им. М.П.Чумакова» согласно инструкции производителя. Для детекции антигенов в клеточных культурах был использован также метод ИФА на основе моноклональных антител -«XAHTA-N» [85]. Основу этого метода составляют моноклональные антитела (мАТ), полученные к культуральному, очищенному гельфильтрацией, инактивированному формалином, вирусу. Схема теста: сенсибилизация твердой фазы мАТ - исследуемый антигенный образец - меченные пероксидазой хрена мАТ.
В лунки нечетных рядов панели («Costar» №9018) вносили по 100 мкл IgG (мАТ ДОБ, клон F1, или мАТ ПУУ, клон D4) в концентрации 1 -3 мкг/мл, в четные ряды - мышиные IgG, не имеющие специфичности по отношению к хантавирусам. Через 18 часов контакта при 4 С вносили по 100 мкл 2 % БСА и через 1 час контакта при комнатной температуре лунки промывали. Далее вносили исследуемый образец в 2- кратных разведениях в ИФА-буфере (PBS + 0,1 % БСА + 0,01 % Твин-20) по 50 мкл/лунку и через 18 часов контакта при 4 С панель промывали и вносили по 50 мкл/лунку IgG (ДОБ, клон А4), меченые пероксидазой хрена. Через 1 час контакта при 37 С панель промывали, вносили субстрат-индикаторную смесь (ТМБ) по 100 мкл и выдерживали при комнатной температуре в течение 15-20 мин. После остановки реакции 2М серной кислотой фотометрировали лунки при длине волны 450 нм (на приборе «Multiskan»). Положительной считали пробу, для которой отношение оптической плотности в лунке со специфическим иммуноглобулином превышало показатель оптической плотности в лунке с нормальным иммуноглобулином в 2,1 (индекс P/N).
Определение оптимальной множественности заражения
Еще более низкий уровень размножения вирусов Пуумала и Добрава/Белград отмечен в культуре клеток селезенки взрослой зеленой мартышки - 455. Максимальная зараженность клеток как вирусом Пуумала, так и Добрава/Белград не превысила 60 %, а титр вируса не достигал 4 lg ФОЕ/мл через 8 пассажей в этой культуре. Следует отметить, что на первом пассаже обоих вирусов зараженными были лишь единичные клетки, тогда как в культуре 4647 уже на первом пассаже зараженность клеток составляла около 70 %. На втором пассаже вирусов Пуумала и Добрава/Белград в культуре 455 антиген содержащими были около 40 - 50 % клеток, однако интенсивность свечения была слабой, что указывает на низкий уровень репликации вирусспецифических белков; вирус в культуральной жидкости не определялся. После заражения монослоя культуры 455 лизатом клеток с 40 % содержанием антигена вируса Пуумала (4 пас), зараженность клеток составила на 11 сутки только 10 %, однако уже в следующем пассаже этих клеток антиген содержащими были 60 % с выходом вируса в КЖ с титром 2,3 lg ФОЕ/мл. В дальнейшем, на 7 и 8 пассажах зараженность клеток не превысила 60 %, а титр внеклеточного вируса - 3,2 lg ФОЕ/мл. Динамика накопления вируса Добрава/Белград в культуре 455 характеризовалась колебанием количества антиген содержащих клеток со 2-го по 8-й пассажи между 40 - 60 %, при этом инфекционный вирус в КЖ определялся на последних двух пассажах с максимальным титром 3,6 lg ФОЕ/мл.
В культуре клеток почки эмбриона овцы, 4184, оба хантавируса размножались слабо на протяжении 8 последовательных пассажей как инфицированной культуры, так и при заражении монослоя лизатом инфицированных клеток. Количество клеток, инфицированных вирусом Пуумала, не превышало 20 %, вирусом Добрава/Белград - 40 % со слабой интенсивностью свечения антигена; инфекционный вирус в КЖ оставался на не определяемом уровне.
В культуре клеток почки теленка, ПТ-1, максимальная зараженность вирусом Пуумала составила 45 %, титр вируса в КЖ - около 2 lg ФОЕ/мл; максимальная зараженность вирусом Добрава/Белград составила 75 %, титр вируса в КЖ - 2,3 lg ФОЕ/мл. В отличие от культуры 455 и особенно 4184, в клетках ПТ-1, инфицированных как вирусом Пуумала, так и Добрава/Белград (оба генотипа), антиген интенсивно накапливался, что выражалось ярким гранулярным свечением в цитоплазме при исследовании МФА с гомологичными сыворотками. Способность культуры ПТ-1 интенсивно накапливать внутриклеточный антиген была использована для приготовления антигенных слайдов для МФА. Эти антигенные препараты были применены для выявления анти-хантавирусных флюоресцирующих антител в сыворотках крови мышей при контроле специфической иммуногенной активности вакцинных препаратов. Использование клеток не обезьяньего происхождения в качестве антигенного субстрата позволяет избежать неспецифические реакции, обусловленные иммунным ответом на возможное присутствие в вакцинном препарате белков цитоскелета (клетки VERO, как субстрат вирусного материала).
Таким образом, впервые установлена возможность адаптации патогенных хантавирусов Пуумала и Добрава/Белград, изолированных в культуре клеток Vero Е6, к размножению в перевиваемых клетках почки овцы и почки теленка.
Показано, что после 3-4 последовательных пассажей в культуре VERO размножение вирусов Пуумала и Добрава/Белград поддерживается на уровне пермиссивной клеточной культуры Vero Е6.
Выявлена большая консервативность вируса Пуумала в сравнении с вирусом Добрава/Белград при адаптации к размножению в клеточных культурах, отличных по происхождению от Vero Е6, в которой эти вирусы были изолированы.
Динамика размножения хантавирусов в клетках наиболее пермиссивных клеточных культур Основой успешности изготовления цельновирионной убитой вакцины является получение высокоактивного вирусного субстрата - задача особенно сложная применительно к хантавирусам. Для её решения были проведены исследования, направленные на выяснение оптимальных условии получения максимального урожая вирусов ПУУ, ХТН, СЕУ, ДОБ.
Определение оптимальной множественности заражения Множественность заражения (МЗ) является одним из факторов, влияющим на накопление вируса. На рисунках 6, 7, 8, 9 показана динамика накопления вирусов ПУУ, ДОБ, ХТН и СЕО в КЖ. В этих экспериментах на монослой культуры, выращенной віл роллерах вносили по 20 мл КЖ с различным содержанием вируса. Через 1 ч контакта инокулят сливали и вносили среду поддержки. После 4 суток ежедневно делали полную смену среды (с понедельника до пятницы) и также далее с понедельника до пятницы (4-15 сутки).
Иммунологическая дифференциация штаммов хантавирусов (МФА, РН)
Несомненно позитивный результат - это успешная адаптация вирусов Пуумала, Добрава/Белград, Хантаан и Сеул к размножению в клетках VERO: после 3-4 пассажей культура поддерживала размножение хантавирусов Пуумала и Добрава/Белград на уровне пермиссивной клеточной культуры Vero Е6. На модели вирусов ПУУ, ДОБ, ХТН и СЕУ были определены оптимальные условия, способствующие накоплению максимального вирусного урожая. Было установлено, что оптимальная МЗ, обеспечивающая стабильный урожай вируса на уровне 5,2 lg ФОЕ/мл на протяжении 6-7 суток при ежедневном сборе КЖ находится в диапазоне от 0,01 до 1 lg ФОЕ/мл. Большая или меньшая МЗ не позволяла добиться более высоких пиковых показателей накопления вируса в КЖ. Верхний предел размножения для вируса Пуумала составил 6,2 lg ФОЕ/мл; Добрава/Белград и Сеул - 6,5 lg ФОЕ/мл, вируса Хантаан - 7,2 lg ФОЕ/мл. Можно предположить, что размножение хантавирусов ограничено скоростью репликации вируса. С другой стороны, принимая во внимание стратегию вируса на сохранение клетки, ограничение может зависеть от возможности клеток обеспечить соответствующую скорость синтеза компонентов сборки вируса (РНК, белков) и созревания (отпачковывания) вирионов на клеточных мембранах, сохраняя жизнеспособность самой клетки. Вероятно, некое равновесие, достигаемое между этими процессами, стабилизирует хроническую инфекцию клеток хантвирусами. Об этом свидетельствует проведенный нами эксперимент длительного, в течение 57 суток, наблюдения за размножением вируса Пуумала в культуре Vero Е6: через 12 суток после заражения накопление вируса в среде снижалось и сохранялось до конца эксперимента в диапазоне 3,5 - 4,3 lg ФОЕ/мл. Процент зараженных клеток (98 ±2%), оставался неизменным на протяжении всего эксперимента и внешний вид культуры не отличался от контрольной. В общих чертах динамика вируса и антигена в хронически зараженной культуре повторяет динамику антигена в легких основного хозяина - рыжей полевки: в эксперименте у зараженных вирусом Пуумала полевок персистирование антигена регистрировалось на протяжении 14 месяцев (период наблюдения) [99].
В серии опытов было показано, что накопление внеклеточного вируса не зависит от таких факторов, как: способ заражения - на монослой или во взвесь клеток; увеличение продолжительности контакта с вирусом свыше 1 часа при 37 С; использования инокулята в виде культуральной жидкости или в виде клеточного лизата. Важным результатом при подборе оптимальных условий сбора вирусного урожая явилась возможность использования бессывороточных сред в качестве среды поддержки. Было показано, что хантавирусы одинаково размножаются как в присутствии в среде поддержки 1-2 % сыворотки теленка или 0,25 % человеческого сывороточного альбумина, так и в отсутствии белковых компонентов среды. Обстоятельство не только удешевляющее производство вирусного вакцинного субстрата, но облегчающее последующие этапы очистки вируса от балластных белков.
Следует отметить, что приступая к исследованиям по изучению особенностей размножения хантавирусов в клеточных культурах, нами была установлена эффективность различных методов их индикации в культуре. Было показано, что наиболее чувствительным методом выявления хантавирусов в клеточных культурах является индикация внутриклеточного антигена методом непрямой иммунофлюоресценпии и индикация вируса по ФОЕ. Это заключение позволило не только рационально спланировать основные эксперименты, но также явилось основанием для разработки методов определения остаточной инфекпионности (безопасности) вакцинных препаратов. Для сравнения: РНК вируса Пуумала выявляется в клетках методом ОТ-ПЦР при наличии инфекционного вируса в титре 3,0 lg ФОЕ/мл, а в КЖ 3,5 lg ФОЕ/мл. Иммуноферментным методом хантавирусный антиген в КЖ определялся в 90% проб при титре вируса 3,1-4,0 lg ФОЕ/мл. В то же время размножение хантавирусов можно достоверно регистрировать МФА по накоплению внутриклеточного антигена, когда другими методами наличие вируса еще не определяется.
Изоляция вируса была предпринята от 64 грызунов, отобранных по результатам иммунологического скрининга (МФА, ИФА) более чем 800 мелких млекопитающих, собранных на эндемичных по ГЛПС территориях юга Краснодарского края и в Тамбовской области. От 40 грызунов вирус выделяли параллельно в культурах 4647 и ПТ-1. Наши эксперименты показали, что наиболее пригодной для изоляции хантавирусов от природных носителей остается культура Vera Е6. Только в этой культуре удалось изолировать 3 штамма, предварительно идентифицированные как вирус Добрава/Белград по результатам МФА. В результате иммунологической идентификации в РН 2 штамма, выделенные от полевых мышей в Тамбовской области, были идентифицированы как генотип ДОБ/Куркино. Штамм, изолированный от кавказской лесой мыши, идентифицирован как генотип ДОБ/Сочи. Эффективность выделения вируса составила: от кавказской лесной мыши - 8,3 % (1 из 12); от полевой мыши - 10,5 % (2 из 19). На территории Тамбовской области это первое выделение вируса, циркуляция которого ранее была установлена по результатам иммунотипирования сывороток крови полевых мышей и больных ГЛПС [100]. Вновь изолированные штаммы не отличались иммунологически от ранее выделенных (более 10 лет назад) штаммов вирусов ДОБ/Куркино (Тульская, Липецкая области) и ДОБ/Сочи по форме и размеру инфекционных фокусов в культурах VERO и Vero Е6. Это наблюдение, как и отличия фокусов, образуемых вирусами СЕУ (крупные), ХТН (средние) и ПУУ (мелкие) в тех же культурах, позволяет предположить, что этот признак является одной из фенотипических характеристик хантавирусов. Похожие данные были получены McCaughey [77] в искусственно созданных условиях закислення среды до рН 6,2. На 7 сутки инкубации в этих условиях наблюдалось ЦПД в виде синцития, при этом вид его, от очень больших очагов (вирус СЕУ) до средних (вирус ХТН) и очень маленьких (вирус ПУУ) отражал таксономические различия хантавирусов [77].