Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирус Марбург является возбудителем геморрагической лихорадки с высокой летальностью. Первые зарегистрированные вспышки экзотического заболевания, названного впоследствии геморрагической лихорадкой Марбург, возникли в 1967г. среди сотрудников исследовательских учреждений ФРГ и Югославии вследствие контакта с инфицированными зелеными мартышками, завезенными из Уганды.
До 1985 г. в мире зарегистрировано 37 случаев геморрагической лихорадки Марбург со средней летальностью 24%. Природные очаги геморрагической лихорадки Марбург существуют в ряде районов Африки. Предполагают, что первичное заражение происходило при контакте с кровью африканских зеленых мартышек. Выделить вирус от обезьян, живущих в природе, не удалось. Исключить обезьян из цепи возможных видов, поддерживающих циркуляцию вируса, представляется преждевременным, хотя утвердилось мнение об активной циркуляции вируса среди приматов. Имеющиеся к настоящему времени преимущественно косвенные данные не позволяют определить какие-либо виды животных, способные играть роль резервуара и переносчика инфекции в природных очагах лихорадки Марбург. Тяжесть протекания заболевания варьирует от стертых и бессимптомных форм до тяжелых летальных случаев. Возрастающая миграция населения, а также длительный инкубационный период, возможность бессимптомных форм, увеличивают вероятность заноса лихорадки Марбург на неэндемичные территории.
Специфические средства лечения и профилактики заболевания не разработаны. Лабораторная диагностика основана на использовании электронной микроскопии, метода флюоресцирующих антител, иммунофер-ментного анализа.
Недостаточно изучены биологические свойства вируса Марбург, работа с которым требует организации максимального уровня биологической защиты.
Тяжесть заболевания, высокая смертность и случаи завоза лихорадки Марбург на неэндемичные территории, отсутствие коммерческих диагностических тест-систем, а так же документов, регламентирующих диагностику, обусловило актуальность проведенного изучения возбудителя геморрагической лихорадки Марбург и совершенствования методов лабораторной диагностики.
Цель работы. Изучение биологических свойств штамма Voege вируса Марбург in vivo и in vitro, разработка и совершенствование методов лабораторной диагностики геморрагической лихорадки Марбург.
Задачи исследования.
-
Подбор чувствительной клеточной культуры и изучение культураль-ных свойств, динамики репродукции вируса, экспрессии вирусспе-цифических антигенов в клетках Vero.
-
Отработка метода определения инфекционности вируса.
-
Адаптация вируса к морским свинкам и изучение их чувствительности. Разработка схем иммунизации морских свинок для получения иммунных сывороток к вирусу Марбург.
-
Совершенствование методов лабораторной диагностики лихорадки Марбург - метода флюоресцирующих антител и иммуноферментно-го анализа.
Научная новизна. Разработан метод титрования инфекционности вируса по бляшкам. С использованием этого метода проведена оценка инфекционной активности вируса по признаку формирования бляшек и репродукции в культуре клеток, что позволило получить клонированный пул вируса, отличающийся от исходного вируса степенью цитопа-тогенного действия на клетки и уровнем репродукции в клеточной культуре.
Изучена динамика репродукции вируса и экспрессии вирусспеци-фических антигенов в культуре клеток Vero. Определены оптимальные сроки размножения инфекционного вируса и наработки биомассы вируса in vitro.
Изучена динамика образования антител к вирусу Марбург у морских свинок. Полученные данные позволили разработать эффективные схемы иммунизации для получения высокоактивных специфических антисывороток с титром антител в НМФА 1:1024.
Впервые разработана тест-система для клеточного иммунофермент-ного анализа антител к вирусу Марбург. Методом клеточного ИФА выявлены специфические антитела к вирусу Марбург в сыворотках морских свинок.
Практическая значимость работы. Результаты работы могут иметь практическое значение. Отмеченный цитопатический эффект вируса Марбург на клетках Vero позволяет титровать инфекционность вируса по цитопатогенному действию. С использованием метода бляшек возможно определять инфекционную активность при изучении процессов размножения вируса. Способность вируса формировать бляшки под агаровым покрытием может быть использована для получения клонированных пулов. Данные по гетерогенности популяции вируса по признаку
формирования бляшек позволяют изучать генетические различия клонов.
Данные по экспрессии вирусспецифических антигенов п культуре клеток Vera позволяют определить оптимальные сроки приготовления слайд-антигенов и правильно оценивать результаты выявления антигенов вируса Марбург в инфицированных клетках методом флюоресцирующих антител. Разработанный метод клеточного ИФА может быть применен для выявления антител к вирусу Марбург. Метод имеет преимущество перед твердофазным иммуноферментным анализом, в связи с тем, что для его постановки не требуется получения очищенного антигена.
Получены данные по чувствительности морских свинок различного возраста к заражению вирусом Марбург. Подобраны эффективные схемы иммунизации морских свинок, позволяющие получать специфические высокоактивные антисыворотки к вирусу Марбург.
Разработанный метод контроля на специфическую безопасность in vivo и in vitro позволяет проводить оценку полноты инактивации инфекционного материала, что является необходимым при выносе инактиви-рованного материала на чистую зону.
Разработана схема лабораторной диагностики лихорадки Марбург, позволяющая выявлять в исследуемом материале как вирулентные, так и слабо вирулентные варианты вируса и проводить его типирование. Схема отработана в лабораторных условиях и испытана на практике при обследовании больной М. из г. Корсаков с диагнозом "геморрагическая лихорадка Марбург".
Результаты исследований легли в основу составления следующих информационно-методических документов:
-
Руководство по диагностике и профилактике особо опасных вирусных геморрагических лихорадок. Иркутск, 1985, 40 с. Утверждено директором ИПЧИ Сибири и Дальнего Востока 2.03.83.
-
Методические рекомендации по проверке герметичности боксов биологической защиты и эффективности работы бактериальных фильтров в системе вентиляции. Иркутск, 1991, 9 с. Одобрены ученым советом и утверждены директором ИПЧИ Сибири и Дальнего Востока 24.05.91.
-
Руководство по противоэпидемическому режиму работы с особо опасными вирусами 1 группы. Иркутск, 1991, 22 с. Одобрено ученым советом и утверждено директором ИПЧИ Сибири и Дальнего Востока 24.06.91.
-
Методическое пособие по лабораторной диагностике возбудителей геморрагических лихорадок Эбола и Марбург. Иркутск, 1993, 17 с. Одобрено ученым советом и утверждено директором ИПЧИ Сиби-
ри и Дальнего Востока 14.04.93.
Методическое пособие отправлено в Госкомсанэпиднадзора РФ для утверждения.
На защиту выносятся следующие положения.
-
Разработка метода определения инфекционной активности вируса Марбург - метода бляшек.
-
Изучение динамики экспрессии вируса Марбург в клетках Vero при низкой и высокой множественности заражения.
-
Изучение динамики экспрессии антигенов вируса Map6ypf в клетках Vero методом иммунофлюоресценции.
-
Разработка метода клеточного ИФА для определения специфических антител к вирусу Марбург.
-
Разработка схемы лабораторной диагностики геморрагической лихорадки Марбург.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на:
Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций"; Волгоград, 1992.
Научной конференции, посвященной 70-летию образования сан-эпидслужбы Иркутской области; Иркутск, 1993.
Научной конференции, посвященной 60-летию Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока; Иркутск, 1994.
В окончательном варианте диссертация апробирована на заседании Ученого Совета Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока 12.04.95г.
Объем и структура диссертации. Текст работы изложен на 100 листах машинописного текста, иллюстрирован 9 таблицами и 11 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 135 источников (35 отечественных и 100 зарубежных).