Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1. Общая характеристика рода Potexvirus 11
1.1 Структура генома 11
1.2 Вирусные белки, кодируемые геномом потексвирусов 31
2. Вирус мозаики альтернантеры 40
2.1 Структура генома ВМАльт 43
2.2 Белки, кодируемые геномом ВМАльт 44
3. Создание векторов на основе геномов представителей рода Potexvirus 50
3.1 Полноразмерные вирусные векторы, полученные на основе генома ХВК 52
3.2 Деконструированные вирусные векторы на основе генома ХВК 58
3.3 Векторы на основе генома вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт) 61
Материалы и методы 64
1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 65
2. Подбор праймеров для ПЦР 66
3. Рестрикция ДНК 69
4. Лигирование фрагментов ДНК 69
5. Трансформация бактериальных клеток 69
6. Выделение плазмидной ДНК 70
7. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в агарозном геле 71
8. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 71
9. Выделение тотальной РНК из листьев растений Nicotiana benthamiana 10. Получение кДНК-копий субгеномных РНК, образуемых векторами 72
11. Получение кДНК-копии фрагмента кодирующей последо-вательности гемагглютинина вируса гриппа А 73
12. Получение бинарного вектора p(AltMV-single) 74
13. Получение бинарного вектора p(AltMV-double) 78
14. Получение бинарного вектора p(AltMVriple) 79
15. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double ) 80
16. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-MCS) 80
17. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-GFP) 81
18. Схема получения вектора pQE-HARBD 82
19. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-HARBD) 83
20. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-hGCSF) 83
21. Схема получения вектора pQE-hGCSF 84
22. Электрофоретический анализ белков в денатурирующем полиакриламидном геле 85
23. Вестерн-блот 85
24. Агроинфильтрация листьев Nicotiana benthamiana 86
25. Анализ накопления целевых белков в листьях N. benthamiana 87
26. Получение вирусоподобных частиц из БО вируса мозаики альтернантеры, экспрессированного вирусными векторами в листьях N. benthamiana 87
27. Выделение целевых белков из листьев растения N. benthamiana 88
28. Экспрессия и выделение рекомбинантных белков из клеток E. coli. 88
29. Электронная микроскопия: 89
Результаты и обсуждение 90
1. Создание векторов с одним и двумя последовательно расположенными субгеномными промоторами, контролирующими экспрессию гена целевого белка 91
2. Исследование транскрипционной активности субгеномных промоторов в составе вектора AltMV-double 97
3. Исследование вирусоподобных частиц, образующихся из БО ВМАльт при экспрессии вектора AltMV-double в листьях N. benthamiana 102
4. Экспрессия целевых белков различной природы в растениях N. benthamiana с помощью вектора AltMV-double 106 5. Изучение влияния введения дополнительного третьего СГП на эффективность вектора AltMV-double 116
Заключение 121
Выводы 124
Список литературы 125
- Вирусные белки, кодируемые геномом потексвирусов
- Деконструированные вирусные векторы на основе генома ХВК
- Выделение тотальной РНК из листьев растений Nicotiana benthamiana 10. Получение кДНК-копий субгеномных РНК, образуемых векторами
- Исследование транскрипционной активности субгеномных промоторов в составе вектора AltMV-double
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Одним из наиболее часто используемых подходов для экспрессии ЦБ (ЦБ) в растении является заражение растения вектором, созданным на основе генома вируса растения и несущим последовательность гена ЦБ (Hefferton et al., 2012; Gleba et al., 2014; Lico, 2008). Вирусный вектор сохраняет способность вируса к репликации и, иногда, также к распространению по растению. Преимущество таких векторов заключается в том, что, однажды попав в пермиссивную клетку, они способны самостоятельно реплицироваться, что позволяет им накапливаться в клетке в значительном количестве за короткий промежуток времени.
На сегодняшний день растения все чаще используются для продукции различных ЦБ: они не требуют сложных и дорогостоящих условий культивирования; они не имеют общих с человеком патогенов, что снижает опасность биологической контаминации конечного продукта; являются эукариотами, что также оказывается важным в ряде случаев, когда требуется гликозилирование ЦБ или когда этот белок эффективно накапливается лишь в определенном компартменте клетки, например в эндоплазматическом ретикулуме (Hefferton et al., 2012; Gleba et al., 2014; Twyman et al., 2003). Продукция ЦБ в растении также может быть получена путем создания трансгенного растения, содержащего ген ЦБ, но скорость накопления ЦБ при использовании вирусного вектора как правило превышает скорость его накопления в трансгенном растении, и является технически менее сложным. В связи с этим создание новых вирусных векторов, позволяющих эффективно экспрессировать чужеродные белки в растенях, является важной и актуальной задачей молекулярной вирусологии.
В качестве основы для создания вирусных векторов часто используют геномы РНК-содержащих вирусов растений, в том числе вирусов, относящихся к группе Potexvirus, сем. Alphaflexiviridae, пор. Tymovirales. Такие вирусы характеризуются высоким уровнем накопления в зараженном растении, а также тем, что геномы этих вирусов реплицируются в цитоплазме – это исключает необходимость учитывать механизмы контроля транскрипции в ядре при создании нового вектора. Одним из эффективных подходов для получения вирусного вектора является создание «деконструированного вируса», т.е. вируса, у которого удалены все гены, не являющиеся необходимыми для репликации (Gleba et al., 2014). При этом экспрессию гена ЦБ часто ставят под контроль субгеномного промотора (СГП) гена БО,
т.к. БО РНК-содержащих вирусов экспрессируется наиболее интенсивно по сравнению с остальными вирусными генами.
Для успешной экспрессии ЦБ с помощью вектора, полученного на основе фитовируса, необходимо изучение процесса репликации вируса, а также исследования участков генома, регулирующих этот процесс. На сегодняшний день, несмотря на интенсивное развитие этого направления исследований, остаются невыясненными определенные аспекты репликации РНК-содержащих вирусов растений, в том числе неизвестна структура и точное расположение промоторов синтеза субгеномных РНК ряда потексвирусов, а также промторов синтеза их геномной и антигеномной РНК. Таким образом, создание вирусных векторов на основе генома РНК-содержащих вирусов является актуальной задачей молекулярной вирусологии, имеющей как фундаментальное, так и прикладное значение.
Цели работы
Целью настоящей работы было создание экспрессионного вектора на основе генома вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт, Alternanthera mosaic virus, AltMV) – представителя рода Potexvirus, – который позволял бы экспрессировать с высокой эффективностью различные ЦБ в растениях, а также изучение участков генома ВМАльт, регулирующих процесс репликации.
Задачи исследования Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:
-
Создание вирусного вектора p(AltMV-single) на основе генома ВМАльт-MU в соответствии с принципом деконструированного вектора, в котором целевой ген расположен под контролем субгеномного промотора (СГП) белка оболочки.
-
Создание нового вирусного вектора p(AltMV-double) на основе генома ВМАльт-MU в составе которого целевой ген расположен под контролем двух последовательно расположенных СГП 1 и 3.
-
Сравнительный анализ накопления модельного ЦБ белка в листьях Nicotiana benthamiana с помощью вектора p(AltMV-single) и p(AltMV-double).
-
Изучение транскрипционной активности СГП в составе нового вектора p(AltMV-double). Исследование влияния подавления транскрипционной активности одного из двух промоторов на уровень экспрессии модельного ЦБ.
-
Изучение эффективности экспрессии с помощью вектора p(AltMV-double) целевых белков различной природы – зеленого флуоресцентного белка медузы, растворимого
фрагмента гемагглютинина вируса гриппа А и человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.
6. Оценка целесообразности дальнейшего увеличения количества последовательно-
расположенных СГП до трех для увеличения экспрессионной эффективности вектора.
Научная новизна и практическая значимость
В ходе работы была впервые создана серия деконструированных вирусных векторов на основе генома вируса мозаики альтернантеры, штамма MU (ВМАльт-MU).
Также впервые был получен вирусный вектор на основе генома вируса растений, в котором ген ЦБ находится под контролем сразу двух последовательно расположенных субгеномных промоторов. Впервые показано, что оба субгеномных промотора в его составе функционируют одновременно, образуя две субгеномные РНК различной длины.
Получены новые сведения о функционировании регуляторных участков генома ВМАльт: впервые локализованы точки старта синтеза субгеномных РНК, соответствующих транскрипционной активности субгеномных промоторов 1 и 3. Кроме того, для субгеномного промотора 1 ВМАльт была впервые показана возможность его деактивации.
Практическая значимость данной работы заключается в потенциальной возможности использования созданного вирусного вектора p(AltMV-double) для эффективности продукции в растении ЦБ различной природы, в том числе белков медицинского назначения.
Публикации и апробация результатов.
Результаты работы были представлены на конференциях «Ломоносов-2011», Москва, Россия; «Ломоносов-2012», Москва, Россия; «Биотехнология будущего 2012», Москва Россия; конгрессе «FEBS-2012», Севилья, Испания, а также на семинаре кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (6 мая 2015 года).
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ, и 5 материалов международных конференций.
Личный вклад автора состоит в участии в постановке задач исследования, разработке экспериментальных подходов, анализе, обобщении и интерпретации полученных результатов. Все эксперименты выполнены при непосредственном участии автора. Вклад
соавторов заключался в помощи при постановке целей и задач исследования. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из оглавления, списка использованных сокращений, введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, благодарностей от лица автора, и списка литературы, который включает 171 источник. Диссертация содержит 33 рисунка и 2 таблицы.
Вирусные белки, кодируемые геномом потексвирусов
5НТО РНК ХВК имеет длину 83 нт без учета кэп-структуры. 5-НТО ХВК также принято называть «-лидер» (Smirnyagina et al., 1991). При этом первые 41 нуклеотид с 5-конца геномной РНК обозначаются как «», а следующие 42 нуклеотида обозначаются как «». Участок не содержит гуаниновых остатков и частично комплементарен 3-проксимальному участку растительной 18S-рРНК. Было показано, что -лидер является энхансером трансляции, подобно -лидеру вируса табачной мозаики (Smirnyagina et al., 1991; Gallie, 2002). Последовательность 5-НТО входит в состав 5-концевого участка геномной РНК с выраженной вторичной структурой, представленной двумя шпильками с терминальными выпетливаниями (Рис.2). Эти структуры были названы 5SL1 (32-106 нт) и 5SL2 (143-182 нт) (считая от 5-конца РНК соответственно) (Kim and Hemenway, 1996; Miller et al., 1998, 1999).
5SL1 элемент является многофункциональным. Анализ эффективности транскрипции и репликации мутантов вируса, имеющих нарушения или вариации во вторичной структуре SL1, показал, что данная шпилька участвует в синтезе геномной и субгеномных РНК ХВК (Miller et al., 1998, 1999).
Шпилька 5SL1, как это было показано методом SELEX (Систематическая эволюция лигандов путем накопления по экспоненциальному закону, Systemic Evolution of Ligands by EXponential enrichment), является необходимой для синтеза геномных и субгеномных (+) цепей РНК вируса. В особенности важен для функциональности этого элемента тетрануклеотид GAAA, входящий в состав концевой петли этой шпильки, и некомплементарная пара нуклеотидов С-С в ее стволе. Также было установлено, что 5SL1 специфически связывается с белками из S100-фракции, полученной из лизата протопластов табака. Авторы предполагают, что данное взаимодействие играет важную роль в репликации вируса. (Kwon and Kim, 2006). Исходя из полученных данных, авторы предложили механизм переключения между репликацией и межклеточным транспортом вирусной РНК. При раздевании вириона в инфицированной клетке первым освобождается от БО 5-конец РНК, в том числе и 5SL1, с которым связываются клеточные факторы запускающие трансляцию и репликацию вирусного генома. После накопления достаточного количества субгеномной РНК БО, и, как следствие, самого БО, данный белок связывается с 5SL1, вытесняя связанные с ней клеточные факторы, и, таким образом, блокирует репликацию вируса. Далее запускается процесс одевания вирусной РНК и ее транспорта в соседнюю клетку. (Kwon and Kim, 2006). Данные, свидетельствующие в пользу этой модели, получены в работе Lough et al., 2006. Авторами была создана серия
Рис. 2 Схема расположения 5 - и 3 -концевых регуляторных участков геномной РНК ХВК. Схематически изображена геномная РНК ХВК. Прямоугольниками обозначены ОРС генов вируса. Фигурными скобками обозначены границы 5 - и 3 -концевых регуляторных эелементов генома. Схематически изображены элементы вторичной структуры этих регуляторных участков – шпильки 5 SL1, 5 SL2, 3 SL1, 3 SL2, 3 SL3. Прямоугольниками с различной штриховкой обозначены последовательности регуляторных цис-элементов с известными функциями. 1-46 нт – АС-богатый элемент, связывающий клеточный белок р54. 38-47 нт – минимальный элемент, необходимый для сборки вириона. 6428-6436 нт – уридил-богатая последовательность. Прямоугольники с диагональной штриховкой – 3 -концевые NUE-элементы(Near Upstream Elements). В составе 5 SL1 обозначен GAAA тетрануклеотид, необходимый для инициации синтеза геномной цепи. (по Verchot-Lubicz et al., 2007). векторных конструкций на базе генома ХВК, из которого были удалены тройной блок генов, ген белка оболочки. Чтобы картировать участок, отвечающий за межклеточный транспорт вирусной РНК, векторные конструкции имели делеции в 5-концевой области вирусного генома. Для детекции межклеточного транспорта, в векторные конструкции был введен ген зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein-ЗФБ). Далее растения трансформировали полученными векторами совместно с ХВК дикого типа. После этого проводился анализ межклеточного транспорта векторных РНК по наличию флюоресценции ЗФБ. Было показано, что делеция 107 и более н.т. с 5-конца вирусной РНК (что как раз перекрывает раион расположения структуры 5SL1) блокирует межклеточный транспорт (Lough et al., 2006). Функции второй структуры 5-НТО – 5SL2 – в настоящее время подробно не изучены (Park et al., 2014).
Кроме регуляторных участков с выраженной вторичной структурой в 5НТО ХВК присутствуют неструктурированные регуляторные элементы. В области 1-46 нт, располагается участок, для которого наличие вторичной структуры не было показано, содержащий пять тетрануклеотидов ACCA (Miller et al., 1998; Kim and Hemenway, 1996). Было продемонстрировано, что данные повторяющиеся последовательности, а особенно первая из них (10-13 нт), связывают p54 – хозяйский белок, важный для репликации вируса. Мутации данной области, приводившие к понижению афинности к р54, снижали эффективность накопления (+) РНК вируса в протопластах (Kim et al., 2002). Позицию 4-11 нт от 5-конца занимает консервативный октануклеотид GUUAAGUU, встречающийся в том же положении у ряда других потексвирусов (Рис. 3), способный комплементарно взаимодействовать с четырьмя консервативными октануклеотидами во внутренней последовательности генома: на 3 конце ОРС репликазы и в составе субгеномных промоторов 1,2,3 (Kim and Hemenway, 1999). Путем внесения мутаций, приводящих к изменению степени комплементарности дынных последовательностей удалось показать, что комплементарное взаимодействие между концевым октануклеотидом и октануклеотидом в составе СГП 1 или 3 необходимо для синтеза соответствующих субгеномных РНК (сгРНК). При этом, нарушение всех возможных вариантов комплементарных взаимодействий между октануклеотидом в составе 5НТО и внутренними октануклеотидами, за счет внесения мутаций в краевой октануклеотид, приводило к радикальному снижению накопления геномной и всех субгеномных РНК, не оказывая заметного влияния на количество синтезируемой (-) РНК. Следовательно, дальние комплементарные взаимодействия являются необходимыми для репликации и транскрипции ХВК и, вероятно, других потексвирусов. (Kim and Hemenway, 1999; Hu et al., 2007).
Выравнивание 3 -концевых последовательностей антигеномных матриц различных потексвирусов: ХВК (PVX); ВМБ (BaMV); Вирус обычной мозаики кассавы (CCMV); вирус мозаики желтого клевера (CYMV); вирус мозаики лисохвоста (FMV, ВМЛс); вирус мозаики нарцисса (NMV);вирус мозаики папайи (PMV);вирус мозаики подорожника азиатского (PlAMV);вирус аукубы мозаики картофеля (ВАМК, PAMV); вирус умеренного желтого края клубники (SMYEAV); вирус мозаики белого клевера (WClMV, ВМБК). Консенсусная последовательность обозначена жирным шрифтом. (Kim and Hemenway, 1999). 1.1.2 3 - концевые цис-регуляторные элементы генома потексвирусов
Основные данные о структуре и функциях 3-НТО потексвирусов получены при исследовании геномов ХВК и ВМБ.
Эти шпильки получили названия SL1, SL2 и SL3 соответственно их последовательному расположению от 3 к 5 концу геномной РНК (Pillai-Nair et al., 2003). Наиболее термодинамически стабильными являются SL1 и SL3. Показано, что SL3 необходима для синтеза (-) цепи РНК, при этом важны как целостность вторичной структуры шпильки, так и наличие консервативной после
Деконструированные вирусные векторы на основе генома ХВК
ВМБ образует следующие элементы вторичной структуры (перечислены от 5 к 3 концу): структура подобная клеверному листу, шпилька с концевым выпетливанием и псевдоузел. (Huang et al., 2001) «Клеверный лист» принято подразделять на три домена – A, B, C, - являющиеся, по сути, отдельными шпильками с концевыми выпетливаниями (Huang et al., 2001). Делеция ABC-структуры приводит к неспособности данного мутанта накапливать БО в протопластах. (Cheng and Tsai, 1999). Делеционный анализ ABC-структуры показал, что домены B и C играют важную роль в репликации ВМБ. Домен A, судя по всему, не нужен для этого процесса. Делеция домена А приводила к нарушению распространения данного мутанта по растению, что позволяет предположить участие этого элемента в транспорте вирусной РНК. (Chen et al., 2003). ABC-структура способна, кроме того, связывать хеликазоподобный домен репликазы ВМБ, причем связывание осуществляют концевое выпетливание шпильки В, часть ее ствола и неструктурированный участок с 3конца данной области (Chen et al., 2003). Следующая за клеверным листом шпилька обозначается как домен D. В ее терминальном выпетливании присутствует консервативный для всех потексвирусов гексануклеотид ACNUAA. Анализ мутантов по 3НТО ВМБ показал, что сохранение шпильки D необходима для репликации вируса в протопластах (Tsai et al., 1999; Cheng and Tsai, 1999). Было показано, что С-концевой домен репликазы ВМБ, экспрессированный в E. coli, способен связываться со шпилькой D. При этом специфичность связывания зависит от присутствия интактного консервативного гексануклеотида и части двучепочечного участка шпильки (Huang et al., 2001).
Следом за доменом D расположен псевдоузел, образованный шпилькой E и частью поли(А)-тракта. С помощью метода мутационного анализа авторы работы Tsai et al., 1999 показали, что более 15 адениловых остатков входят в состав псевдоузла и необходимы для поддержания его структуры. Целостность данного структурного элемента критически важна для репликации ВМБ. Присутствия псевдоузла на 3 конце вирусной РНК достаточно для поддержания репликации ВМБ на низком уровне (29% от базового) (Cheng et al., 2001; Tsai et al., 1999). Кроме того, псевдоузел ВМБ связывает клеточные факторы: р43 и р51, причем, вероятно, белки связываются именно с поли(А)-трактом (Lin et al., 2007). Дополнительно, р51 может связываться с 11 нт из ствола шпильки D. Судя по всему, эти два фактора конкурируют за сайт связывания и оказывают противоположенное влияние на синтез (-) цепи РНК: р51 его подавляет, а р43 не влияет. Однако, p43 вытесняет р51 из комплекса с РНК. р43 идентифицирован как фосфоглицераткиназа хлоропластов растения N.tabacum (Lin et al., 2007). В работе Cheng et al., 2002 показано, что репликаза может связываться примерно с 20 5-концевыми аденилатными остатками в составе поли(А) тракта ВМБ. Для локализации сайта инициации синтеза (–) РНК, авторы работы Cheng et al., 2002 определили последовательность кДНК соответствующей 5 концу –РНК. Данное исследование показало, что на 5 конце (–) РНК находится 15 или меньше остатков уридина. Исходя из этих данных авторы сделали вывод, что инициация синтеза (-) РНК происходит в районе 15-ого аденилового остатка в составе поли(А)-тракта (+) РНК, считая от 5-конца.
В состав шпильки D, входит предполагаемый сигнал полиаденилирования AAUAAA (NUE подобный), находящийся в боковом выпетливании с 3-стороны (Cheng and Tsai, 1999). Удаление NUE подобного элемента из состава шпильки D приводит к критическому снижению количества синтезированных РНК вируса. Для данной последовательности показана роль в образовании (-) цепей, кроме того, предположительно, данный элемент участвует в регуляции синтеза (+) цепей, а именно, их полиаденилировании (Cheng and Tsai, 1999). Существуют две гипотезы о возможном механизме полиаденилирования РНК ВМБ (Chen et al., 2005). Согласно одной из них в этом процессе участвуют клеточные белки, например полиаденилатсинтетаза. По другой гипотезе полиаденилирование осуществляется в результате нематричной полиаденилирующей активности репликазы ВМБ (Chen et al., 2005). Подтверждением для второй гипотезы служит тот факт, что репликаза (+)РНК-содержащих вирусов способна к 3-концевой трансферазной активности (Guan et al., 2000).
Экспрессия ОРС 2,3,4,5 у потексвирусов осуществляется путем синтеза субгеномных РНК (сгРНК). В ходе репликации потексвирусов две сгРНК образуются в большем количестве: сгРНК1 (от 1,9 до 2,1 тысяч нт) и сгРНК 3 (0,9 до 1,0 тысяч нт). С первой из них транслируется ТБ1, а со второй БО (Dolja et al., 1987; Kim and Hemenway, 1996; Lee et al., 1998; White et al., 1992). сгРНК2 размером 1,4 тысяч нт необходима для экспрессии ТБ2 и 3, однако она накапливается в малых количествах (Verchot et al., 1998).
Как и у многих других РНК вирусов инициацию синтеза субгеномных РНК потексвирусов обеспечивает субгеномный промотор, располагающийся в непосредственной близости к точке старта транскрипции. Chapman с соавторами (1992b) показали, что участок 5586-5666 нт, перекрывающийся с началом ОРС БО ХВК, способен обеспечивать транскрипцию целевого гена в вирусном векторе, созданном на основе генома ХВК, однако структура этого СГП не была достаточно изучена.
Также было показано, что для образования субгеномных РНК потексвирусов требуются также дальние комплементарные взаимодействия между консервативными последовательностями в составе субгеномного промотора и концевыми участками генома (Kim et al., 1997). Сравнение последовательностей предполагаемых промоторов субгеномных РНК1 (СГП1) и РНК3 (СГП3), разных потексвирусов выявило консервативные октануклеотидные последовательности (3-CAAUUCAA-5) (Рис. 7, 8) (Kim and Hemenway, 1997; Lee et al., 1998; White et al., 1992). Замены нуклеотидов в данной консервативной последовательности СГП 1 и 3 ХВК приводили к существенному уменьшению эффективности транскрипции (Kim and Hemenway, 1997). Последовательность между октануклеотидом и точкой старта транскрипции значительно отличается у разных потексвирусов (Kim and Hemenway, 1997; Lee et al., 1998).
Октануклеотиды расположены с 5-конца от точки старта транскрипции потексвирусов, в случае ХВК - на расстоянии 14 нт от не (Kim and Hemenway, 1997). При изучении различных мутантов ХВК было показано, что изменение расстояния между консервативным октануклеотидом и стартом транскрипции сгРНК 1 и 3 приводит к значительному уменьшению эффективности транскрипции, тогда как замены нуклеотидов в этой области существенно не влияет на этот процесс (Kim and Hemenway, 1997, рис. 8).
Выделение тотальной РНК из листьев растений Nicotiana benthamiana 10. Получение кДНК-копий субгеномных РНК, образуемых векторами
К сожалению, слабым местом стратегии использования дополнительного промотора является склонность векторов такого типа к утере целевого гена в ходе системного распространения инфекции (Gleba et al., 2014). Это происходит вследствие гомологичной рекомбинации между одинаковыми участками присутствующих в векторе двух субгеномных промоторов БО в ходе репликации. В качестве решения этой проблемы было предложено использовать для контроля экспрессии целевого гена субгеномные промоторы близкородственных вирусов. Такие промоторы могут иметь различия в нуклеотидной последовательности, достаточно значительные для снижения эффективности гомологичной рекомбинации, но при этом не критичные для нарушения распознавания данного субгеномного промотора репликазой вируса. Представителем этого типа векторов является конструкция на основе генома ХВК, представленная в работе Dickmeis et al., 2014. Репортерный ген ЗФБ находился под контролем СГП3 ХВК, в то время как ген БО ХВК экспрессировался под контролем СГП3 ВМБ. При системном распространении инфекции по растению выщепления трансгена из конструкции не происходило. Сходным образом был создан ветор pCaPVX760 (Wang et al., 2014). Однако, в данном векторе, помимо дополнительного СГП3 ХВК, также используется СГП3 ВТМ. ВТМ не является близкородственным вирусом по отношению к ХВК, однако его СГП3 функционирует в составе данного вектора. pCaPVX760 любопытен также тем, что этот вектор является уникальным среди аналогичных векторов на основе геномов потексвирусов по количеству различных экспрессируемых белков в одном растении.
Тройной блок генов и ген БО не являются необходимыми для репликации ХВК и ВМБ (Morozov and Solovyev, 2003; Park et al., 2014). Это делает возможным создание вирусного вектора, в котором эти последовательности были бы замещены на целевой ген (Рис. 12В). Это позволило бы избежать траты ресурсов клетки на синтез белков, не являющихся необходимыми для репликации вектора (Gleba et al., 2014). Нарушенную функцию межклеточного транспорта вирусного вектора предполагается компенсировать за счет доставки ДНК-копии вектора в составе специальной плазмиды в клетки растения с помощью агробактериальной трансформации (Fraley et al. 1983; Barton et al. 1983; Gleba et al., 2014). В рамках данного подхода на основе генома ХВК было успешно создано несколько векторов.
На основе генома ХВК штамма UK3 был создан вектор PVXdt (Komarova et al., 2006). В вектор входит 5-НТО генома PVX, ген полимеразы, субгеномный промотор 1 , последние 60 нт гена БО и 3-НТО генома ХВК. Эта конструкция, была вставлена под контроль 35S-промотора и 35S-терминатора в Т-ДНК область бинарного вектора pBIN19. Такой вектор реплицировался в отдельных клетках, накапливаясь в них в больших количествах и обеспечивая продукцию репортерного белка (ЗФБ) в 2,5 раза превышающую таковую для вектора pPVX201-ЗФБ, имеющего архитектуру типа «полный вирус с дополнительным промотором» (Baulcombe et al., 1995). Впоследствии, на основе вектора PVXdt был создан другой вектор - путем замены гена белка ЗФБ на синтетический ген термолабильного энтеротоксина E. coli - обеспечивавший аккумуляцию целевого белка в количестве 1-2% от растворимого белка агроинфильтрированной ткани (Ravin et al., 2008a). В целях увеличения эффективности экспрессии целевого гена, его нуклеотидная последовательность была оптимизировна для трансляции в растении, а также с 3-конца гена была добавлена последовательность SEKDEL-сигнала локализации белка в ЭПР.
Аналогичным образом, на основе штамма ХВК Tula, вирионы которого накапливаются в больших количествах в зараженном растении, был создан вектор PVXdt_Tula (Рис. 13А; Ravin et al., 2008b). В оба вектора – PVXdt и PVXdtula -была клонирована последовательность гена uidA, кодирующего бетта-глюкуронидазу. Сравнение эффективности обоих векторов показало, что эффективность PVXdt_Tula в 1,5-2 раза выше, чем эффективность PVXdt. Так как эти два вектора отличаются только последовательностями 5-НТО и генов репликазы, то именно эта последовательность определяет эффективность вектора. С помощью компьютерного анализа было показано, что вторичная структура 5-НТО PVXdtula более стабильна по сравнению с 5-НТО PVXdt. При этом повышение стабильности 5-НТО PVXdtula связано с заменой всего одного нуклеотида в составе 5-НТО PVXdt по сравнению с PVXdtula (Рис. 13Б). В работе Mardanova et al. (2009) был продемонстрирован еще один подход к увеличению экспрессии целевого белка с помощью вектора на основе PVXdt. В этой работе в последовательности вектора PVXdt-ЗФБ между ОРС репортерного гена ЗФБ и последовательностью субгеномного промотора 1 была вставлена последовательность 5- НТО сгРНК вируса мозаики люцерны, являющегося энхансером трансляции. Количество ЗФБ, накапливаемого таким вектором, превышало в 3,6-4 раза количество ЗФБ, накапливаемого вектором PVXdt.
Наряду с векторами на основе генома ХВК, для создания векторов деконструированного типа также используются геномы других представителей рода Potexvirus. Так, на основе генома вируса мозаики лисохвоста был создан вектор FECT40, обеспечивавший накопление репортерного белка ЗФБ в количестве 40% от растворимого белка трансформированной ткани листа (Liu et al., 2010). Архитектура вектора FECT40 повторяет, в целом, таковую у вектора PVXdt-ЗФБ, а именно: трансген экспрессируется под контролем СГП1, причем перед ОРС трансгена оставлены 40 5-концевых нт ОРС ТБГ1, а после ОРС трансгена, помимо 3-НТО вируса, располагаются 60 3-концевых нт ОРС БО.
Исследование транскрипционной активности субгеномных промоторов в составе вектора AltMV-double
Для получения конструкции pQE-HARBD между собой были лигированы следующие фрагменты: кДНК-копии частей кодирующей последовательности гена гемагглютинина вируса гриппа А, соответствующих рецептор-связывающему домену данного поверхностного белка – Flu1 и Flu2. Flu1 был обработан эндонуклеазами рестрикции SacI и SphI, а Flu2 был обработан эндонуклеазами рестрикции SacI и KpnI.
Обработанные эндонуклеазами рестрикции фрагменты Flu1 и Flu2 были лигированы с вектором pQE30, предварительно обработанным эндонуклеазами рестрикции SphI и KpnI. Полученная конструкция получила название pAl3012.
Фрагмент PCR14 был получен методом ПЦР на матрице pAl3012 с оллигонуклеотидными праймерами Al2035 и Al2036. Далее PCRX был обработан эндонуклеазами рестрикции SphI и PstI, после чего был лигирован с вектором pQE30, также обработанным этими эндонуклеазами рестрикции.
Конструкция получила название pQE-HARBD и содержала последовательность фрагмента гемагглютинина гриппа с шестью гистидинами на С-конце и сайтом гидролитического расщепления энтерокиназой, расположенным между последовательностью целевого белка (ЦБ) и шестью гистидинами. Эта последовательность находится под контролем промотора транскрипции фага Т5 и t0-терминатора фага лямбда в составе вектора pQE30.
Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-HARBD) Для получения конструкции p(AltMV-double-HARBD) между собой были лигированы следующие фрагменты:
Фрагмент PCR15, полученный методом ПЦР на матрице конструкции pQE-HARBD со специфическими олигонуклеотидными праймерами Al2040 и Al2041. Данный фрагмент был обработан эндонуклеазами рестрикции AscI и AvrII.
Вектор p(AltMV-double-MCS), обработанный эндонуклеазами рестрикции AscI и AvrII. Полученная конструкция AltMV-double-HARBD представляла собой вектор AltMV-double-MCS с вставленной в сайт множественного клонирования последовательностью фрагмента гемагглютинина гриппа (63-286 аминокислотный остаток), шестью гистидиновыми аминокислотными остатками и сайтом гидролитического расщепления энтерокиназой, расположенным между последовательностью ЦБ и шестью гистидинами. Последовательность вектора AltMV-double-HARBD вставлена в бинарный вектор pCambia 1300 под контроль 35S-промотора ВМЦК и терминатора гена нопалинсинтетазы.
Для получения конструкции p(AltMV-double-hGCSF) между собой были лигированы следующие фрагменты: Фрагмент, содержащий кодирующую последовательность гена гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека. Фрагмент был амплифицирован методом ПЦР на матрице вектора pGEM3Z-hGCSF (любезно предоставленного нам к.б.н. П.А. Ивановым), содержащего целевую последовательность, с олигонуклеотидными праймерами Al2050, Al2051 (PCR16). Полученный фрагмент был обработан эндонуклеазами рестрикции AscI и AvrII. Полученный рестрикционный фрагмент содержал последовательность, кодирующую целевой белок, на 3-конце которого присутствовали шесть остатков гистидина и сайт гидролитического расщепления энтерокиназой, расположенный между последовательностью ЦБ и гистидиновыми остатками.
Вектор p(AltMV-double-MCS), обработанный эндонуклеазами рестрикции AscI и AvrII. Полученная конструкция AltMV-double-hGCSF представляла собой вектор AltMV-double-MCS с вставленной в сайт множественного клонирования последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, на 3-конце которого находились шесть гистидиновых аминокислотных остатков и сайт гидролитического расщепления энтерокиназой, расположенный между последовательностью ЦБ и шестью гистидиновыми остатками. Последовательность вектора AltMV-double-hGCSF вставлена в бинарный вектор pCambia 1300 под контроль 35S-промотора ВМЦК и терминатора гена нопалинсинтетазы.
Для получения конструкции pQE-hGCSF между собой были лигированы следующие фрагменты:
Фрагмент, содержащий последовательность, кодирующую гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека. Данный фрагмент был амплифицирован методом ПЦР на матрице вектора pGEM3Z-hGCSF (любезно предоставленного нам к.б.н. П.А. Ивановым) с олигонуклеотидными праймерами Eg-gcsf-fwd и Eg-gcsf-rev (PCR17). Полученный фрагмент был обработан эндонуклеазами рестрикции SphI и PstI.
Вектор pQE30 («Quiagen», Германия), обработанный эндонуклеазами рестрикции SphI и PstI. Полученная конструкция получила название pQE-hGCSF и содержала последовательность, кодирующую гранулоцитарный колониести-мулирующий фактор человека, на 3-конце которого находилась последовательность, кодирующая шесть гистидиновых аминокислотных остатков и сайт гидролитического расщепления энтерокиназой, расположенный между последовательностью ЦБ и гистидиновыми остатками. Вся последовательность находится под контролем промотора транскрипции фага Т5 и tO-терминатора фага лямбда в составе вектора pQE30.
К образцу белка добавляли 2-3 объема буфера для нанесения на полиакриламидный гель (ПААГ), содержащего 60 % глицерина, 20 % р-меркаптоэтанола, 10 % додецил сульфата натрия (ДСН), 1 % бромфенолового синего и 0.25 М Трис-HCl, рН 6.8). Далее пробу прогревали 3-10 мин. при +95С. Электрофорез проводили в пластинах полиакриламидного геля (ПААГ) размером 100х73х0.75 мм, согласно протоколу, описанному в работе Лэммли (Laemmli, 1970). В качестве стандартов молекулярной массы использовали наборы маркерных белков фирмы «Fermentas» (14,4 - 116 кДа). Электрофорез проводили в приборе Protean II (Bio-Rad, США) в Трис-глициновом буфере, рН 8.4 (25 мМ Трис, 0.192 М глицин, 0.1 % ДСН) при постоянном напряжении 20-40 В/см в течение 45 минут. Гель окрашивали Кумасси G-250.
После электрофореза белки из геля переносили на мембрану Hybond-P («Amersham», США) методом электропереноса (прибор Mini Trans-Blot cell (Bio-Rad, США), буфер для переноса (47,9мМ Tris, 39мМ Глицина, 20% этанол, 0,04%SDS) при напряжении 30В в течение 16 часов. После переноса мембрану инкубировали в 5 % растворе сухого молока в буфере tTBS (0,01М Tris-HCL pH=7,4; 0,15М NaCl; 0,05% tween) в течение 1 часа, после чего отмывали 3 раза по 10 минут в буфере tTBS. Далее инкубировали с первичными антителами (1мг/мл) в буфере tTBS в течение 1 часа, отмывали 3 раза по 10 минут в буфере tTBS, каждый раз меняя буфер, и инкубировали с вторичными антителами коньюгированными с пероксидазой хрена («Promega», США), (разведение 1:10000) в буфере tTBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Отмывали 3 раза по 10 минут в буфере tTBS. Проявляли с помощью ECL системы («Amersham»). Люминесценцию регистрировали с использованием рентгеновской пленки (Kodak, США) а также с помощью гель-документирующей системы ChemiDoc XRS+ («BioRad», США).
Клетки бактерий Agrobacterium tumefaciens штамма GV3101 трансформировали исследуемой конструкцией, клонированной в бинарный вектор, засевали в жидкую среду 2-YT c cелективными антибиотиками и растили в течение 16 часов при температуре 280С при равномерном покачивании. Далее бактерии осаждали центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 5 мин с помощью центрифуги Eppendorf MiniSpin («Eppendorf», Германия). Затем осадок ресуспендировали в буфере для агроинфильтрации, содержащем 10 мМ MgCl2 и 10 мМ MES, pH 5,0. Оптическую плотность суспензии измеряли при длине волны 600 нм, после чего добавляли к суспензии буфер для агроинфильтрации до достижения оптической плотности 0,2 OD. Полученными суспензиями инфильтрировали листья растений N. benthamiana трех верхних ярусов с помощью пластиковых медицинских шприцев на 2 мл со снятой иглой.