Введение к работе
Актуальность проблемы
Заболеваемость Гриппом относится к одной из важнейших проблем медицинской науки и здравоохранения, т.к. грипп является массовой и неуправляемой инфекцией, ежегодно регистрируемой в различных частях земного шара. Несмотря на огромные усилия, предпринимаемые отечественными и зарубежными учеными, проблема гриппа еще далека от своего решения (Жданов и др., 1978, Киселев, 1997, Lamb, 1989, Lvovet al.,1993, Сох et al.,1995, Hay, 1997a).
Основная причина этого связана с естественной изменчивостью возбудителя, которая выражается в вариабельности первичных структур и соответственно свойств вирионных белков. К настоящему времени антигенный дрейф выявлен у вирусов гриппа А и В. Возникающие новые варианты преодолевают иммунитет населения, быстро распространяются, вызывая вспышки заболевания и эпидемии. В случаях появления совершенно нового вируса гриппа типа А человечество вовлекалось в пандемию гриппа А. Во время "обычной"эпидемии заболевает около 10% населения, при пандемии -80-100%.
Основными направлениями борьбы с гриппом являются надзор за распространением инфекции, своевременная диагностика возбудителя и профилактика заболевания.
Россия и страны СНГ, входившие в состав СССР, занимают огромную территорию Евразии. Соседство со странами Юго-Восточной Азии, где впервые выделено большинство эпидемических и пандемических штаммов (Sholtissek et al.,1987, Webster et al.,1992), обусловливает быстрое проникновение и распространение новых вирусов на территории нашей страны, а затем и в мире. Поэтому изучение циркуляции вирусов гриппа в таком регионе земного шара, каким является Россия и страны ближнего зарубежья, имеет большое значение для медицинской науки и практики. Надзор за распространением гриппа в нашей стране уже более 30 лет проводится в НИИ вирусологии РАМН, который сотрудничает по
гриппу с ВОЗ. Для успешного проведения этой работы используются отечественные штаммы из Государственной коллекции вирусов, Центра экологии и эпидемиологии гриппа, а также эталонные штаммы, рекомендованные и присланные из Центров ВОЗ по гриппу.
Углубленное изучение эпидемических штаммов вирусов гриппа позволяет определить основные тенденции изменчивости вирусов гриппа А и В, эволюционные связи между вирусами гриппа, циркулировавшими и возникающими вновь в различных регионах земного шара. Результаты исследования не только расширяют наши теоретические знания об РНК-содержащих вирусах, но также имеют большое практическое значение как для расшифровки текущих, так и для прогнозирования грядущих эпидемий и пандемий.
Данные об эпидемически актуальных штаммах необходимы для проведения профилактических мероприятий (вакцинопрофилактики, создания противогриппозных вакцин, разработки специфических диагностических тест-систем). Успех вакцинопрофилактики зависит от многих факторов, в том числе от сходства антигенных детерминант вакцинных и эпидемических штаммов, иммуногенности вакцинных штаммов. Представляет определенный интерес исследование возможного влияния на изменчивость вирусов иммунитета, возникающего у привитых после вакцинопрофилактики с помощью живых и инактивированных гриппозных вакцин.
Особую роль в проблеме гриппа играет разработка новых методов диагностики вирусных инфекций. К началу наших исследований было известно ограниченное число тест-систем, используемых в иммунологических методах (РИА и ИФА). Были выявлены как достоинства, так и недостатки. Это побудило нас обратится к поиску и разработке новых диагностических систем. Нами впервые были использованы модификации флуоресцентных методов анализа для создания более совершенных и чувствительных методов индикации вирусов гриппа в биопробах.
Цели и задачи работы
Целью настоящей работы являлся этиологический надзор над распространением вирусов гриппа А и В в России и сопредельных государствах на протяжении 12 лег (1986-98) с последующим изучением молекулярно-биологических основ изменчивости вирусов гриппа и возможного влияния на нее поствакцинального иммунитета.
В соответствии с поставленной целью в задачи исследований входило
-определение этиологии эпидемий и подъемов заболеваемости гриппом и ОРВИ на территории России и сопредельных государств (СНГ, Чехия, Словакия);
-изучение вирусных популяций: сравнительный анализ антигенных, молекулярно-биологических свойств эпидемических штаммов вирусов гриппа А, В, изолированных в России со свойствами полипептидов референс штаммов,
-исследование свойств вирусов, изолированных из локальных вспышек и от спорадических случаев заболевания, не получивших широкого распространения;
-изучение влияния поствакциналъного иммунитета, возникшего после прививок живой или инактивированной вакциной на свойства эпидемических штаммов вируса гриппа;
-отбор наиболее активных изолятов для последующего детального изучения антигенной структуры их полипептидов и генома;
-создание вирусной коллекции из наиболее актуатьньгх эпидемических штаммов, циркулировавших в России в последние 12 лет и эталонных штаммов, рекомендованных ВОЗ;
-разработка и адаптация методов и лабораторных тест-систем для индикации и исследования вирусов гриппа в различных материалах.
Разрабатываемая тема включена в планы научно-исследовательских работ НИИ вирусологии им .Д.И.Ивановского Российской АМН, комплексную программу борьбы с гриппом, программы работ по проблеме "Грипп, гршшоподобные заболевания, их профилактика и лечение" Российской АМН и международного сотрудничества стран СЭВ по проблеме N4 "Грипп", в программу сотрудничества ВОЗ.
Работа была поддержана Международным научным фондом грант МА ЗООО.МА 3300; Российским фондом фундаментальных исследований грант N 93-04-7343 . Положения, выносимые на защиту
1. На основании анализа вирусов гриппа, вызвавших в России и странах СНГ за
последние 12 лет эпидемические подъемы заболеваемости гриппом и ОРВИ,
установлена активная циркуляция вирусов гриппа А и В, с периодами одновременной
циркуляции вирусов с различной антигенной формулой. Вьивлено антигенное
родство вирусов гриппа A (H1N1),A(H3N2) и В, изолированных в России со
штаммами, циркулирующими в Евразии, особенно в государствах Азиатско-
Тихоокеанского региона.
Антигенный дрейф поверхностных белков зарегистрирован у вирусов гршша А и В, однако характер эволюционного процесса имел свои особенности для вирусов гриппа -линейный для A/H1N1, A/H3N2 и мультиплетный для В.
2. Определена и изучена новая ветвь эволюции вирусов гриппа В,
циркулировавших в России с 1990г (В/Ямагата/16/88-подобные).
Идентифицированные впервые в России в эпидемический сезон 1990-1991гг., эти
вирусы доминировали в последующих эпидсезонах: 1992-93, 1995-96гг. заменив ранее
эпидемически активные штаммы подобные В/Виктория/2/87. Новые штаммы имели
существенные отличия в антигенных свойствах и первичной структуре
поверхностных белков от штаммов подобных В/Виктория/2/87. Определены
нуклеотидные и аминокислотные последовательности гемагглютининов вирусов
гриппа В- представителей обеих групп, выделенных в 1987-97 гг. Построена общая
картина эволюционных связей генов гемагглютининов вирусов гриппа В,
изолированных с 1983 по 1993г. в России, Америке и Евразии.
3. Установлено, что вирусные белки у циркулировавших в последнее 12-летие
штаммов A(H3N2) характеризовались вариабельностью у внутренних белков и
изменчивостью, носившей линейный характер у поверхностных полипептидов.
-Антигенный дрейф поверхностных, белков соответствовал дрейфу в белках эталонов, расположенных в следующей последовательности: А/Шанхай/11/89-А/Гуандонг/39/89-АЛ1екин/353/89-А/Пекин/32/92-А/Иогашіесбург/33/94-М1анчанг/933/95-А/Сидней/5/97.
-Впервые определены аминокислотные последовательности гемагтлютинина у некоторых эпидемических штаммов 1993,1997г. изоляции.
-Вьивлена вариабельность в структуре NP и М белков у вирусов, изолированных в разные эпидемические сезоны, и общие эпитопы NP вирусов гриппа человека и животных с помощью моноклональных антител методом ИФА, ТФ РИА.
4. Выявлена особенность эволюционного процесса у вирусов гриппа A/H1N1 за
последние 12 лет: после 5-летнего перерыва возврат в активную фазу в
эпидемическом сезоне 1995-96гг. Вирусы A(H1N1) сопиркулировали с вирусами
A(H3N2) и В, сохраняя ведущую роль в заболеваемости детей и молодых людей в
сезоне 1995-96.
-Антигенный дрейф гемагглютинина изолятов A/HlNl-(95-98) соответствовал дрейфу в НА эталонов А/Тайвань/1/86 -АУТехас/36/91-А/Иоганнесбург/82/96, подобный А/Байерн/95.
-Анализ антигенной активности НА и NP, проведенный с помощью моноклональных и поликлоналъных антител, показал гетерогенность вирусных популяций в одном эпидемическом сезоне.
5. Впервые при изучении иммуногенности гриппозных вакцин в широком
эпидемиологическом наблюдении была использована предложенная нами
модификация лектин-теста. Установлена высокая активность нейраминидазного
компонента у отечественных живой и инактивировашюй гриппозных вакцин.
Процент сероконверсий к нейраминидазе колебался в пределах 50% в зависимости от
вида вакцин -ЖГВ А,ИГВ А, ЖГВ В и практически совпадал с сероконверсией к
гемагглютинину.
-
Впервые показано, что для получения вирионных белков вирусов гриппа А, В и С, сохранивших высокую антигенную и иммуногенную активность, может быть использован электрофорез в агарозе. Предложенная модификация (введение предварительного этапа ферментативной обработки) позволяет получать внутренние белки (М и NP), сыворотки к которым специфичны, активны при изучении вирусов гриппа современными методами: радиоиммунным (ТФ РИА), иммуноферментным (ИФА) и иммунофлуоресцентным (ФИА).
-
Впервые для идентификации вируса гриппа в растворах были использованы новая флуоресцентная метка копропорфирин и высокоочшценные иммуноглобулины IgG, выделенные из антисьшороток к вирионным белкам с помощью каприловой кислоты. Чувствительность метода ФИА достигала 0,4 нг/мл вирусного белка. При использовании моноклональных антител к внутренним белкам в методе ФИА ВР максимальная чувствительность достигала 20 нг/мл вирусного белка.
Научная новизна
В результате изучения молекулярно-биологических свойств эпидемических штаммов вирусов гриппа, циркулировавших в России в последнее десятилетие, установлены основные направления современной эволюции вирусов гриппа.
Впервые на территории России выявлена новая ветвь эволюции вируса гриппа В -появление в России В/Ямагата/16/88-подобных штаммов, вызвавших эпидемии в 1990-91,1992-93, 1994- 1995 гг.
Определена структура гена гемагглютинина впервые изолированных в Ри зарегистрированных в последующих эпидемиях представителей вирусов гриппа В нового направления изменчивости. Штаммы депонированы в Государственную коллекцию вирусов и зарегистрированы 3aN 2278.
Выявлены особенности антигенного дрейфа вирусов гриппа А. Установлено, что изменчивость вирусов гриппа A/H3N2 продолжается в одном направлении, приводя к возникновению эпидемических подъемов гриппа в различных регионах страны.
Выявлен возврат в активную циркуляцию в 1995г. вирусов гриппа A/H1N1 после пятилетнего перерыва. В сравнении с вирусами A/H3N2 вирусы A/H1N1 характеризовались меньшей скоростью изменчивости и большими периодами затишья. Штаммы депонированы в Государственную коллекцию вирусов и зарегистрированы за N 2331.
В процессе надзора за распространением гриппа в стране от больных ОРВИ
изолированы парамиксовирусы ПМВ-2 антигенно родственные
А/Цыпленок/Юкейпа/56.
Впервые метод лектин-тест был использован для изучения структуры иммунного ответа у вакцинированных (в частности антител к нейраминидазе). Показана высокая корреляция в динамике выработки антител к гемагтлютинину и нейраминидазе при вакцинации ИГВ и ЖГВ вакцинами.
Впервые показано, что модифицированный нами метод электрофореза в агарозе может быть использован для получения чистых внутренних белков вирусов гриппа А, В и С, сохранивших антигенную и иммуногенную активность.
Впервые, для индикации вирусов гриппа методом ФИА в растворах предложена оригинальная система, в которой использовались иммуноглобулины IgG, выделенные с помощью каприловой кислоты из антисывороток к белкам вируса гриппа и меченные новой флуоресцентной меткой копропорфирином. Чувствительность метода достигала 0.4 нт/мл вирусного белка. Практическая ценность
Полученные данные по идентификации вирусов гриппа, циркулировавших на территории СССР, России и за рубежом, а также по определению основных направлений эволюции вирионных белков этих вирусов полезны в практическом плане при прогнозировании эпидемий и возможных пандемий. Отбор кандидатов в вакцинные штаммы основывался на характеристиках эпидемических штаммов.
Результаты анализа антигенной структуры и биологических свойств текущих штаммов вирусов гриппа включаются в информации, посылаемые в ВОЗ и органы
практического здравоохранения, Министерство здравоохранения РФ, областным, городским центрам Госсанэпиднадзора.
В рамках сотрудничества с ВОЗ в штаб-квартиру ВОЗ в Женеве и Всемирные справочные центры по гриппу в Лондоне (Англия) и Атланте (США) высылаются ежегодные отчеты и наиболее актуальные отечественные штаммы, которые затем входят в состав коллекций вирусов этих центров. В свою очередь, присылаемые из Центров ВОЗ эталонные штаммы после анализа включаются в Коллекцию вирусов Центра экологии и эпидемиологии гриппа и наряду с отечественными штаммами используются для определения этиологии эпидемий гриппа в России.
В Государственную коллекцию вирусов депонированы 5 оригинальных штаммов, определивших новые этапы в распространении и изменчивости вирусов гриппа (регистрационные N 2016,2017,2132,2133,2278).
Коллекция вирусов Центра экологии и эпидемиологии гриппа пополнилась штаммами (около 350), наиболее характерными для вирусных популяций ежегодных эпидемий гриппа (в течение 12 лет).
Вирусы могут быть использованы в качестве кандидатов в вакцинные штаммы, а также для приготовления диагностикумов.
Практический результат диссертационной работы заключается также в усовершенствовании методов получения очшцешгых вирионных белков вирусов гриппа А, В, С, сохранивших антигенные и иммуногенные свойства, для последующего получения к ним иммунных сывороток. Полученные сыворотки используются для индикации и изучения свойств наружных и внутренних белков вирусов гриппа А, В и С (методические рекомендации были утверждены на Ученом Совете НИИ вирусологии и описаны в научных публикациях). Предлагаемая нами методика выделения иммуноглобулинов IgG из этих сывороток и меченных новой меткой копропорфирином может быть использована для индикации вирусов гриппа в флуоресцентном иммунном анализе.
Публикация работ
Основные положения диссертации отражены в 32 статьях, 8 тезисах докладов на международных и союзных конгрессах, съездах и конференциях, а также в методических рекомендациях. Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на 5 Республиканском съезде эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов и гигиенистов ЭССР (Таллин, 1987), 6 Всесоюзном съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991), Международной конференции "Выбор средств борьбы с гриппом П"(Куршевиль, Франция, 1993), 9 Всемирном конгрессе по вирусологии (Глазго, Шотландия, 1993), 3 конгрессе Европейского общества по ветеринарной вирусологии (Интерлеюш, Швейцария, 1994), 3 Азиатско-Тихоокеанском конгрессе по медицинской вирусологии (Пекин, Китай 1994 ), 25 Всемирном ветеринарном конгрессе (Йокогама, Япония 1996),7 съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, (Москва 1997), XXX Юбилейной международной конференции " Грипп -ХХІвек ", С.Петербург, 1997 .
Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с
А.Н.Слепушкиным, Я.Закстельской, М.А.Яхно, Т.А.Оскерко, Е.А.Говорковой,
Е.И.,Бурцевой, Н.П.Обросовой-Серовой, Г.Н.Трушинской, Е.И.Исаевой,
А.Л.Беляевым, О.В.Любовцевой, Т.Н.Власовой (НИИ вирусологии РАМН), А.П.Савицким (Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН), а также ученьши из других стран: А.Кендал, М Хемпфилл (СДС, США), К Камерон, А.Хей (Национальный институт медицинских исследований Англия), Б.Тумовой, И.Кубиновой (Институт гигиены и эпидемиологии Чешской республики), Г.Русс, Е.Варичковой (Институт вирусологии САН, Словакия). Автор глубоко благодарен и признателен своим соавторам. Особую благодарность выражаю научному консультанту проф., дмн А Н Слепушкину и сотрудникам группы по надзору Т.А.Оскерко и ст. лаборанту О.А.Александровой.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы, состоявшего из 84 работ отечественных и 315 работ зарубежных авторов. Диссертация изложена на 274 страницах текста включая 43 таблицы и 26 рисунков.