Содержание к диссертации
Введение
Часть 1. Изучение разнообразия бактерий микробиологическими методами и методом молекулярного клонирования 55
Микробиологический анализ образцов талого снега в районе станций Ленинградская и Дружная 55
Анализ таксономического состава микробного сообщества поверхностного снега в районе станций Ленинградская и Дружная 58
Анализ таксономического состава активно транскрибирующих бактерий Определение скорости включения радиоактивномеченных тимидина и лейцина 68
Часть 2. Изучение разнообразия антарктических микроорганизмов и особенностей их метаболизма анализом метагеномного секвенирования 70
Анализ библиотек фрагментов генов 16S рРНК 70
Метагеномный анализ сообществ антарктического снега 76
Анализ функциональных категорий генов в метагеномах поверхностного снега Антарктиды 80
Часть 3. Анализ разнообразия спейсеров в CRISPR локусах психрофильных антарктических бактерий Flavobacterium psychrophHum 86
Анализ типов CRISPR-Cas последовательностей в метагеномах антарктических микробных сообществ 86
Анализ разнообразия спейсеров F. psychrophilum, в трех различных областях Антарктики 88
Сравнительный анализ кластеров спейсеров антарктических F. psychrophilum с последовательностями в общедоступных базах данных 93
Заключение 96
Выводы 97
Список использованной литературы 98
Приложение 117
Благодарности 1
- Анализ таксономического состава микробного сообщества поверхностного снега в районе станций Ленинградская и Дружная
- Анализ таксономического состава активно транскрибирующих бактерий Определение скорости включения радиоактивномеченных тимидина и лейцина
- Метагеномный анализ сообществ антарктического снега
- Анализ разнообразия спейсеров F. psychrophilum, в трех различных областях Антарктики
Введение к работе
Актуальность работы.
Полярные области - это важные климатообразующие регионы планеты и источники полезных ископаемых. Эти регионы очень чувствительны к изменению климата. По этим причинам интерес к полярным областям со стороны научного и экономического сообщества неуклонно растет. В 2010 году была принята государственная долгосрочная программа «Стратегия развития деятельности Российской Федерации в Антарктике на период до 2020 года и на более отдаленную перспективу». Развитие комплексных научных исследований в Антарктике и проведение мониторинга состояния компонентов природной среды является, таким образом, важной задачей, актуальной для нашей страны. Снежный покров - важнейшая климатическая и экологическая система нашей планеты. Снегами покрыто около 35% поверхности Земли. Снежная экосистема находится в тесном взаимодействии с атмосферой, почвами, морской и талой водой, и оказывает влияние на биосферу в целом. Большую роль при этом может играть микробная составляющая снежного покрова. Численность бактерий на поверхности снегов оценивается от 10 до 10 клеток на миллилитр (кл/мл) талой воды. Микробиологические исследования снегов Арктики, Антарктики и высокогорных ледников показали присутствие в них жизнеспособных микроорганизмов, многие из которых являются облигатными психрофилами. Эти данные описывают лишь минорную часть биологического разнообразия микроорганизмов поверхностных снегов, т.к. согласно современным данным, менее 1% всех бактерий, присутствующих в образце, поддается культивированию. Молекулярно-генетическими методами на поверхности снегов Арктики и высокогорных ледников были обнаружены представители разнообразных филогенетически групп микроорганизмов, например Betaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacilli и Actinobacteria. Исследования микроорганизмов поверхностных снегов Антарктиды с помощью молекулярно-генетических методов начались сравнительно недавно и пока весьма немногочисленны. Всего два исследования описывают разнообразие бактерий поверхностных снегов на куполе Антарктиды в районе двух исследовательских станций - Конкордия и Амундсен-Скотт. Данные о численности, составе и функциональных особенностях микроорганизмов на поверхности снега остальных частей Антарктиды, в том числе ее прибрежных районов, отсутствуют.
Настоящая диссертационная работа посвящена изучению разнообразия микроорганизмов поверхностного снега прибрежных зон Восточной Антарктиды, а также попытке описания их функциональных особенностей.
Согласно плану, принятому в 2014 г. на «Совещании по определению главных научных проблем исследований Антарктики и Южного океана на период до 2035 г», изучение живых организмов на территории Антарктиды является одним из шести приоритетных направлений полярных исследований, поэтому результаты, полученные нами в ходе настоящей работы, могут стать основой для дальнейших исследований и мониторинга микроорганизмов поверхностных снегов Антарктиды.
Цели и задачи
Целью настоящей работы было охарактеризовать сообщества микроорганизмов поверхностного снега прибрежных зон Антарктиды для получения знаний о структуре, динамике и, возможно, функционировании этих сообществ.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Сбор образцов поверхностного снега в удалённых друг от друга областях Восточной Антарктиды, и выделение препаратов ДНК сообществ микроорганизмов снега.
-
Оценка распространения, численности и естественного видового разнообразия микроорганизмов в образцах поверхностного снега с применением молекулярно-генетических и микробиологических методов.
-
Идентификация функциональных категорий генов, характерных для сообществ микроорганизмов поверхностного снега Антарктиды.
-
Исследование штаммов Flavobacterium psychrophilum в образцах снега, собранных в удалённых друг от друга областях Антарктиды, с помощью генотипирования их CRISPR локусов.
Научная новизна, теоретическая и практическая значимость Главная научная ценность работы заключается в том, что в ней впервые современными методами молекулярной биологии проведен комплексный анализ микробного сообщества поверхностного снега прибрежных районов Антарктиды. Показано, что таксономический состав бактерий в образцах антарктического снега из удаленных друг от друга областей Антарктиды, заметно отличается, а в одном и том же месте - существенно меняется в течение одного года. Впервые проведен функциональный анализ сообществ микроорганизмов антарктического снега, выявлена повышенная представленность функциональных групп генов, продукты которых вовлечены в адаптации к окислительному стрессу и устойчивости к тяжелым металлам. Наконец, впервые получены данные о разнообразии спейсеров CRISPR локусов психрофильных бактерий Flavobacterium psychrophilum, часто встречающихся на поверхности снегов Антарктиды. Впервые разработана и апробирована
новая методика оценки разнообразия штаммов микроорганизмов в природных образцах с помощью сравнения наборов амплифицированных спейсеров CRISPR-кассет бактерий. Уникальный опыт и практические навыки, полученные в ходе выполнения настоящей работы, могут быть использованы в планировании и осуществлении будущих микробиологических исследований в Антарктике и Арктике.
Методология и методы работы
Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов микробиологии, молекулярной биологии и биоинформатики.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Таксономический состав бактерий, находящихся на поверхности снега, заметно отличается в образцах из удаленных друг от друга областей Антарктиды, а в одной и той же области изменяется со временем.
-
Таксономический состав антарктических бактерий, определенный по представленности их 16S рРНК и соответствующих им генов, существенно разнится.
-
Среди функциональных категорий генов, статистически значимо перепредставленных в сообществах микроорганизмов поверхностного снега Антарктиды, выявлены гены, кодирующие белки клеточного ответа на окислительный стресс, и гены устойчивости к тяжелым металлам.
-
Наборы спейсеров (вариабельных участков CRISPR-кассет) в штаммах F. psychrophilum из географически удаленных областей Антарктиды существенно отличаются друг от друга и совершенно отличны от спейсеров F. psychrophilum из Северного полушария.
Степень достоверности и апробация результатов работы
Цели, поставленные в работе, достигнуты, результаты приведенных в работе экспериментов грамотно интерпретированы и сделанные в работе выводы обоснованы, их достоверность не вызывает сомнений. Результаты работы были опубликованы в рецензируемых научных журналах и представлены на российских и международных конференциях.
Публикации
Результаты работы были представлены на трех научных конференциях и опубликованы в двух статьях в рецензируемых научных журналах (см. перечень в разделе «Список работ, опубликованные по теме диссертации»).
Структура и объем работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, а также выводов, благодарностей и списка литературы. Работа изложена на 126
страницах машинописного текста, включая 19 рисунков и 15 таблиц. Список цитируемых литературных источников включает 189 наименований.
Анализ таксономического состава микробного сообщества поверхностного снега в районе станций Ленинградская и Дружная
A. В левой части рисунка схематически представлен процесс CRISPR адаптации. При проникновении чужеродной ДНК внутрь клетки (1) происходит ее частичная деградация, в этот момент белки CRISPR-Cas системы Cas1 и Cas2 связываются с фрагментом чужеродной ДНК и встраивают его в CRISPR кассету (2). Таким образом, CRISPR кассета увеличивается в длину на один спейсер и дополнительную копию повтора (3). B. В нижней части рисунка схематически представлен процесс экспрессии и созревания крРНК. CRISPR кассета транскрибируется как единый РНК предшественник (пре-крРНК) (4). Затем белки комплекса Cascade связываются с пре-крРНК и гидролизуют его до коротких РНК (крРНК) (5), каждая из которых оказывается связанной с комплексом белков Cascade. C. В правой части рисунка схематически показан процесс CRISPR интерференции чужеродной ДНК. В случае повторного проникновения ДНК фага в клетку (6) происходит комплементарное связывание ДНК бактериофага с комплексом Cascade-крРНК, который привлекает нуклеазу Cas3 (7). Нуклеаза Cas3 вносит разрывы в ДНК фага, что приводит к ее деградации (8). CRISPR-Cas системы присутствуют в геномах 40% бактерий и 90% архей [32]. Количество CRISPR кассет в одном геноме варьирует от 1 до 18; каждая кассета может содержать до нескольких сот (в среднем - 60) уникальных спейсеров [34]. Штаммы бактерий, принадлежащие к одному виду, часто несут уникальные наборы CRISPR спейсеров. Такая высокая вариабельность позволяет использовать наборы CRISPR спейсеров для типирования близкородственных штаммов бактерий. Такой подход широко применяется в эпидемиологических исследованиях для изучения распространения патогенных штаммов, таких как Mycobacterium tuberculosis, Yersinia pestis, Salmonella enterica и др. [35, 36]. Различные подходы на основе изучения вариативности CRISPR локусов были раработаны, включая сполиготайпинг (от spolygotyping, spacer oligonucleotide typing), CRISPR типирование (CRISPR typing), CRISPR-MVLST (multi-virulence-locus sequence typing; мультилокусное секвенирование генов вирулентности в очетании секвенированием CRISPR локусов) и др. [37]. Методы «омика»
В последнее десятилетие появился ряд новых методов комплексного изучения микробных сообществ, включая такие ак метагеномика, метатракскриптомика, метапротеомика и метаболомика. Часто в англоязычной литературе их объединяют термином «омика» на основании общей части названия [38]. Эти методы позволяют получить представление не только о таксономическом составе, но и о метаболических процессах, которые потенциально могут происходить в сообществе [39].
Метагеномика - анализ совокупной генетической информации сообщества микроорганизмов. Эра метагеномных исследований начались еще в 1985 году, когда для писания разнообразия микробных сообщества впервые пимнили метод создания библиотек клонов фрагментов енов 16S рРНК [40]. Впервые термин «метагеномика» был введен в 1998 году Хандельсманом при описании почвенного микробного сообщества [41]. Такой подход получил широкое распространение для описания мкробного азнообразия и динамики как природных экосистем микробиомов морской оды [42], почв [43], горячих иточниов [44], так и микробиомов человека [45]. Эти исследования позволили выявить тысячи новых таксонов микроорганизмов в природных экосистемах [42]. Действительно широкое распространение метагеномика получила в првом десятилетии 21-го века с появлением методов высокопродуктивного секвенирования. Этот технологический прорыв позволил исключить затратный процесс клонирования фрагментов ДНК в вектора и получать миллионы ДНК последовательностей в течение считанных дней [46]. Кроме того, методы высокопроизводительного секвенирования позволили секвенировать не только отдельные фрагменты генов 16S рРНК, но и случайные фрагменты тотальной ДНК сообщества (так называемое шотган секвенирование, shotgut sequencing). Таким образом, современные метагеномные исследования позволяют получить информацию не только о таксономическом составе всех присутствующих в образцах микроорганизмах, но и оценить их функциональную роль, - через определение относительной представленности генов, кодирующих белки различных ункциональных атегорий [39]. К сожалению, у метагеномных исследований есть ряд недостатков: 1) не всегда удается отсеквенировать достаточное количество последовательностей ДНК для осуществления полной сборки геномов всех присутствующих образце микроорганизмов 2) е всегда возможно охарактеризовать гены, кодирующие белки с пока еще неизвестными функциями 3) на основании мтагеномных иследовний зачастую невозможно установить, какой именно вид в сообществе участвует в том или ином метаболическом процессе [47].
Далеко не все гены, присутствующие в геномах микроорганизмов в сообществе, активно транскрибируются [46]. Mетатранскриптомика - это молекулярный метод, основанный на изучении активно транскрибирующихся рибосомальных и матричных РНК в сообществе. Для того, чтобы описать состав генных транскриптов сообщества, на матрице тотальной РНК сообщества проводят реакцию обратной транскрипции, после чего полученную кДНК используют ля высокопроизводительного секвенирования [48]. У данного метода есть ряд ограничивающих факторов, которые вносят искажения в анализ метатранскриптомных данных: 1) РНК, в отличие от ДНК, не стабильна и быстро деградирует в окружающей среде, поэтому частичные потери неизбежны при выделении тотальной РНК сообщества (особенно это касается мРНК т.к. рРНК несколько более стабильна) 2) уровень экспрессии гена и количество соответствующего белка в клтк могут не коррелировать, поэтому результаты метатранскриптомного анализа являются лишь косвенным указанием на возможное присутствие определенного белка в клетке [48, 49].
Наличие РНК транскриптов в клетках бактерий свидетельствует об экспрессии генов, кодирующих функциональные белки, однако не свидетельствует о реализации этих функций в сообществе. Информацию о том, какие именно белки, закодированные в еномх микрооранимов, участвуют реалиации биохимичской функции, позволяет олучить метапротеомный анализ [38]. Для этого из биомассы микроорганизмов, присутствующих в образце, выделяют тотальный белковый препарат; затем разделяют белки с помощью гель-электрофореза и жидкостной хроматографии, и проводят их идентификацию методом высокоэффективной пептидной ионизации с помощью масс-спектроскопии [38]. Комбинация метагеномных, метатранскриптомных и метапротеомных методов позволяет наиболее полно охарактеризовать состав и функциональные особенности микроорганизмов в экосистеме [50].
Метаболомика - метод, основанный на характеристике метаболитов, которые производятся или потребляются в процессе биологической активности сообщества [51]. Mетаболиты - это вещества небольшой молекулярной массы, которые могут выполнять в ообществе микроорганизмов различные ункции, такие к взаимодействие с другими микроорганизмами в сообществе (сигнальные молекулы и антибиотики), клеточный стресс-ответ (пигменты и осмопротекторы), повышение усвояемости питательных веществ (сидерофоры) и др. [51]. Анализ метаболитов проводится с помощью методов ядерно-магнитного резонанса и масс-спектрометрии [52]. Метаболомные исследования помогают лучше понять и описать физиологический потенциал микробных сообществ.
Анализ таксономического состава активно транскрибирующих бактерий Определение скорости включения радиоактивномеченных тимидина и лейцина
Параллельно с микроскопическим анализом, изучалась способность бактерий из талой воды к росту в лабораторных условиях . Определяли с пособность к росту и образованию колоний на чашках с твердыми средами R2A (бедная по углероду среда) и LB (богатая по углероду среда) на трех температурах +4 oC, +18 oC, +37 oC. Количество культивируемых бактерий в образцах было крайне низким и соответствовало 0-1,2 к.о.е./мл талой воды. Бактерии из колоний, образовавшихся на +4 оС или +18 оС, также образовывали колонии п ри пересеве на +37 оС. Т аким образом, ни один из культивируемых антарктических микробов не был облигатным психрофилом.
Для морфологически отличных друг от друга колоний определяли таксономическую принадлежность образовавших их бактерий с помощью определения и анализа последовательности фрагмента гена 16S рРНК. Среди изолятов были представители классов Gammaproteobacteria (Stenotrophomonas sp., Pseudomonas sp.), Alphaproteobacteria (Phyllobacterium sp., Roseococcus sp.), Actinobacteria (Rhodococcus sp., Microbacterium sp.) и Bacilli (Bacillus sp.) . Как видно из Таблицы 4, наибольшее разнообразие культивируемых бактерий наблюдалось на станции Ленинградская. Интересно, что культивируемые бактерии в образцах , отобранных в одном и том же месте с разницей в один год, были совершенно различными. Таблица 4. Таксономический анализ культивируемых бактерий из образцов поверхностного снега Антарктики. В таблице представлены бактерии, образовавшие колонии при инкубации на указанных температурах.
Для образцов со станции Дружная в ходе 54-й экспедиции детектировали рост Bacillus sp., а в ходе 55-й экспедиции - Stenotrophomonas sp. В образцах, собранных на станции Ленинградская в ходе 54-й экспедиции, были получены колонии , образованные восьмью различными видами бактерий, ни один из которых не был обнаружен в образце , собранном на следующий год . По-видимому, состав культивируемого микробного сообщества на поверхности снега в одном и том же месте может значительно изменяться от года к году. Анализ таксономического состава микробного сообщества поверхностного снега в районе станций Ленинградская и Дружная
Менее 1% бактерий, присутствующих в природных образцах, было получено в чистых ультурах [8]. Поэтому для ценки азнообразия снежных актерий Антарктиды были использованы молекулярно-генетические методы. Были приготовлены четыре библиотеки онов фрагментов нов 16S рРНК, амплифицированных с препаратов ДНК, выделенных из талого снега, собранного на станциях Ленинградская и Дружная в ходе 54-й и 55-й РАЭ. Фрагменты генов 16S рРНК актерий линой римерно 1500 п. о. амплифицировали помощью вырожденных бактериальных праймеров 27F и 1492R, широко используемых для изучения разнообразия микробных сообществ [127]. Амплифицированные фрагменты клонировали в плазмиду pGEM, а затем определяли последовательности вставок в случайно выбранных индивидуальных рекомбинантных плазмидных клонах. Всего было проанализировано около 450 клонов (Таблица 5).
Таблица 5. Количественные показатели для сообществ бактерий в четырех образцах поверхностного снега. Для каждого образца, название которого указано в левой колонке, приведены основные статистические характеристики полученных библиотек клонов генов 16S рРНК.
Для того, чтобы определить таксономическую принадлежность микроорганизмов в образцах мы сравнили последовательности вставок клонированных фрагментов 16S рРНК генов с последовательностями в базе данных RDP, как описано в «Материалах и методах». В библиотеках клонов, приготовленных из образцов со станции Дружная (54-й сезон), Ленинградская (54-й сезон), Дружная (55-й сезон) и Ленинградская (55-й сезон), обнаружили последовательности, соответствующие 18, 23, 10 и 18 различным родам бактерий, соответственно. Покрытие для библиотек клонов со станции Ленинградская по двум стандартным статистическим оценкам Гуда и Чао составляло 89,8% и 94,8% для 54-го сезона, и 98,3% и 87,5% для 55-го сезона; для станции Дружная - 78,4% и 93% для 54-го сезона, и 95,6% и 95,7% для 55-го сезона, т.е., было выше средних значений этих оценок, считающихся необходимыми для достоверной характеристики разнообразия иблиотеках [149]. Индекс Симпсона, который является мерой выровненности представленности таксонов внутри сообщества, для всех четырех библиотек был достаточно низким, т.е., ни одна из филогенетических групп не доминировала в образцах и, следовательно, не вносила серьезных искажений в общее азнообразие. Индекс Шеннона, который оценивает таксономическое разнообразие в образце с учетом вклада каждого таксона в сообщество, изменялся от 1,75 до 2,49 в образцах со станции Дружная 54-го сезона и Ленинградская 55-го сезона, соответственно. Полученные значения характерны и для других снежных и ледниковых сообществ [150, 151]. Для сравнения, в более сложных микробных сообществах, например, из почв, индекс Шеннона варьирует от 2,4 до 3,6 [152, 153]. Таким образом, микробные сообщества снегов гораздо более простые, чем почвенные сообщества.
Как показано на Рисунке 7, в библиотках клонов гена 16S рРНК были идентифицированы представители восьми классов бактерий: Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Verrucomicrobiae и Firmicutes. Betaproteobacteria были самым многочисленным классом и составляли от 39,3% до 82,5% от общего числа клонов на станции Ленинградская (54-й сезон) и ружная (55-й сезон), соответственно. В образце со станции Дружная 54-го сезона второй по численности таксономической руппой были Alphaproteobacteria, а 55-го сезоне Gammaproteobacteria. На станции Ленинградская 54-го сезона Alphaproteobacteria составляли треть всей библиотеки клонов, однако через год их доля в сообществе составила всего 13,8%, в то же время доля Gammaproteobacteria возросла с 12,3% до 22,3%.
Процентные соотношения классов бактерий в образцах снега со станций Дружная и Ленинградская, отобранных в ходе 54-й и 55-й РАЭ. На диаграмме представлена частота встречаемости клонов, содержащих амплифицированные фрагменты генов 16S рРНК классов указанных бактерий, в образцах с обеих станций.
Как видно из Рисунка 8, Janthinobacteria, Prosthecobacter, Sphingomonas и Caulobacter были самыми многочисленными родами в образцах со станции Дружная 54-го сезона и составляли, соответственно, 24,2%, 12,6%, 12,6% и 10,5%. Год спустя, в образце, собранном на том же месте, доля Janthinobacteria выросла до 36%, а три других наиболее многочисленных рода прошлого года не были детектированы. В образцах со станции Ленинградская самыми многочисленными в 54-м сезоне были представители родов Novosphingobium (21,4%), Janthinobacteria (14,3%), Acidovorax (12,5%) и Pseudomonas (9,8%), однако в образце 55-го сезона эти роды практически не детектировались, уступив место представителям одов Comamonas (20,8%), Rhodoferax (18,5%) и Ralstonia (13,1%).
Метагеномный анализ сообществ антарктического снега
Далее сравнили таксономический остав бактерий бразцах о станций Дружная, Ленинградская, Мирный и Прогресс, отобранных в ходе 55-ой РАЭ (Рисунок 10Б). Согласно анализу, проведенному с помощью пакета программ RDP Classifier в образцах были найдены последовательности, соответствующие 34 классам бактерий. Около 4% последовательностей в каждом образце не определялись на уровне лассов, но, тем не менее, входили омен Prokaryota. Эти последовательности моут принадлежать к еще неописанным классам бактерий. Самыми многочисленными классами во ех тырех разцах были: Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Sphingobacteriia, Flavobacteriia, Cytophagia, Actinobacteria, Cyanobacteria и Chloroplast (хлоропластны эукариотических организмов; происходят от цианобактерий [163] и содержат гены 16S рРНК, которые амплифицируются универсальными бактериальными раймерами). Согласно литературным данным, представители филума Proteobacteria преобладают в составе микробных сообществ снегов на поверхности ледникового щита Гренландии [9], ледников Арктики [11] и ледников в Альпах [13]. Также недавно было показано, что Proteobacteria обладают повышенной адаптивной способностью к выживанию при отрицательных температурах [50]. В образцах со станций Ленинградская, Дружная и Мирный преобладали Betaproteobacteria (43, 68.5, и 43%, соответственно) а Flavobacteriia были самыми многочисленными (40%) в бразце на танции Прогресс. Попарное сравнение таксономического состава бактерий в образце со станции Прогресс с остальными тремя образцами при помощи расчета коэффициента корреляции Пирсона показало значительное отличие микробного разнообразия этой станции от трех других станций (Рисунок 10В).
Результаты анализа таксономического состава бактерий на ровне рода представлены на Рисунке 11А. В образцах о танции Дружная самыми многочисленными были последовательности представителей родов Janthinobacterium (27%), Ralstonia (15%) и Pseudomonas (11%), в образцах со станции Ленинградская Caulobacter (12%), Acinetobacter (10%) и Comamonas (9%). На уровне родов бактерий результаты анализа фрагментов генов 16S рРНК, олученных оде высокопродуктивного еквенирования, хорошо оррелировали с результатами, полученными при анализе библиотек клонированных последовательностей. Коэффициент орреляции Пирсона дл образцов Дружной и Ленинградской составил 0,8 и 0,9, соответственно (p-values 0,05). В образце со станции Мирный самыми многочисленными родами бактерий были Ralstonia (31%), Bacilariophyta (24%) и Rudaea (8%), на Прогрессе - Flavobacterium (39%), Hydrogenophaga (14%) и Ralstonia (7%). Представителей родов Janthinobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Caulobacter, Acinetobacter и Comamonas, как отмечено выше, чсто находят холодных местах обитания. Bacilariophyta - это диатомовая водоросль с обширным ареалом, включающим Южный окан [164]. Rudaea была рнее обнаружена в небольшом количестве в ледовых кернах Гренландии [165]. Род Flavobacterium является повсеместным и встречается во множестве экосистем, в том числе в почвах, пресной воде р. Некоторые из представителей того ода, например F. psychrophilum, являются паразитами рыб, живущих в полярных морях [166]. Наконец, род Hydrogenophaga, недавно выделенный тдельный од з Pseudomonas, встречается в водных экосистемах по всему миру. Некоторые его представители, например Hydrogenophaga pseudoflava, были обнаружены молекулярными методами в холодных водоемах [167]. Таким образом, все высокопредставленные на поверхности антарктического снега роды микроорганизмов были ранее детектированы в холодных местах обитания. Рисунок 11. Разнообразие бактерий в образцах антарктического снега на уровне родов.
A. На диаграмме представлена частота встречаемости последовательностей фрагментов 16S рРНК, полученных в ходе высокопроизводительного секвенирования (указаны 20 самых многочисленных родов бактерий).
Б. Тепловая карта, демонстрирующая попарное сравнение представленности родов бактерий в образцах из четырех станций, согласно данным высокопроизводительного секвенирования. Степень сходства оценивали при помощи расчета коэффициента корреляции Пирсона, значение которого показано цветом для каждой из пар сравниваемых образцов. В соответствие представленному градиенту цвета, наименьшему значению к оэффициента корреляции Пирсона на тепловой карте присваивается желтый цвет, наибольшему – красный. Значения p-value для всех полученных значений коэффициента Пирсона составляли менее 0,05.
Несмотря на то, что состав бактерий на уровне классов был сходен для образцов со станций Дружная, Ленинградская и Мирный, корреляции на уровне родов между проанализированными образцами не наблюдалось: коэффициент корреляции Пирсона варьировал от 0,1 для Прогресса и Ленинградской до 0,4 для Мирного и Дружной (Рисунок 11Б). Как было описано в первой части данной работы, цианобактерии отсутствовали в библиотеках клонов 16S рРНК в образцах со станций Ленинградская и Дружная, и с трудом детектировались только при амплификации специфическими праймерами. Анализ ДНК образцов методом высокопроизводительного секвенирования также показал почти полное отсутствие таких последовательностей в образцах со станций Ленинградская (0,04%) и Дружная (0,6%). Однако, 24% последовательностей со станции Мирный и 7% станции Прогресс относились филуму Cyanobacteria/Chloroplast. Как видно из Рисунка 6, станции Мирный и Прогресс, в которых наблюдается большая оля цианобактериальных и хлоропластных последовательностей, находятся всего нескольких километрах т открытой поверхности морской воды, в то время как Дружная и Ленинградская, где такие последовательности практически отсутствуют - на расстоянии 150 км и 400 км, соответственно. Логично предположить, что источником цианобактериальных и хлоропластных последовательностей на поверхности снега близких к воде станций являются оды Южного океана, где цианобактерии и диатомовые водоросли, содержащие хлоропласты, присутствуют значительном количестве [168]. Цианобактерии и диатомовые водоросли могут попадать на поверхность снега из аэрозоля, который образуется над открытой поверхностью воды. Оказываясь на поверхности снега, они могут или выступать первичными продуцентами в близких к воде снежных сообществах или использоваться в качестве источника питательных веществ для снежных бактерий-резидентов.
Метагеномный анализ сообществ антарктического снега Анализ библиотек фрагментов генов 16S рРНК позволяет описать таксономический состав бактерий, но не позволяет получить информацию о других микроорганизмах, находящихся на поверхности снега (эукариот, вирусов), а также не дает полного представления о наличии специфических адаптаций снежных микробов. Для более полного описания таксономического состава антарктического снежного сообщества мы провели метагеномное секвенирование случайных фрагментов ДНК в полученных образцах. ДНК сообществ снега четырех станций использовалась в качестве матрицы ля высокопроизводительного секвенирования на платформе Иллюмина с покрытием около 500000 парных прочтений на каждый образец. Полученные прочтения фильтровали по качеству, длине, затем совмещали парные прочтения, как описано в «Материалах и методах».
К настоящему ремени плучн начиельный мссив данных, обрнных методом высокопроизводительного секвенирования метагеномомных библиотек из различных экосистем. Эти данные объединены в общедоступной базе MG-RAST [135]. Данные метагеномного секвенирования, полученные в настоящей работе, также были добавлены ту азу данных. Краткое описание образцов омера, присвоенные им базой данных MG-RAST, указаны в Таблице 1 Приложения. Поиск генов в полученных ДНК последовательностях и определение их таксономической принадлежности проводили на сервере MG-RAST с помощью пакета «Best hit Classification» (Таблица 9).
Анализ разнообразия спейсеров F. psychrophilum, в трех различных областях Антарктики
Результаты сравнения кластеров спейсеров между станциями представлены в виде диаграммы Венна на Рисунке 18. Лишь 58 кластеров были найдены во всех трех библиотеках пейсеров. Процент ластеров, уникальных ля каждой танции, варьировал от 66 для станции Дружная, до 92 для станции Ленинградская. Таким образом, набор спейсеров (а следовательно и штаммов) F. psychrophilum в каждой из трех исследованных точек Антарктиды в значительной степени уникален. Попарные пересечения кластеров спейсеров составили от 29% для образцов со станции Дружная и Прогресса, 7% для Дружной и Ленинградской и 3% для Прогресса и Ленинградской. Т.е. станции, расположенные ближе друг к другу (Прогресс и Дружная, расстояние 150 км) обладают более схожим составом популяции внутри вида F. psychrophilum. На уровне родов бктерий мы наблюдали противоположную кртину при налие фрагментов 16S рРНК генов - станция Прогресс была наиболее отличной от других станцией, а сообщества Ленинградской и Дружной были наиболее похожи друг на друга.
Рисунок 18. Сравнение набора кластеров спейсеров в образцах со станций Дружная, Прогресс и Ленинградская. Синим, розовым и желтым кругом показаны кластеры спейсеры из станций Прогресс, Ленинградская и Дружная соответственно. Цифры, расположенные ближе к внешним сторонам кругов, показывают количества уникальных кластеров спейсеров для каждой станции; цифры в местах пересечения кругов – количества совпадающих между двумя или тремя выборками кластеров. Скобки показывают удаленность станций друг от друга.
Около 1% кластеров , содержали спейсеры, последовательности которых были комплементарны спейсерам из кластеров с большим весом (большим количеством содержащихся в них спейсеров) из того же образца (Таблица 11). Наличие комплементарных пар спейсеров в CRISPR кассетах было ранее продемонстрировано в экспериментах по адаптации (встраивании новых спейсеров) в CRISPR кассету E. coli [184]. Присутствие самокомплементарных спейсеров в наших данных указывает на то, что встраивания новых спейсеров в системах I-E Е. coli и II-C F. psychrophilum протекает по сходному механизму.
Сравнительный анализ кластеров спейсеров антарктических F. psychrophilum с последовательностями в общедоступных базах данных Коллекцию спейсеров F. psychrophilum сравнили с нуклеотидной базой данных GenBank. Ни один из кластеров не имел соответствий o 117-ю спейсерами, присутствующими в отсеквенированных геномах F. psychrophilum. Лишь три кластера спейсеров соответствовали фрагментам геномов флавобактериофагов FCL-2 и 6H. Кроме того, еще два кластера спейсеров соответствовали последовательностям ДНК в хромосоме Flavobacterium (Таблица 4 в Приложении). Интересно, спейсеры из одного из кластеров соответствовали множественным последовательностям в хромосомах различных флавобактерий, а именно 22 последовательностям в геноме F. indicum, пяти последовательностям в геноме F. psychrophilum, и уникальным последовательностям в геномах F. columnarе и F. branchiophilum. Дополнительный анализ геномного конекста этих нобычных протоспейсеров ыявил, что они являются частью несовершенных палиндромных некодирующих повторов длиной 125 п.о., разбросанных по геномам F. indicum и F. psychrophilum. Функция этих повторов неизвестна. Они имеют тенденцию располагаться межгенных областях, генетическое окружение таких областей часто состоит из генов транспозаз, систем рестрикции-модификации, систем абортивной инфекции. Координаты и численность таких повторов отличаются в разных изолятах флавобактерий. Ранее проведенный сравнительный анализ геномов флавобактерий показал потерю соответствий в порядке генов между разными штаммами ввиду присутствия большого количества повторяющихся IS и rhs элементов [185]. 125-ти нуклеотидный повтор, найденный в ходе нашего анализа, отличается от IS или rhs элементов, однако может играть сходную оль обеспечении пластичности генома флавобактерий.
Соответствие этого повтора спейсеру CRISPR-Cas системы возможно означает участие CRISPR-Cas в контроле распространения подобных элементов по геному флавобактерий.
Обнаружение протоспейсеров для некоторых кластеров спейсеров позволило провести поиск РАМ мотивов CRISPR-Cas системы F. psychrophilum. Мы сравнили полученный нами набор спейсеров (8196 кластеров спейсеров) и 117 уникальных спейсеров F. psychrophilum из базы данных с последовательностями фагов и плазмид флавобактерий, находящимися в базе данных Genbank. Было получено 24 соответствий с последовательностями бактериофагов, причем для антарктических спейсеров было найдено только четыре соответствия, а остальные 20 - для спейсеров из базы данных. Этот неожиданный результат можно объяснить тем, что изоляты F. psychrophilum, также ак фаги флавобактерий, последовательности которых находятся в базе данных, были выделены на территории Северного полушария. Поиск новых РАМ мотивов для CRISPR-Cas систем II типа позволяет увеличить количество доступных мишеней при разработке методов редактирования геномов эукариот на основе CRISPR/Cas9 технологии [186]. С помощью Weblogo сервиса сравнивали последовательности, прилегающие к 3 концам обнаруженных протоспейсеров. Таким образом выявили консервативную последовательность АТАТ в двух нуклеотидах от конца протоспейсера (Рисунок 19), которая, возможно, является РАМ мотивом П-С CRISPR-Cas системы F. psychrophilum. Этот мотив отличен от известных РАМ последовательностей CRISPR/Cas9 систем.