Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы 6
1.1 Актуальность проблемы 6
1.2 Цели и задачи исследования 6
1.3 Научная новизна результатов исследования 7
1.4 Практическая значимость 7
1.5 Апробация работы 7
1.6 Структура и объем работы 7
2. Обзор литературы 9
2.2 Обратная транскрипция ВИЧ 12
2.3 Обратная транскриптаза ВИЧ 14
2.4 Молекулярный механизм полимеразной активности ОТ ВИЧ 17
2.5 Нуклеозидные ингибиторы ОТ ВИЧ (НИОТ) 18
2.6 Ненуклеозидные ингибиторы ОТ ВИЧ 19
2.7 Антивирусная терапия ВИЧ 22
2.8 Механизмы резистентности к ННИОТ ВИЧ 23
2.9 ННИОТ ВИЧ на основе замещенных пиримидинов 2.9.1 ННИОТ на основе диарилзамещенных пиримидинов (DAPY) 25
2.9.2 ННИОТ ВИЧ на основе 1-[(2-гидроксиэтокси)метил]-6-(фенилтио)тимина (HEPT) 47
2.9.3 ННИОТ ВИЧ на основе дигидроалкоксибензилоксопиримидинов (DABO) 64
3.0 ОБСУЖДЕНИЕ И РЕЗУЛЬТАТЫ 72
3.1 Создание панели мутантных форм ОТ ВИЧ 72
3.2 Ингибиторы ОТ ВИЧ на основе бензофеноновых производных пиримидинов. 75
3.3 Ингибиторы ОТ ВИЧ на основе N1-замещенных урацилов, содержащих амидный фрагмент. 88
3.4 Ингибиторы ОТ ВИЧ на основе фенилоксиэтил-производных урацила. 89
3.5 Производные пиримидинов на основе трех дистальных циклов 94
3.6 Ингибиторы ОТ ВИЧ на основе N1,N3-замещенных урацилов 95
3.7 Урациловые ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 на основе 2 ароматических систем и карбоциклического фрагмента. 107
3.8 Ингибиторы ОТ ВИЧ на основе N1,N3-замещенных урацилов и амидного линкера. 108
3.9 Ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 на основе 6-бензилизоцитозинов. 112
4. Материалы и методы 117
4.1 Использованные бактериальные культуры 117
4.2 Получение компетентных клеток E. coli 117
4.3 Бактериальна трансформация методом теплового шока 118
4.4 Манипуляции с плазмидной ДНК 118
4.5 Препаративное выделение плазмид из Е.coli 119
4.6 Получение мутантных вариантов ОТ ВИЧ-1 119
4.7 Экспрессия и выделение дикого типа ОТ ВИЧ-1 в виде гетеродимера 121
4.8 Экспрессия и выделение дикого типа ОТ ВИЧ-1 в виде гомодимера 123
4.9 Экспрессия и выделение гетеродимера мутантных форм ОТ ВИЧ-1 1 4.10 Получение активированной ДНК 124
4.11 Определение активности ОТ ВИЧ-1 124
4.12 Определения зависимости включения [-32P]dATP ОТ ВИЧ-1 от времени 125
4.13 Определение ингибирующей активности соединений 125
4.14 Определение механизма действия ингибитора 1 5. ВЫВОДЫ 126
6. Список литературы
- Научная новизна результатов исследования
- Молекулярный механизм полимеразной активности ОТ ВИЧ
- Ингибиторы ОТ ВИЧ на основе N1,N3-замещенных урацилов
- Бактериальна трансформация методом теплового шока
Научная новизна результатов исследования
Обратная транскрипция – многоступенчатый процесс. На рисунке 4 указаны основные стадии синтеза двуцепочечной вирусной кДНК с (+)РНК-матрицы. Вирусный геном представляет собою одноцепочечную РНК, кодирующую три полипротеина (gag, pol, env). Кодирующая область ограничена нетранслируемыми элементами U3-R с 3 -конца и R-U5 c 5 -конца вирусной РНК. В ходе обратной транскрипции в провирусной двуцепочечной ДНК образуются некодирующие повторяющиеся последовательности U3-R-U5 (LTR), необходимые для встраивания в геномную ДНК клетки-хозяина [45].
После распаковки вирусного капсида к вирусной РНК присоединяется праймер – клеточная tRNA3Lys. Место посадки праймера (PBS) расположено на 5 -конце РНК рядом с последовательностью U5. Присоединение тРНК3Lys инициирует реакцию обратной транскрипции (рисунок 4a). Происходит циркуляризация вирусного генома, в результате которой 3 и 5 концы РНК сближаются (рисунок 4b). В каталитическом центре ОТ ВИЧ начинается РНК-зависимый синтез ДНК, при которой РНК матрица подвергается деградации под воздействием РНК-азного домена ОТ (рисунок 4c). После того, как ОТ достигла 5 -конца РНК происходит перенос цепи, ключевую роль в котором играют одинаковые R элементы на 3 и 5 концах РНК (рисунок 4d). В результате переноса (-) цепи ДНК образуется первая последовательность U3-R-U5 (LTR элемент). В процессе деградации (+) РНК сохраняется короткий фрагмент 3 PPT, устойчивый к действию РНК-азного домена ОТ (рисунок 4e). 3 PPT выступает праймером для синтеза (+) цепи ДНК. В середине генома ВИЧ образуется еще один короткий фрагмент, устойчивый к действию РНК-азного домена ОТ – cPPT (рисунок 4f). Начинается синтез (+) цепи ДНК с cPPT (рисунок 4g). Удлинение растущей (-) цепи ДНК
Обратная транскрипция вирусной РНК. (черная линия – вирусная РНК, серая – синтезируемая ДНК, пунктиром обозначена деградация РНК-матрицы под действием РНК-зного домена ОТ ВИЧ) [17] и (+) цепи с 3 PPT приводит к вытеснению тРНК-праймера и копированию 3 конца тРНК и PBS ( (+) и (-) цепями соответственно) (рисунок 4h). Комплементарные участки PBS на (+) и (-) цепи ДНК взаимодействуют, что приводят к переносу (+) цепи ДНК (рисунок 4i). Достройка (-) цепи ДНК от PBS 5 концу и (+) цепи ДНК от cPPT к 3 концу приводит к вытеснению фрагмента U3-R-U5 (LTR), и его образованием на обоих концах кДНК. Терминация (+) цепи от 3 PTT происходит в момент образования перекрывающегося фрагмента ДНК (CF) (рисунок 4 j). Финальным продуктом обратной транскрипции является двуцепочечная линейная ДНК, с обеих сторон которой находятся нетранслируемые поледовательности (LTR), необходимые для интеграции вирусной кДНК в геном клетки-хозяина (рисунок 4 k) [17].
Обратная транскриптаза ВИЧ – ассиметричный гетеродимер, состоящий из двух структурно различных субъединиц p66 и p51. р51 образуется в результате протеолитического процессинга p66. Первичные и вторичные структуры соответствующих фрагментов двух субъединиц идентичны, а вот их третичная структура сильно отличается. Оба каталитических центра (активный сайт полимеризации и центр РНК-азной активности) расположены на большой субъединице p66. p51 выполняет лишь структурную функцию [46-49], тем не менее ряд мутаций в p51 влияют на каталитическую активность ОТ [50]. Структура гетеродимера обратной транскриптазы ВИЧ (p66/p51) имеет форму «правой руки» [51], что сказалось на названиях некоторых субдоменах фермента. В ОТ выделяют следующие субдомены: пальцы (аминокислотные остатки 1-85, 118-155), ладонь (остатки 86-117, 156-236), большой палец (остатки 237-318), соединительный субдомен (остатки 319-426) и субдомен РНК-азы Н (остатки 427-560) (рисунок 5) [49, 52]. Каталитический центр полимеразной активности фермента располагается в районе «ладони» и включает высококонсервативный мотив YMDD, а на расстоянии 10А от него расположен центр связывания ненуклеозидных ингибиторов, имеющий форму кармана (поэтому называется «гидрофобным карманом»). Стоит отметить, что «гидрофобный карман» окончательно формируется только при связывании ненуклеозидного ингибитора с ОТ ВИЧ [48, 53, 54]. Активный центр РНК-азы Н расположен на расстоянии 17-18 пар оснований от полимеразного активного центра. При изучении комплексов РНК-ОТ методом рентгеноструктурного анализа продемонстрировано, что РНКазный домен не может взаимодействовать с матрицей одновременно с полимеразным [55]. Рисунок 5. Организация субдоменов ОТ ВИЧ [56] ОТ связывается с сахарофосфатым остовом нуклеиновой кислоты, поэтому эти взаимодействия носят неспецифичный характер. С областью вблизи полимеразного активного центра рбб-субъединицы взаимодействуют 6 нуклеотидов праймера и 8 нуклеотидов матрицы. Аминокислотные остатки V75, R78, N81, Е89, Р157, G93 взаимодействуют с основаниями матрицы, направляя ее в полимеразный активный центр и формируя участок взаимодействия с праймером [57, 58]. Ароматические аминокислоты W24 и F61 отклоняют выступающий неспаренный 5 конец матрицы за счет стекинг-взаимодействия с нуклеиновыми основаниями [47, 52, 59]. С 3 -ОН концом праймера взаимодействует остаток М184, являющийся частью высоконсервативного мотива в полимеразном активном центре, расположенном в субдомене «ладонь». Сахарофосфатная цепь праймера взаимодействует аминокислотными остатками субдомена «ладонь» р66, образующими участок взаимодействия с ДНК - консервативный мотив [60], содержащий шпильку іЗ- 14, которая направляет 3 -ОН группу праймера в активный центр полимеразы. Важную роль играет аминоксилотный остаток «ладони» Y115, являющийся стерическими «воротами» полимиеразного активного центра. Y115 взаимодействует с рибозным циклом поступающего в активный центр dNTP, накладывая строгие ограничения на конформацию рибозного цикла и на отсутствие 2 -ОН группы, стерически препятствуя проникновению dNTP в активный центр полимеразы [61], и оказывая непосредственное влияние на процессивность ОТ ВИЧ [62]. Нуклеиновая кислота взаимодействует с двумя -спиралями «большим пальца» рбб - аH и аі. аH частично заходит в малую бороздку образующейся двуцепочечной ДНК, а al располагается вблизи сахарофосфатной цепи праймера. С аминокислотами р51, выстилающими «внутреннюю поверхность ладони», взаимодействует РНК матрица. Помимо взаимодействия с р51 отмечается, что половина остатков РНК-матрицы имеют дополнительные контакты с ОТ за счет 2 ОН групп. Кроме взаимодействий вблизи каталитического центра полимеризации ОТ взаимодействует с праймером в районе РНК-азного домена на расстоянии 11-15 нуклеотидов от активного центра полимеразы [63]. Биохимические исследования показывают, что мутации любой из аминокислот участка взаимодействия с ДНК, аH и аі, взаимодействующих с нуклеиновой кислотой, сказывается как на полимеразной активности, так и на РНК-зной активности ОТ ВИЧ [57, 64-67].
Молекулярный механизм полимеразной активности ОТ ВИЧ
Отдельного упоминания заслуживает НИОТ 2-дезокси-4-С-этинил-2-фтораденозин (EFdA). В отличие от остальных НИОТ ВИЧ у него присутствует 3 -OH-группа, хотя он ингибирует ВИЧ в пикомолярных концентрациях [91]. Столь высокая анти-ВИЧ активность вызвана наличием 3 OH группы, что позволяет ему эффективно узнаваться и фосфорилироваться клеточными киназами, а также уникальным механизмом действия [92]. В отличие от остальных НИОТ, прерывающих удлинение праймера в P-комплексе, EFdA является ингибитором транслокации [93]. Такой механизм действия данного НИОТ позволяет ему не только сохранять активность в отношении всех мутантных форм ОТ ВИЧ, как с дискриминационными мутациями, так и с усиленным пирофосфоролизом [91].
ННИОТ представляют собой органические соединения различных классов со значительной долей ароматических гидрофобных радикалов (рисунок 11). Центром связывания ННИОТ является гидрофобный карман ОТ ВИЧ, расположенный на расстоянии 10А от активного центра полимеризации в p66-субъединице. Рентгеноструктурные исследования кристаллов различных комплексов ОТ ВИЧ показали, что гидрофобный карман формируется лишь при связывании ННИОТ и не существует в их отсутствии [94-97]. Карман образован двумя -листами: 6-10-9, 12-13-14, двумя петлями: 100-105 петля p66 и E138 петля p51, и представлен следующими аминокислотными остатками: L100, K101, K103, V106, T107, V108, V179, Y181, Y188, V189, G190, F227, W229, L234, Y318 p66 субъединицы и E138 субъединицы p51 [49, 53]. Ингибирующее действие ННИОТ объясняется различными механизмами. Для невирапина (NVP, см. рисунок 11) показано, что он вызывает изменение положения гидрофобных остатков Y181 и Y188 (рисунок 9). За счет изменения положения этих остатков происходит раздвигание двух элементов третичной структуры белка - -листов 6-10-9 и 12-13-14 относительно друг друга. -лист 6-10-9 содержит каталитическую триаду D110-D185-D186, а -лист 12-13-14 – место позиционирования 3 -OH конца праймера в полимеразной реакции, поэтому при изменения положения этих двух -листов происходит смещение на 4А точки позиционирования праймера относительно каталитического центра фермента, из-за чего утрачивается взаимодействие консервативного каталитического мотива YMDD с концом праймера. В комплексе невирапин-ОТ-ДНК отмечается также утрата взаимодействия между нуклеиновой матрицей и «пальцами» фермента [98].
При исследовании различных комплексов ОТ с нуклеиновой кислотой, ННИОТ и dNTP методом рентгеноструктурного анализа не наблюдалось образования четверного комплекса невирапин-ОТ-ДНК-dNTP. Предположительно P-комплекс с ННИОТ, не позволяют включиться dNМP в растущую цепь за счет изменения положения 3 конца праймера. Так как связывание ННИОТ с гидрофобным карманом ВИЧ является обратимым процессом, то возможен переход из каталитически неактивного P-комплекса в каталитически активный P-комплекс (см. рисунок 7), способный к дальнейшей полимеразной реакции [98]. Наличие НИОТ в достраиваемом праймере приводит к нивелированию вновь обретенной каталитической активности в связи с чем с одновременным применением НИОТ и ННИОТ в ходе высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) (см. ниже) наблюдается как синергетический эффект двух разных классов препаратов, так и возникновение мутантных штаммов вируса, устойчивых одновременно к комбинации препаратов НИОТ и ННИОТ. В частности для комбинации невирапина с азидотимидином синергетический эффект подтвержден биохимически [99] и клинически [100]. Возникновение комбинации резистентных мутаций к обоим механизмам ингибирования ОТ ВИЧ было подтверждено клинически при исследовании тройных коктейлей ингибиторов ВИЧ [101].
Другим механизмом действия ННИОТ является воздействие на динамические взаимодействия ОТ с нуклеиновой матрицей [102, 103]. В отсутствии ингибитора ОТ ВИЧ способна скользить вдоль нуклеиновой матрицы, а связывание с ННИОТ усиливает этот процесс [46, 103]. На примере эфавиренца (EFV, см. рисунок 11) (рисунок 10) доказано, что связывание с ингибитором ведет к раскрытию «руки» и увеличению расстояния между субдоменами «большим пальцем» и «пальцами» ОТ ВИЧ. Смещение в сторону «скользящей» конформации фермента значительно снижает связывание с dNTP. Образование солевого мостика между аминокислотными остатками K101 субъединицы p66 и E138 субъединицы p51 приводит к образованию структуры «открытой руки», что характерно для скользящей конформации, а наличие EFV в гидрофобном кармане стабилизирует эту конформацию фермента. Аминокислотный остаток K103 способствует ориентации K101 в сторону E138, поэтому его замена в случае мутации K103N приводит к разрыву солевого мостика K101-E138 и стабилизации фермента в положении «закрытой руки», что усиливает полимеразную активность. Этим объясняется резистентность мутанта K103N к целому спектру ННИОТ ВИЧ [102].
В настоящее время основным приемом лечения ВИЧ/СПИД является высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) – комплексное применение как минимум 3-х препаратов, направленных на подавление ключевых стадий жизненного цикла вируса. При этом ВААРТ, хотя и оставаясь пожизненной, позволяет подбирать для каждого пациента наиболее подходящую комбинацию препаратов, что увеличивает продолжительность и качество жизни ВИЧ-больных на многие годы. К текущему моменту в терапии ВИЧ применяются 27 препаратов, 9 из которых являются нуклеозидными ингибиторами (НИОТ) обратной транскриптазы ВИЧ, 5 – ненуклеозидными ингибиторами (ННИОТ) ОТ, 9 – ингибиторами протеазы ВИЧ, 2 ингибиторы интегразы ВИЧ и по одному веществу - ингибиторы слияния вируса с клеткой и его проникновения в клетку, соответственно [104]. Наиболее часто используемым режимом ВААРТ является комбинация из двух НИОТ и одного ННИОТ, то есть трёх препаратов, подавляющих каталитическую активность одного белка - ОТ ВИЧ. Подобный подход оправдан ввиду того, что НИОТ и ННИОТ имеют разные механизмы действия, за счет чего достигается синергетический эффект [105]. НИОТ ВИЧ являются «ударным компонентом» терапии, подавляя активность вируса в наномолярных концентрациях. Однако из-за своей невысокой специфичности данный класс препаратов имеет массу побочных эффектов, которые серьезно осложняют терапию ВИЧ-инфицированных пациентов [106]. ННИОТ ВИЧ значительно специфичнее НИОТ, в основе принципа их действия лежит связывание c определенным центром связывания на ферменте, что приводит к неконкурентному ингибированию полимеразной реакции.
Ингибирование обратной транскрипции является одним из ключевых этапов защиты инфицированной клетки, так как происходит до интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина, после чего эрадикация вируса в организме становится невозможной.
Ингибиторы ОТ ВИЧ на основе N1,N3-замещенных урацилов
Одним из наиболее перспективных классов ННИОТ являются диарилпиримидины (DAPY), к которому относятся оба ННИОТ второго поколения - этравирин, одобренный FDA в 2008 году и рилпивирин, одобренный FDA в 2011. Главным преимуществом данного класса является конформационная гибкость, позволяющая соединениям «перестраиваться» и «адаптироваться» к различным аминокислотным заменам внутри гидрофобного кармана. [132] Этот класс соединений появился в результате развития синтетических работ в ряду -анилинофенилацетамидов (-APA) [133], среди которых в результате широкомасштабного скрининга был обнаружен R15345 (1, таблица 2) [134]. В процессе оптимизации структуры был выявлен R89439 (Loviride) (2, таблица 2), проявивший более высокую активность. Ингибитор был отправлен на клинические испытания, в ходе которых у препарата не обнаружилось преимуществ перед невирапином и делавирдином. Дальнейшая работа привела к созданию имидоил-тиомочевинных производных (ITU), наиболее активным из которых был R100943 (3, таблица 2) [135].
R100943 (3) был направлен на клинические испытания, но в дальнейшем снят с них по причине гидролитической нестабильности, вызванной наличием в молекуле имидоил-тиомочевинного фрагмента. Замена тиокето-группы на иминоциано-группу, продиктованная желанием улучшить фармакокинетические свойства соединения, привела к неожиданной циклизации фрагмента и получению производного диарилтриазина (DATA) R106168 (4, таблица 3) с EC50=0,0063 мкМ [136]. Дальнейшие испытания на культуре инфицированных клеток показали, что соединение 4 обладает также и широким профилем резистентности (таблица 3) [137]. Высокая ингибирующая активность соединения в отношении ОТ ВИЧ как дикого типа, так и мутантных форм фермента, устойчивых к действию ННИОТ первого поколения в сочетании с метаболитической стабильностью предрекли дальнейшую работу по улучшению свойств DATA [136].
В ходе дальнейших исследований центральный триазиновый фрагмент был заменен пиримидиновым циклом [138]. Исследования трех изомеров диарилпиримидина (DAPY) (5-7) и производного триазина, показали, что наиболее перспективным является соединение 5, обладающее не только наибольшей антивирусной активность в отношении ОТ ВИЧ дикого типа, но и широким профилем резистентности (таблица 3) [121].
Таблица 3. Ингибирующая активность соединений 4-7 в отношении ВИЧ дикого типа и мутантных форм, устойчивых к ННИОТ [136-138]. Более высокая активность пиримидиновых производных 5 и 6, по сравнению с 7 была предсказана с помощью методов молекулярного моделирования [139]. Согласно этим исследованиям аминогруппа, соединяющая центральный пиримидиновый цикл с 4-циано-бензольным фрагментом, должна образовывать водородную связь с кислородом карбонильной группы основной цепи K101. Атом азота в 1-ом положении соединений 5 и 6 также должен образовывать водородную связь с -аминогруппой K101. Эти предположения полностью подтвердились после получения кристаллов ОТ ВИЧ-1 с TMC120 [121], этравирином [140] и рилпивирином [140, 141].
Установление необходимости для соединений этого типа 2,4-замещенного пиримидина в центральном положении, а также аминогруппы, соединяющей центральный цикл с циано-бензольным фрагментом для высокой анти-ВИЧ активности, позволила перейти к модификации других фрагментов молекулы. Для удобства повествования в дальнейшем, они будут именоваться исходя из обозначений на рисунке 13.
В первую очередь стал вопрос целесообразности наличия в пиримидиновом цикле аминогруппы в 6-ом положении. Согласно данным молекулярного моделирования вклад данной аминогруппы во взаимодействие с гидрофобным карманом представлялся весьма незначительным [139]. Ингибирующая активность полученных соединений 9 и 14 подтвердили эту гипотезу, что привело к созданию множества высокоактивных соединений (таблица 4) [138, 139].
Исследование ингибирующей активности ряда соединений (8-12), в которых варьировались не только заместители во фрагменте А, но и линкер В между бензольным и пиримидиновым циклами, позволило обнаружить определенные закономерности зависимости активности ингибиторов от их структуры. Наибольшую активность проявили соединения, содержащие циано-группу в 4-ом положении бензольного фрагмента A (10, 12). CN
Несмотря на низкую активность в отношении двойного мутанта L100I+K103N соединения 10, 12 стали основой для дальнейшего развития DAPY [138]. Было высказано предположение ,что циано-группа в пара-положении бензольного фрагмента А взаимодействует с консервативным аминокислотным остатком Trp229 [145]. Взаимодействие с консервативной аминокислотой крайне важно, учитывая факт высокой изменчивости вируса и широкой вариабельности большинства аминокислот гидрофобного кармана ОТ ВИЧ. На основе изучения данных структура-активность [138] и молекулярного моделирования [146] семейства соединений, аналогичных 10, на основе рентгеноструктурного анализа комплексов ОТ ВИЧ с дапивирином (11) [147] был сделан вывод о необходимости структурного фрагмента между бензольным фрагментом А и циано-группой в его пара-положении [148]. Для проверки гипотезы был получен ряд соединений, обладающей высокой анти-ВИЧ активностью не только в отношении дикого штамма ВИЧ-1, но и в отношении штаммов вируса, устойчивых к действию ННИОТ первого поколения (невирапина, делавердина, эфавиренца) (таблица 5). HNL Ж /NH
Бактериальна трансформация методом теплового шока
Структуру HEPT (96) и его многочисленных аналогов можно разделить на 6 элементов, влияющих на ингибирующую активность соединений. N-3 и С-4 положения достаточно консервативны среди всех соединений класса. Связано это с расположением ингибитора в гидрофобном кармане фермента. 96 (HEPT) EC50=7 мкМ Кристаллографические данные о комплексе ОТ ВИЧ с различными соединениями HEPT-класса [172, 173] показали наличие водородной связи между водородом в N-3 положении и основной цепью белка в положении K101, а также взаимодействие кислорода в положении С-4 с основной цепью аминокислоты E138 и аминогруппы K101. Важность отсутствия заместителей в этих положения была подтверждена экспериментально [174]: введение вместо кислорода в положение C-4 различных заместителей привело не только к уменьшению анти-ВИЧ активности, но и к повышению цитотоксичности соединений, а алкилирование N-3 положения вызвало полную потерю ингибирующей активности. Гидроксилировние N-3 положения, наоборот, усиливает взаимодействие ингибитора с гидрофобным карманом (таблица 23), за счет образование водородной связи между основной цепью K101 и гидроксильной группой в N-3 положении [175]. Стоит также отметить, что соединения с гидрокси-группой в N-3 положении на основе 98 показали активность не только в отношении ОТ, но в отношении интегразы ВИЧ, что было использовано при дальнейшей разработке анти-ВИЧ препаратов двойного действия [175-177]. положении С-5 (фрагмент B) привело к созданию значительно более активных соединений, чем исходный HEPT (96). Наиболее активное соединение содержало изопропильный заместитель в положении С-5 (100) [178].
Стоит отметить, что длина и разветвленность алкильного фрагмента сильно сказывается на активности соединений [178]. Так ингибирующая активность росла в ряду Pr Me Et i-Pr. Зависимость ингибирующей активности от длины и разветвленности алкильного фрагмента в положении B была отмечены и для других аналогов HEPT, содержащих в линкере С атом серы (101-104) [179], селена (105, 106) [180], метиленовый фрагмент [181, 182] или кето-группу (107, 108) [183] (таблица 24).
Развитие концепции С-5-изопропилзамещенных урацилов привело к созданию соединения 109, дошедшего до 3 стадии клинических испытаний под названием эмивирин (MKC-442) [184]. Исторически, 109 стало одним из первых клинически значимых ННИОТ. Для него была отмечен не только синергетический эффект с НИОТ азидотимидином (AZT) [185], но и способ ность активировать цитохром Р450, участвующий в метаболизме ингибиторов протеазы ВИЧ [186].
Стоит отметить, что ВИЧ быстро вырабатывает резистентность к 109 за счет мутации Y181C [184], но, так как это весьма распространенная резистентная мутация к ННИОТ ВИЧ первого поколения (невирапин, делавердин), клинические испытания были прекращены из-за финансовой нецелесообразности только после открытия эфавиренца. HN О N
Высокая активность производных HEPT с изопропильным заместителем в положении B получила объяснение после изучения кристаллов комплексов данного класса ННИОТ с ОТ ВИЧ [172, 173]. Заместители в положении B находятся в окружении гидрофобных аминокислотных остатков V106, V179, Y181, Y188, V189 и G190, что предполагает гидрофобную природу заместителя.
Изопропильный заместитель в 5 положении урацила наиболее плотно занимает данный участок гидрофобного кармана, активно взаимодействуя с Y181. Данное взаимодействие вызывает конформационные изменения боковой группы Y181, усиливая взаимодействие последней с ароматическим фрагментом в положении D молекулы ингибитора [172]. Это объясняет и существенный рост анти-ВИЧ активности соединений с изопропильным заместителем в С-5 положении урацила перед соединениями с метильной группой [179, 180], размеров которой недостаточно для подобной конформационной перестройки. Более объемные заместители в положении В, такие как фенилтио-, бензольная, бензоильная, винильная или дифенилвинильная группы крайне негативно сказываются на цитотоксичности соединений и, как правило, малоактивны в отношении ВИЧ дикого типа [187]. При наличии в 5 положении урацильного фрагмента водорода, фтора, хлора и брома соединения либо полностью теряют противовирусную активность [171], либо сильно проигрывают своим алкильным аналогам [188].
Одним из наиболее консервативных элементом соединений семейства HEPT является ароматический цикл в положении С-6 пиримидинового цикла. Кристаллографические исследования HEPT и его аналогов показали, что ароматический цикл в положении D необходим для стекинг-взаимодействий с Y188 [173]. Работа, в которой была проведена замена бензольного цикла в данном положении на алкенильный или циклогексенильный фрагмент полностью согласуется с этими данными: соединения проявили значительно более низкую активность, чем их ароматические аналоги [189] (таблица 25). испытания проводились на линии клеток MT-4