Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Онкотоксические белки 14
1.1.1. Онкотоксические белки невирусного происхождения 15
1.1.1.1. TRAIL 15
1.1.1.2. MDА7 17
1.1.1.3. HAMLET 19
1.1.2. Онкотоксические белки вирусной природы 23
1.1.2.1. Белок аденовируса E4orf4 23
1.1.2.2. Белок парвовируса NS1 24
1.1.2.3. Белок вируса анемии кур - Апоптин (VP3)
1.1.2.3.1. Структура и характеристика апоптина 27
1.1.2.3.2. Механизмы апоптин-опосредованной клеточной гибели 29
1.1.2.3.3. Фосфорилирование апоптина, как ключевое событие обеспечивающее его противоопухолевый потенциал 32
1.1.2.3.4. Практическое применение апоптина 35
1.2. Клеточная иммунотерапия 37
1.2.1. Терапия с использованием клеток адаптивного иммунитета 37
1.2.1.1. Дендритно-клеточные вакцины 37
1.2.1.2. Т-клеточная терапия
1.3. Современные проблемы иммунотерапии 47
1.4. Заключение 48
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Оборудование 49
2.2. Реактивы 50
2.3. Реагенты, антитела и наборы 51
2.4. Растворы и среды 52
2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 53
2.6. Рестрикция 56
2.7. Лигирование 58
2.8. Приготовление химически компетентных клеток E. coli 59
2.9. Трансформация клеток E.coli 59
2.10 Выделение плазмидной ДНК 60
2.11. Выделение тотальной РНК 61
2.12. Упаковка и очистка лентивирусных частиц 62
2.13. Определение титра лентивирусных частиц 65
2.14. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток 66
2.15. ПААГ-электрофорез и иммуноблоттинг белков 67
2.16. Работа с эукариотическими клетками 69
2.17. Выделение отдельных популяций клеток из периферической венозной крови человека 70
2.18. Активация презентации опухоль-ассоциированного антигена HER2/neu дендритными клетками человека 71
2.19. Определение фенотипического профиля и морфологии зрелых дендритных клеток человека 72
2.20. Проточная цитометрия и подготовка образцов 73
2.21. Праймирование цитотоксических Т-лимфоцитов in vitro и анализ цитотоксического потенциала 74
2.22. Лентивирусная трансдукция активированных ЦТЛ 76
2.23. Исследование эффективности модифицированных Т-лимфоцитов на ксенографтной модели рака молочной железы с использованием иммунодефицитных мышей линии nude 77
2.24. Статистический анализ 78
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Создание рекомбинантной системы межклеточного транспорта онкотоксического белка апоптина на основе лентивирусных векторов 79
3.2. Выбор чувствительной культуры для определения цитотоксического потенциала системы межклеточного транспорта апоптина 87
3.3. Предварительный анализ цитотоксического потенциала межклеточной системы доставки рекомбинантного онкотоксического белка апоптина в культуре клеток in vitro 88
3.4. Поиск способов оптимальной доставки и экспрессии рекомбинантной генетической конструкции, содержащей последовательности сигнальных пептидов и апоптина, в первичной культуре цитотоксических CD8+ Т
3.5. Разработка способа активации модифицированных Т-лимфоцитов in vitro против клеток аденокарциномы молочной железы - MCF7, без снижения уровня экспрессии рекомбинантного апоптина 98
3.6. Исследование цитотоксического потенциала модифицированных Т лимфоцитов человека на модели подкожных ксенографтов на
иммунодефицитных мышах 114
Список литературы
- Онкотоксические белки невирусного происхождения
- Фосфорилирование апоптина, как ключевое событие обеспечивающее его противоопухолевый потенциал
- Приготовление химически компетентных клеток E. coli
- Поиск способов оптимальной доставки и экспрессии рекомбинантной генетической конструкции, содержащей последовательности сигнальных пептидов и апоптина, в первичной культуре цитотоксических CD8+ Т
Онкотоксические белки невирусного происхождения
TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand) - цитокин семейства факторов некроза опухоли, вызывающий апоптоз опухолевых клеток. TRAIL связывается с рецепторами смерти TRAILR1 (DR4) и TRAILR2 (DR5) и вызывает их олигомеризацию, что приводит к образованию эффекторного комплекса DISC. Этот комплекс ответствен за активацию прокаспазы 8 и инициацию собственно апоптоза [7]. Помимо образования DISC после связывания с TRAIL рецепторы DR4 и DR5 способны вызывать сборку другого комплекса, включающего в себя FADD (Fas associated protein with Death Domain), TRADD (Tumor necrosis factor receptor type 1 associated DEATH domain protein), RIP (Receptor (TNFRSF) interacting serine threonine kinase 1 protein) и каспазу 10. Кроме индукции апоптоза этот комплекс активирует сигнальные пути NFkB, PKB/AKT и MAPK [8]. TRAIL также может связываться с двумя “фальшрецепторами” DcR1 и DcR2, которые не имеют функциональных цитоплазматических доменов и не инициируют передачу сигналов внутрь клетки. Наличие на поверхности клетки большого количества DcR1 и DcR2 может снижать ее чувствительность к TRAIL за счет конкуренции между функциональными и нефункциональными рецепторами [9]. Также имеются данные, что DcR1 и DcR2 могут вызывать устойчивость к TRAIL индуцированному апоптозу, вызывая стимуляцию клеточных путей, направленных на выживание посредством активации NFkB, ERK и p38 [10]. Парадоксально, но злокачественная трансформация, вызванная некоторыми онкогенами, в частности RAS, MYC HER2, также сопровождается повышением активности каспаз и стимуляцией апоптоза. Причиной этого может быть участие клеточных факторов, контролирующих одновременно передачу пропролиферативных и проапоптозных сигналов. В возникающем в таком случае “ансамбле” стимулирующих и ингибирующих сигналов могут преобладать стимулирующие. Такие клетки обладают повышенной чувствительностью TRAIL индуцированному апоптозу. С ругой стороны, подавление проапоптозных сигналов снижает чувствительность клеток к TRAIL. К снижающим чувствительность перестройкам относятся конститутивная активация NFkB, PI3K, гиперэкспрессия cFLIP, XIAP, а также противо-апоптозных белков семейства Вс12 [11].
Избирательная чувствительность именно опухолевых клеток к TRAIL, видимо, связана с высоким содержанием на их поверхности рецепторов DR4 и DR5 [12], что обусловлено усилением их транскрипции под действием некоторых онкогенов, в частности RAS, и мутациями BRAF. Роль самих DR4 и DR5 в функционировании раковых клеток достаточно противоречива и не до конца изучена - стимуляция этих рецепторов смерти может вызывать апоптоз в некоторых видах раковых клеток и в то же время в других видах, в частности в опухолях толстого кишечника, стимулировать инвазивность и метастатическую активность клеток под влиянием KRAS. Опухоли второго типа хорошо реагируют на терапию при помощи TRAIL [13].
Важная особенность TRAIL - отсутствие зависимости его функции от статуса опухолевого супрессора р53. Хотя активация р53 потенциирует действие TRAIL а чет активации экспрессии рецептора DR4, чувствительность к TRAIL сохраняется и у клеток, в которых р53 не активен по причине мутаций или делеций [14]. Рекомбинантный TRAIL, а также несколько го функциональных аналогов - моноклональных антител, агонистов рецепторов DR4 и DR5 - в настоящее время проходят клинические испытания в качестве противораковых препаратов. Хотя предварительные результаты испытаний свидетельствуют низкой эффективности монотерапии TRAIL и его аналогами, вполне вероятно, что препараты того типа могут быть успешно применены качестве компонентов комплексной терапии - вместе с традиционными химиотерапевтическими средствами [15]. В пользу этого говорят данные о повышении чувствительности устойчивых к TRAIL линий клеток после обработки субтерапевтическими дозами химиотерапевтических препаратов, которые подавляют антиапоптозные сигнальные пути или усиливают активность каспаз. Так, в линих клеток неходжкинских лимфом устойчивость к TRAIL обусловлена повышенной экспрессией противоапоптозных белков: Mcll, Вс12 и Survivin. Обработка таких клеток субтоксичными концентрациями кверцетина - препарата, снижающего экспрессию белка Survivin, - восстанавливала их способность входить в апоптоз под действием TRAIL [16]. Восстановление чувствительности к TRAIL и его аналогам наблюдалось также после подавления сигнального пути PI3K Akt при помощи рапамицина, который селективно ингибирует белок mTOR [17]. Ингибитор сигнального пути RafMEKERK гелданамицин и его аналог, 17 AAG, также способны потенциировать действие TRAIL, в частности, в устойчивых к нему линиях глиом [18].
Белок MDA7/IL24 (melanoma differentiation associated7/interleukin24) входит в семейство интерлейкина 10, так как имеет характерный для этого семейства структурный мотив [19]. Экспрессия MDA7/IL24 характерна для меланоцитов. Иммунохимическим анализом выявлен высокий уровень экспрессии MDA7/IL24 в меланоцитах и клетках меланомы на ранних стадиях развития заболевания. Напротив, в клетках инвазивной и метастазирующей меланомы экспрессия MDA7/IL24 полностью отсутствует. Искусственная экспрессия рекомбинантного MDA7/IL24 в клетках метастазирующей меланомы приводит к остановке роста опухоли и ее регрессии - это подтверждает гипотезу, что MDA7/IL24 участвует в формировании злокачественного фенотипа клеток меланомы. Результаты исследования механизма опухолеспецифического апоптоза указывают на то, что при связывании MDA7 с BiP/GRP78, белком семейства шаперонов Hsp70, происходит фосфорилирование фактора инициации трансляции eIF2 с последующим подавлением экспрессии противоапоптозных белков, таких как BclXL, Mcl1 и cFLIP (Рисунок 1) [20].
Фосфорилирование апоптина, как ключевое событие обеспечивающее его противоопухолевый потенциал
Длительное время считалось, что для Т-клеточной терапии достаточно + Т только CD8-лимфоцитов. Однако хронический воспалительный процесс, сопровождающий рост опухоли, преобразует иммунную систему увеличивается уровень IL-17 [92], возрастает количество и активность регуляторных Т-клеток [93] и миелоидных супрессорных клеток [94]. Эффективность Т-клеточной терапии также зависит о количества и соотношения провоспалительных и супрессорных клеток [95]. Для ее повышения используют комбинацию цитотоксических CD4 Т хелперных (in) клеток [96]. В зависимости от подтипа, CD4 Т-лимфоциты регулируют иммунный ответ, секретируя различные цитокины, активация Т-хелперов происходит после рспознавания Т-клеточным рецептором антигена, связанного с МНСП. Для Т-клеточной терапии чаще всего применяют ТЫ-клетки, которые вырабатывают IFN и ТТ + Т 1L-2, что стимулирует пролиферацию и созревание CD8-лимфоцитов [97]. Th2-клетки секретируют IL-4, IL-5 IL-6, необходимые ля дифференцировки В-клеток и синтеза ими антител. Третий подтип, ТЫ7, секретирует большие количества провоспалительного цитокина IL-17 и также активно участвует формировании противоопухолевого ответа [98-100]. Было показано, что ТЫ7-лимфоциты эффективнее подавляют развитие меланомы, чем наивные (ThO) и ТЫ-клетки [101, 102].
Наивные Т-лимфоциты приобретают специфичность после контакта с антигенпрезентирующими клетками, несущими опухолевый антиген. Такой контакт можно провести ex vivo, за счет ко-культивации ThO-лимфоцитов вместе со зрелыми дендритными клетками [103] (Рисунок 6). Т-клеточная терапия с использованием этого метода особенно эффективна за счет точного нацеливания Т-лимфоцитов на трансформированные клетки [104]. Существует масса успешных примеров применения такой терапии - в работе [105] показано, что ко-культивирование цитокин-активированных ДК и наивных Т-лимфоцитов приводит к образованию большого количества СШ CD8-лимфоцитов, а их противоопухолевый эффект выше, чем оказываемый цитокин-активированными Т + Т лимфоцитами. В другой работе CD8-лимфоциты ко-культивировали с дендритными клетками, до этого содержавшимися в среде с тотальным лизатом опухолевых клеток МЖ MCF7 MDA-MB231, экспрессирующих антиген MUC1. Было показано, то наибольшей представленностью на ДК обладает эпитоп MUC1 Ml,2. После о + Т культивации, наибольшее количество CD8-лимфоцитов оказалось специфичными именно этому эпитопу. Помимо появления специфических цитотоксических клеток, была зарегистрирована переориентация наивных ThO-лимфоцитов в ТЫ, что дополнительно усиливает терапевтический эффект [106]. Клинические исследования показали, что введение ко культивированных in vitro ДК, ЦТЛ и цитокин-индуцированных Т-клеток пациентам с первичным раком печени, холангиокарциномой, раком легкого, желудка ли толстого кишечника, привело изменению иммунного статуса. У всех пациентов снизилось количество иммуносупрессирующих регуляторных -клеток, пациентов первичным раком печени и раком легкого снизилось общее количество хелперных Т-лимфоцитов, пи этом количество цитотоксических Т-лимфоцитов увеличилось. Дополнительно подтвердило позитивный терапевтический эффект и снижение концентрации опухолевых маркеров в сыворотке крови у большинства пациентов [107].
Для-клеточной иммунотерапии можно использовать CD8 1-лимфоциты, генетически модифицированные ex vivo. Таким образом можно повысить специфичность Т-лимфоцитов к минорным опухолевым антигенам. Это можно достичь и экспрессировав антиген в антиген презентирующих клетках, что используется для создания дендритноклеточных вакцин. Специфичность Т-клеток «переопределяют», вводя в них новые гены Т -клеточного рецептора (TCR) [108]. Для этого CD8+ T-лимфоциты трансдуцируются выделенной из антигенспецифичной Т-клетки кДНК, кодирующей и -цепи Т -клеточного рецептора [109, 110]. Такая модификация иногда приводит к образованию гибридных ТCRов за счет слияния эндогенных и трансдуцированных и -цепей, и последующему возникновению реакции «трансплантат против хозяина» [111]. Чтобы избежать этого, создают гибридные рецепторы с константной частью, позаимствованной у мышиных, такая замена практически исключает вероятность гибридизации с эндогенными рецепторами [112]. С аналогичной целью меняют трансмембранный домен вводимого рецептора на домен рецептора CD3, что позволяет экзогенным и -цепям объединяться без взаимодействия с эндогенными [113]. Третий, наиболее эффективный способ – вводимые цепи соединяются дополнительной дисульфидной связью за счет добавления в константные домены еще одной пары цистеиновых остатков [114].
Приготовление химически компетентных клеток E. coli
В настоящее время достигнуты значительные успехи в расшифровке структуры и свойств апоптина, однако, применение его на практике остается до сих пор затруднительным. Ограничения связаны главным образом с иммуногенностью этого белка. Если однократное введение препарата может и не привести к развитию иммунного ответа со стороны организма и белок достигнет опухоли, то серийные введения вызывают развитие иммунного ответа на белок, в результате чего образуются антитела, специфичные к апоптину, то приводит к связыванию и блокировке препарата. Поскольку в большинстве случаев при лечении злокачественных опухолей требуется многократное введение препарата, эффективность всей терапии может значительно снизиться. На сегодняшний день разработано несколько способов доставки апоптина в клетки опухоли. Основным считается вирусная доставка. Проводились опыты по доставке апоптина с помощью аденовируса, вируса болезни Ньюкасла и парвовируса H-1 [136-138]. Суть метода состоит в сборке модифицированной вирусной частицы, геном которой содержит последовательность апоптина. В процессе заражения происходит экспрессия генома вируса и, следовательно, экспрессия гена апоптина, а появление онкотоксического белка вызывает гибель раковой клетки. Как правило, для снижения патогенности вируса используется упрощенная система, включающая только наиболее важные белки оболочки вириона, а сам геном содержит только последовательность целевого белка и регуляторные элементы, необходимые для его экспрессии. Исследование с использованием аденовирусной системы на основе вектора AdMLPVP3, кодирующего последовательность апоптина, показало высокий уровень гибели клеток рака печени (HepG2) in vitro [66]. Одним из лимитирующих факторов является использование нерепликативных векторов, что снижает эффективность экспрессии целевого белк. Существуют и работы по созданию репликативных аденовирусных векторов, е сильный промоторный регион EF1alpha находится под контролем опухолеспецифичного промотора TERT [69]. Эффективность такой системы показана в экспериментах in vivo, на клетках рака простаты и рака желудка [70]. К сожалению, эффективность данной системы может быть также значительно ограничена иммунным ответом. Ко всему прочему, прохождение вируса по кровеносному руслу будет носить ненаправленный характер, следовательно, часть ирионов неминуемо инфицирует нормальные клетки, что значительно снизит терапевтический эффект. Другим способом доставки апоптина является упаковка экспрессионных плазмид, содержащих последовательность гена апоптина, особые молекулярные комплексы, которые селективно присоединяются к раковым клеткам. Примером может служить взаимодействие плазмидной ДНК и комплекса поли-L-лизин - асиалоорозомукоид (ASOR, ASGP) с образованием ового комплекса. ASOR (ASGP) представляет собой выделенный деацелированный нейраминидазой орозомукоид (природный гликопротеин, выделенный из человеческой донорской крови). В роцессе образования олного комплекса плазмидная отрицательно заряженная ДНК нековалентно присоединяется положительно заряженным остаткам полилизинового хвоста, который, в свою очередь, ковалентно присоединяется к ASGP. При этом чсть отрицательного заряда, которым обладают молекулы ДНК, снимается, что увеличивает вероятность их проникновения в клетки. Сам ASGP способен связываться с ASGP-рецептором, широко представленным на клетках печени, через концевые остатки галактозы. Таким образом, этот комплекс может применяться при лечении рака печени [4]. В качестве материала для наночастиц используются биоразлагаемые полиэфиры. Однако, такие частицы н обладают специфичностью, что исключает направленную доставку молекул целевого белка к опухоли, как следствие, эффективность лечения остается невысокой. Наиболее перспективным на сегодняшний день методом доставки терапевтических белков к клеткам опухоли можно считать применение собственных иммунных клеток, таких к натуральные киллеры, дендритные клетки итотоксические лимфоциты. Использование клеток иммунной системы позволит не только защитить белок от агрессивной среды организма, но и создаст эффект двойного действия, когда деградация опухолевых клеток под действием апоптина запустит воспалительные процессы в очаге опухолеобразования, что усилит общий иммунный ответ. В данном случае использование цитотоксических Т-лимфоцитов выглядит более предпочтительным по нескольким причинам. Одним из факторов является способность Т-лимфоцитов распознавать даже самые маленькие молекулы (пептиды), экспрессируемые на поверхности опухолевых клток. К тому же Т-лимфоциты могут подвергаться сложным генетическим манипуляциям. Главными преимуществами являются х быстрая пролиферация, относительно долгая продолжительность жизни, а также простота их культивации in vitro [139]. С учетом всего вышеперечисленного именно T-лимфоциты были выбраны в качестве средства доставки молекул апоптина в клетки опухолей.
Одним из самых важных этапов ри создании проверке работоспособности терапии подобноо вида стал выбор оптимальной системы секреции апоптина и его дальнейшего транспорта из цитотоксических -лимфоцитов клетки пухоли. Большинство эукариотических белков имеют особые сигнальные последовательности, обеспечивающие их транспортировку в другие компартменты клетки и во внеклеточное пространство. Однако все они обладают разной степенью эффективности. Как правило, сигналы транспорта во внеклеточное пространство высокоспецифичны и характерны для белков определенной группы, секретирующихся из определенной популяции клеток . С другой стороны, универсальные транспортные пептиды не так многочисленны и представляют большой интерес для биотехнологии [140]. В настоящее время наиболее эффективными и универсальными секреторными сигналами считаются сигнал секреции люциферазы Gaussia (GLuc), выделенной из веслоногого рачка Gaussia princeps, и искусственный сигнал HMMsp38, полученный в результате in silico-анализа [141-143] . HMMsp38 – искусственный секреторный пептид, характеризующийся наиболее высоким показателем эффективности (D=0,932), и GLuc-пептид – секреторный сигнал люциферазы Gaussia princeps, обладающий самым высоким показателем эффективности среди природных сигналов (D=0,88). Эти сигнальные последовательности были выбраны для создания системы секреции-интернализации и определения наиболее эффективного варианта при экспрессии генетической конструкции в культуре цитотоксических Т-лимфоцитов человека.
Поиск способов оптимальной доставки и экспрессии рекомбинантной генетической конструкции, содержащей последовательности сигнальных пептидов и апоптина, в первичной культуре цитотоксических CD8+ Т
Обработка опухолевых культур различными вариантами цитотоксических Т-лимфоцитов показала достаточно четкую зависимость количества погибших клток от способа активации ЦТЛ. Так, ЦТЛ, активированные помощью зрелых модифицированных дендритных клеток, показали наибольший уровень цитолитической активности отношении практически всех опухолевых култур, чо указывает на эффективность праймирования и , вероятно, на повышенный уровень селективности в отношении опухолевых клеток экспрессирующих рецептор HER2/neu. Необходимо отметить относительно небольшую разницу в цитолитической активности лимфоцитов. Подобный эффект объясняется наличием у Т -клеток базового порога распознавания чужеродного материала, благодаря которому, в любом случае , будет наблюдаться мощный цитотоксический ответ. Полученные результаты позволяют говорить об эффективности проведенного процесса праймирования и нацеливании Т -клеток на опухоль-ассоциированный антиген HER2/neu.
Как упоминалось ранее, основной целью использования данной методики праймирования являлась эффективная активация и нацеливание Т-клеток по отношению к специфичному опухоль-ассоциированному рецептору без снижения экспрессии рекомбинантной генетической конструкции pL-EF1a-GLucAT-Apoptin. Для этого было проведено сравнение количества апоптина в культуральной жидкости, а также определена его концентрация (Рисунок 28).
Определение концентрации апоптина КЖ показало, чо один цитотоксический Т-лимфоцит продуцирует в среднем от 7 до 11 п рекомбинантного белка. Эти результаты согласуются с данными, полученными ранее и говорят о том, что активация ЦТЛ с помощью модифицированных дендритных клеток не приводит к снижению экспрессии апоптина.
Исследование цитотоксического потенциала модифицированных Т-лимфоцитов человека на модели подкожных ксенографтов на иммунодефицитных мышах Эксперименты in vitro являются лишь начальной фазой тестирования любого противоопухолевого препарата позволяют оценить его первичные фармакодинамические параметры. Солидные опухоли являются крайне сложными структурами, на рост которых влияет множество различных факторов. Так, для роста раковой опухоли большое значение имеют её микроокружение, постоянная подача питательных веществ с помощью густой сети кровеносных сосудов и эпителиально-стромальные взаимодействия, поэтому результаты, полученные на клеточных линиях in vitro не могут быть полностью приложены к опухоли, развивающейся в организме. Следующий этап исследований составили эксперименты на животной модели с использованием ксенотрансплантов опухолевых линий. Модель представляет собой подсаженную культуру опухолевых клеток, которые течением времени приживаются и продолжают расти в организме животного. С целью предотвращения реакции отторжения трансплантата в исследованиях использовалась линия иммунодефицитных бестимусных мышей - nude (BALB/c). Эксперимент проводили с использованием линии MCF7. Для определения динамики деградации опухолей и выявления закономерности мышей разделили на несколько групп: группе №1 вводили модифицированные лимфоциты, экспрессирующие последовательность онкотоксического белка апоптина, группе №2 вводили немодифицированные а ктивированные лимфоциты, группе №3 вводили изотонический раствор хлорида натрия. Каждая группа включала несколько подгрупп, которым вводили разное количество ЦТЛ: 1х106 кл/мышь и 2х106 кл/мышь. После инъекции динамика роста опухолей анализировалась каждые 2 дня путем определения их линейных размеров. Экспериментальные данные характеризующие динамику роста опухолей приведены на рисунках 29 и 30.
Динамика роста опухоли при испытании препарата модифицированных ЦТЛ, экспрессирующих последовательность г\6 онкотоксического белка апоптина (животным вводили 1х10 клеток/мышь). Животным из контрольных групп вводились немодифицированные активированные цитотоксические Т -клетки и изотонический раствор хлорида натрия. По оси ординат указан объем опухоли, ось абсцисс - количество дней после введения препарата клеток.
Динамика роста опухоли при испытании препарата модифицированных ЦТЛ, экспрессирующих последовательность онкотоксического белка апоптина (животным одили 2х10 клеток/мышь). Животным из контрольных групп вводились немодифицированные активированные цитотоксические -клетки и изотонический раствор хлорида натрия. По оси ординат указан объем опухоли, ось абсцисс - количество дней после введения препарата клеток.
Опыт показал, что ведение активированных ЦТЛ нгибирует активный рост опухоли. При этом введение 1 млн. модифицированных Т-лимфоцитов оказывает эффект, схожий с таковым при введении культуры немодифицированных л имфоцитов. Однако при увеличении дозы модифицированных Т -лимфоцитов в два раза (до 2 млн. клеток) можно отметить отличия в динамике роста опухолей. Наблюдается достаточно выраженная стагнация роста опухоли при введении модифицированных Т клеток на протяжении 10 дней. В то время как немодифицированные Т клетки оказывают ингибирующее действие в течение 5 суток . В дальнейшем индекс прироста опухоли восстанавливается, что указывает на прекращение терапевтического эффекта от введения модифицированных Т-клеток. Полученные данные позволяют говорить о наличии выраженного терапевтического эффекта, оказываемого модифицированными ЦТЛ, экспрессирующими последовательность рекомбинантного апоптина.