Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Метапневмовирусная инфекция 11
1.1. Структура HMPV, организация генома 11
1.2. Генетическое и антигенное разнообразие вируса 14
1.3. Эпидемиологическая характеристика HMPV инфекции 15
1.4. Патогенетические механизмы инфекции 17
1.5. Клинические проявления HMPV инфекции 20
1.6. Ассоциации HMPV с другими возбудителями ОРВИ 23
1.7. Лабораторные методы в диагностике HMPV инфекции 24
1.8. Основные принципы создания вакцин 28
1.9. Спектр исследований по разработке специфических анти-HMPV препаратов 29
Глава 2. Бокавирусная инфекция 31
2.1. Структура вирионов HBoV. Организация генома 32
2.2. Генетическая дивергенция 33
2.3. Циркуляция HBoV в природе 34
2.4. Патогенетические аспекты инфекции 36
2.5. Нозологический спектр и клиническая картина HBoV инфекции 38
2.6. Сочетанные формы инфекции 41
2.7. Методы диагностики 42
Заключение 45
Глава 3. Материалы и методы исследований 46
3.1. Объекты исследований 46
3.2. Методы исследований 50
Глава 4. Изучение особенностей HMPV инфекции 57
4.1. Особенности циркуляции HMPV в Москве 57
4.2. Клиническая характеристика HMPV инфекции у детей 60
4.3. Специфические антитела к HMPV у детей 68
4.4. Чувствительность клеточных линий человека и животных к HMPV 69
4.5. Патогенез HMPV инфекции у белых мышей 74
4.6. Изучение противовирусной активности лекарственных препаратов в отношении HMPV в клетках культуры ткани Chang Conjunctiva и в организме белых мышей 78
4.7. Характеристика штамма HMPV «НМ-1» 87
Глава 5. Клинико-эпидемиологическая характеристика HBoV инфекции 88
5.1. Эпидемиологические особенности HBoV инфекции в Москве 88
5.2. Клиническая характеристика HBoV инфекции в детском возрасте 91
Обсуждение результатов 96
Заключение 105
Выводы 108
Практические рекомендации 110
Список использованных источников 111
- Эпидемиологическая характеристика HMPV инфекции
- Нозологический спектр и клиническая картина HBoV инфекции
- Изучение противовирусной активности лекарственных препаратов в отношении HMPV в клетках культуры ткани Chang Conjunctiva и в организме белых мышей
- Клиническая характеристика HBoV инфекции в детском возрасте
Введение к работе
Актуальность проблемы
Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) имеют наибольший удельный вес в структуре всей инфекционной патологии, поэтому расшифровка их этиологии является одной из актуальных проблем ВОЗ [Селькова Е. П. 2001; Защитников А. Л. 2007; Самсыгина Г. А. 2008; Покровский В. И. 2009]. В России ежегодно регистрируется 27,3-41,2 млн больных ОРВИ, из них 45-60% - дети. Так, за первое полугодие 2009 г заболеваемость ОРВИ составила 10366,9 на 100 тысяч населения [Онищенко Г. Г. 2009].
ОРВИ остаются неконтролируемыми инфекциями, что связано с широким спектром возбудителей, высокой контагиозностью, отсутствием для большинства из них вакцино-профилактики, а также формирующейся резистентностью к лекарственным препаратам [Львов Д. К. 2008; Селькова Е. П. 2008; Самсыгина Г. А. 2008].
К известным возбудителям ОРВИ относятся вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиачьный (HRSV), адено-, рино-, энтеро- и реовирусы. Однако перечисленные инфекционные агенты не исчерпывают всей этиологии ОРВИ. До недавнего времени, несмотря на обширные диагностические исследования, существенная часть инфекций органов дыхания оставалась нерасшифрованной [Liolios L, 2001; Nokso-Koivisto J. 2002]. В течение последних лет были идентифицированы новые, ранее неизвестные возбудители респираторных инфекций [Broor S. 2008; Sloots Т. Р. 2008], к числу которых относятся Метапневмовирус (Human Metapneumovirus, HMPV) и Бокавирус человека (Human Bocavirus, HBoV).
Вирусы впервые были выделены в носоглоточных смывах у детей с острыми респираторными заболеваниями (ОРЗ) неясной этиологии в Нидерландах и Швеции [Van den Hoogen В. G 2001; Allander Т. 2005]. Впоследствии они были обнаружены у людей всех возрастов на всех континентах Земли. В настоящее время многие зарубежные исследователи рассматривают HMPV и HBoV высокозначимыми вирусными патогенами в структуре детской заболеваемости ОРВИ с поражением нижних дыхательных путей (ДП) [Landry М. 2008; Hengst М. 2008; Cilia G. 2008; Esposito S. 2008; Cilia G. 2009; Garcia M. 2009]. Вместе с тем HMPV способен проникать в ЦНС с развитием тяжелых энцефалитов [Schildgen О. 2005]. О способности HBoV вызывать системную инфекцию свидетельствуют данные по обнаружению ДНК HBoV в крови, кале, моче и жидкости из среднего уха [Lindner J. 2008].
Ретроспективные серологические исследования сывороток крови, полученных от больных ОРЗ, позволили установить, что HBoV циркулирует в популяции людей, по крайней мере, более 10 [Zhao L. Q. 2009], a HMPV - более 50 лет [Мажуль Л. А. 2007]. Причины столь позднего открытия этих вирусов связаны с длительностью периода развития инфекции и отсутствием цитопатического эффекта (ЦПЭ) в большинстве чувствительных к HMPV клеточных культур [Hamelin М. Е. 2004; Lin F. 2008; Dijkman R. 2009; Maranich A, 2009].
Эпидемиологические и клинические исследования новых инфекций в нашей стране только начинаются [Швец Е. Ю. 2009; Евсеева Е. Л. 2009].
В связи с этим актуальной является проблема определения эпидемиологических особенностей циркуляции новых вирусов, нозологических форм заболеваний, ассоциированных с ними, поиска чувствительных к вирусам клеточных систем различного видового и тканевого генеза. Решение указанной проблемы позволит получить вирусы, специфические антитела к ним, использовать их в ИФА для мониторинга инфекций у
пациентов в РФ, исследовать патогенез инфекции, а также проводить скрининг лекарственных препаратов с целью оценки их профилактической и терапевтической эффективности.
Цель исследования: определение значения HMPV и HBoV в этиологии респираторных заболеваний у детей в России, изучение патогенетических и клинических особенностей HMPV-и HBoV-инфекций, а также изучение эффективности широко используемых в клинической педиатрии лекарственных препаратов в отношении HMPV.
Задачи исследования
Определение частоты изолированных и сочетанных форм HMPV и HBoV инфекций у детей разного возраста, госпитализированных в клиники Москвы с диагнозом ОРВИ; идентификация клинических особенностей течения HMPV и HBoV моно- и ко-инфекций;
Вьивление эпидемиологических особенностей циркуляции HMPV и HBoV за период 2003-2009 гг.; изучение популяционного иммунитета к HMPV;
Определение спектра пермиссивных к HMPV клеточных культур;
Моделирование HMPV инфекции на мышах с последующим изучением патогенеза;
Сравнение эффективности противовирусного действия лекарственных препаратов Арбидол, Оциллококцинум и Рибавирин в отношении HMPV.
Научная новизна
У детей, госпитализированных в клиники Москвы с диагнозом ОРВИ, установлена важная роль новых вирусов в этиологии отдельных нозологических форм инфекций, изучены эпидемиологические закономерности циркуляции HMPV и HBoV и выявлены клинические особенности ассоциированных с ними моно- и ко-инфекций.
При серологическом исследовании сывороток крови детей в возрасте от 1 месяца до 15 лет установлено, что 40% детей к началу второго года жизни и 60,9% детей к 5-летнему возрасту имеют антитела к HMPV.
Впервые показано, что HMPV активно реплицируется в клетках конъюнктивы человека Chang Conjuctiva и почки кошки CRFK.
Впервые в России выделен вирус HMPV от ребенка с ОРВИ, депонирован в Государственную коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, депонент «НМ-1» № 2476.
Апробировано использование белых мышей для моделирования HMPV инфекции, изучены некоторые особенности патогенеза инфекции.
Показана эффективность лекарственных препаратов Арбидол и Оциллококцинум в отношении HMPV.
Практическая значимость
Штамм HMPV «НМ-1» депонирован в Государственную коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, депонент № 2476.
Применение выделенного в ходе настоящей работы штамма «НМ-1» и высокоактивных антител к нему позволяет вести мониторинг заболеваний, ассоциированных с HMPV.
Создание экспериментальных моделей in vitro и in vivo дает возможность изучения патогенетических аспектов HMPV инфекции, скрининга лекарственных противовирусных препаратов и создания диагностических тест-систем.
Выявленные клинико-эпидемиологические особенности HMPV и HBoV инфекций способствуют своевременной диагностике заболеваний.
5. Высокая эффективность препарата Оциллококцинум против HMPV обусловливает возможность его применения в клинической практике для профилактики и лечения заболеваний у детей.
Основные положения, выноснмые на защиту
Этиологическая структура ОРЗ у детей, госпитализированных в стационары г. Москвы, представлена в 8,3-14,2% HMPV и в 13,5-17,0% HBoV инфекциями. Циркуляция HMPV и HBoV круглогодичная, пики активности приходятся на периоды с марта по июнь и с сентября по декабрь.
Основными нозологическими формами HMPV инфекции являются бронхиты, пневмонии и бронхиолиты, HBoV инфекции - обструктивные ларинготрахеиты. Наиболее восприимчивы к HMPV и HBoV дети раннего возраста.
Чувствительными к HMPV являются клетки перевиваемых линий человека и животных: Chang Conjunctiva, А549, Нер-2, НТ29, CRFK, СПЭВ, ВНК-21, Vera, и LLC-MK2. Наиболее активно HMPV накапливается в клеточной линии CRFK.
Инфицирование HMPV белых беспородных мышей приводит к появлению маркеров инфекции: накопления вируса в легких и выработки специфических антител.
Препараты Оциллококцинум и Арбидол способны подавлять размножение HMPV в культуре клеток Chang Conjunctiva и при экспериментальной инфекции у белых мышей.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на Международном конгрессе «Стратегия и тактика борьбы с внутрибольничными инфекциями на современном этапе развития медицины», Москва, 2006 г.; IX съезде Всероссийского научно - практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения РФ», Москва, 2007 г.; VII и VIII конгрессах детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва, 2008 и 2009 гг.; I Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2009 г.; II Ежегодной конференции молодых ученых НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского, Москва, 2009 г.; IV Европейском педиатрическом конгрессе Europaediatrics, Москва, 2009 г.; XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2009 г.; X Международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI веке", Москва, 2009 г.
На IV Европейском педиатрическом конгрессе Europaediatrics (Москва, 2009) стендовый доклад по теме диссертации вошел в 20 лучших из более чем 500 представленных; на VIII Конгрессе детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики» (Москва, 2009) доклад на конкурсе молодых ученых удостоен диплома за 1 место.
В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отделов экологии вирусов с Центром по экологии и эпидемиологии гриппа, отдела общей вирусологии и апробационного совета НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 28 января 2010 года.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 8 - в материалах международных и российских конгрессов и съездов.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 134 листах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, содержащего 278 источников, из них 23 отечественных и 255 зарубежных. Иллюстративный материал представлен 22 таблицами и 25 рисунками.
Эпидемиологическая характеристика HMPV инфекции
С момента открытия HMPV в 2001 году вирус был выделен у людей всех возрастов и идентифицирован на всех континентах [Rao В. L. et al. 2004; Kim Y. К. et al. 2005; Acosta B. et al. 2006; Мажуль Л. А. и др. 2007; Tecu С. et al. 2007; Brooks A. et al. 2007; Papa A. et al. 2008; Aberle S. W. et al. 2008; Ruohola A. et al. 2009; Pavlova S. et al. 2009].
Доля HMPV в структуре ОРЗ была определена во многих исследованиях, в основном используя молекулярные методы диагностики. У детей младшего возраста, госпитализированных с респираторными заболеваниями, этот вирус обычно выявляется в 5-12% случаев [Мажуль Л. А. и др. 2007; Banerjee S. et al. 2007; Heininger U. et al. 2009]. Однако в исследовании, проведенном в Италии, уровень госпитализации по поводу HMPV инфекции варьировал от 7 до 43% [Maggi F. et al. 2003]. Процент детекции HMPV у взрослых обычно ниже, чем у детей, и составляет от 0,8 до 9% [Crow Е. J. et al. 2004; Falsey A. et al. 2008; Ren L. et al. 2009]. Лица мужского и женского пола болеют с одинаковой частотой [Нага М. et al. 2008; Zou L. R. et al. 2009].
Большинство респираторных заболеваний, ассоциированных с HMPV, встречается у детей первых 2 лет жизни [Acosta В. et al. 2006; Нага М. et al. 2008; Xing J. M. et al. 2008; Heininger U. et al. 2009; Zou L. R. et al. 2009]. Данная возрастная категория представляет группу риска по развитию тяжелой инфекции, ассоциированной с этим парамиксовирусом. Установлено, что HMPV циркулирует на протяжении всех календарных месяцев и имеет выраженное сезонное распределение, перекрывающее циркуляцию HRSV [Boivin G. et al. 2003; Hamelin M. E. et al. 2004; Esper F. et al. 2004]. Пик активности в странах с умеренным и умеренно-континентальным климатом определяется в зимнее и/или весеннее время года [Maggi F. et al. 2003; van den Hoogen et al. 2003; Hamelin M. E. et al. 2004; Aberle S. W. et al. 2008; Heininger U. et al. 2009]. В тропических и субторопических регионах — весной — в начале лета и/или осенью [Peiris J. S. et al. 2003; Acosta B. et al. 2006; Wang H. С et al. 2008; ZouL. R. et al. 2009].
Данные из различных географических зон свидетельствуют о том, что в течение одного и того же эпидемического сезона могут циркулировать как один генетический субтип HMPV [Мао Н. W. et al. 2008], так и одновременно несколько различных подтипов HMPV [Crow Е. J. et al. 2004; Hamelin М. Е. et al. 2004; Broor S. et al. 2008; Wang H. С et al. 2008; Escobar C. et al. 2009; Oliveira D. B. et al. 2009]. При этом спектр циркулирующих вариантов HMPV непостоянен. Так, например, исследования, проведенные в течение 3 лет в одном из населенных пунктов в Южной Африке, выявили картину постепенного замещения одних вариантов вируса другими [Ludewick II. P. et al. 2005]. Из штаммов IIMPV, выделенных в 2000 г., 73% были типированы как В2 и 27% — как А2. В 2001 г. была отмечена ко-циркуляция штаммов, относящихся к субтипам А1 (68%), А2 (21%) и В2 (12%). Эпидемия 2002 г. была вызвана в основном вирусами А1 (83%), и лишь у небольшого числа больных была выявлена инфекция, вызванная вариантом А2 (17%). Необходимо отметить, что подобная картина исчезновения одного типа/субтипа вируса и появления нового преобладающего варианта вируса в одном и том же сообществе характерны не только для HMPV, но и для HRSV-инфекции [Hamelin М. Е. et al. 2004].
Также представляется важным, что штаммы HMPV, идентифицированные в одной местности, могут вполне совпадать со штаммами, выявленными в других местностях в разные годы. Например, прототип штамма, идентифицированного в Нидерландах, генетически сходен с таковым, обнаруженным в Австралии; городах Нью-Хейвен (штат Коннектикут) и Квебек (Канада) - в разные годы. [Esper F. et al. 2004]. Хотя официально исследования механизмов передачи HMPV выполнены не были, предполагается, что трансмиссия осуществляется преимущественно воздушно-капельным и, вероятно, контактно-бытовым путем [Broor S. et al. 2008].
В нескольких странах были зарегистрированы вспышки HMPV инфекции в детских и взрослых больницах и домах престарелых, свидетельствующие о нозокомиальнойтрансмиссии HMPV [Boivin G. et al. 2007; Tu С. С. et al. 2009; Kim S. et al. 2009]. Интересными оказались данные филогенетического анализа, показавшие присутствие 2 разных штаммов HMPV, циркулировавших одновременно в разных отделениях больницы во время одной и той же вспышки [Boivin G. et al. 2007; Kim S. et al. 2009]. Среди детей, включая пациентов, находящихся в палатах гемато-онкологического отделения, летальных случаев не отмечено [Ти С. С. et al. 2009]. Напротив, 10,3% больных преклонного возраста скончались вследствие тяжелой дыхательной недостаточности [Boivin G. et al. 2007; Ти С. С. et al. 2009]. Наличие у пожилых людей факторов риска, таких как хронические легочные заболевания и иммунодефицит, может увеличивать риск летального исхода вследствие HMPV инфекции до 50% [Falsey A. R. et al. 2008].
Сероэпидемиология. Выявление антител к HMPV в сыворотках крови, полученных от больных ОРИ с 1958 года в разных странах мира, свидетельствует о том, что HMPV не является новым инфекционным агентом и циркулирует среди людей, по меньшей мере, в течение последних 50 лет [Hamelin М. Е. et al. 2004].
Изучение иммунного ответа при HMPV-инфекции обнаружило, что к 5-6 годам жизни почти все, а к 10 годам все дети приобретают антитела к этому вирусу [Van den Hoogen В. G. et al. 2001; Ebihara T. et al. 2003; Hamelin M. E. et al. 2004; Leung J. et al. 2005; Zhang Q. et al. 2008] и, согласно данным тестирования сывороток крови взрослых людей, сохраняют их на протяжении всей последующей жизни [Van den Hoogen В. G. et al. 2001; Ebihara T. et al. 2003; Leung J. et al. 2005]. Кроме того, HMPV-специфические антитела были выявлены более чем у 90% младенцев первых двух месяцев жизни, демонстрируя трансплацентарную передачу от матери к ребенку [Leung J. et al. 2005]. Случаи HMPV-инфекции у взрослых позволяют предположить, что, несмотря на широкое распространение HMPV-инфекции в детстве, ре-инфекции могут случаться в течение последующей жизни вследствие ослабления общего иммунитета, снижения специфического иммунитета и/или заражения новыми вариантами вируса.
Для изучения патогенеза HMPV инфекции было использовано множество животных моделей. Показана возможность инфицирования целого ряда лабораторных животных, включая морских свинок, мышей, хлопковых крыс и других мелких грызунов и их способность поддерживать репродукцию HMPV [Wyde P. R. et al. 2005; Boukhvalova M. S. et al. 2009]. Помимо этих животных, данный парамиксовирус способен также инфицировать приматов, включая cynomolgus и rhesus макак, африканских зеленых мартышек и шимпанзе [Kuiken Т. et al. 2004; MacPhail М. et al. 2004]. Большинство экспериментов ставится на мышах линии BALB/c и хлопковых крысах. HMPV в организме этих животных провоцирует развитие воспалительных изменений со стороны нижних отделов респираторного тракта, приводит к потере в весе и изменениям шерсти, подобно HRSV. Однако репликация HMPV и выраженность воспалительного ответа в несколько раз ниже по сравнению с HRSV [Darniot М. et al. 2009].
Представляет интерес тот факт, что HMPV персистирует в легких BALB/c мышей в течение нескольких недель после инфицирования, несмотря на присутствие нейтрализующих антител [Alvarez R. et al. 2005; Williams J. V. et al. 2005 (б)]. Кинетика репликации HMPV в легочной ткани этих животных характеризуется бифазным накоплением вируса с пиками на 7 и 14 дни после заражения. Исчезновение вируса из легких отмечается к концу второго месяца после заражения, однако РНК вируса выявляется в легочной ткани вплоть до 6 месяцев. При этом вирус или вирусная РНК не обнаруживается в сыворотке, селезенке, почках, сердце, трахее и мозге. Специфические антитела против HMPV появляются в сыворотке крови на 14 день и достигают максимума к 28 дню после заражения [Alvarez R. et al. 2004].
Нозологический спектр и клиническая картина HBoV инфекции
Несмотря на массу исследований, клинический спектр HBoV остается не вполне ясным. Во-первых, это связано с тем, что данный патоген, впервые обнаруженный в респираторных образцах, был предварительно отнесен к группе респираторных вирусов, и каскад последующих исследований включал детей с заболеваниями дыхательной системы. Во-вторых, отмечается большой процент сочетанных инфекций, в которых роль HBoV также до конца не ясна. Однако не следует упускать из внимания тот факт, что HBoV идентифицируется у детей с респираторными инфекциями, в этиологии которых ни один из известных патогенов установлен не был.
HBoV и заболевания дыхательной системы. Наибольший удельный вес HBoV имеет в структуре респираторной заболеваемости детей [Lindner J. et al. 2008 (а)]. Данные относительно распределения вызываемой этим вирусом инфекции среди заболеваний верхних и нижних ДП весьма вариабельны. Так, по результатам разных исследований, дети с ОРЗ HBoV этиологии имеют заболевания нижних отделов респираторного тракта в 0-76% случаев [Manning А. 2007; Naghipour М. et al. 2007; Ou S. Y. et al. 2009]. В России, например, Швец Е.Ю. и соавторы [Швец Е. Ю. et al. 2009] определили, что среди больных моно-HBoV инфекцией превалируют ОРЗ верхних ДП, в частности, ринофарингиты - 75,2%. Однако, столь высокий показатель может быть обусловлен спектром клинических диагнозов детей, вошедших в это исследование (отсутствие пациентов с бронхиолитами и пневмониями).
В Германии, из 162 детей, госпитализированных с тяжелыми инфекциями респираторного тракта, требующими в большинстве случаев оксигенотерапию, HBoV был выявлен в 17 (9,8%) образцах, из них в 8 (47,1%) случаях как моновирусная инфекция [Hengst М. et al. 2008].
Основными клиническими симптомами позитивных по HBoV больных являются кашель (78%), лихорадка (67%), боль в горле (44%), реже - головная боль (22%), тошнота (17%) и миалгия (11%) [Львов Д. К. и др. 2008], также описаны петехиальная сыпь (на фоне тромбоцитопении) и даже клинический сепсис [Garcia М. L. et al. 2009]. При этом у детей часто отмечается гипертермический синдром [Lin F. et al. 2007; Швец Е.Ю. 2009; Garcia М. L. et al. 2009] и около 50% больных до 5 лет подлежат госпитализации в связи с поражением нижних ДП (пневмония, бронхиолит) [Chow В. D. et al. 2008; Garcia М. L. et al. 2009; Albuquerque M. M. et al. 2009], в ряде случаев в палаты интенсивной терапии [Chow В. D. et al. 2008]. На рентгенограммах детей с HBoV инфекцией определяются перибронхиальные и легочные инфильтраты, а в крови - умеренно повышенные уровни маркеров воспаления [Hengst М. et al. 2008].
Важное место в клинике HBoV инфекции занимает обструктивный синдром [Volz S. et al. 2007; Garcia M. L. et al. 2009; Швец E. Ю. et al. 2009], в некоторых случаях имеющий рецидивирующий характер [Garcia М. L. et al. 2009]. Высокая частота симптомов поражения нижних ДП, сопровождающихся синдромом обструкции, позволила предположить, что HBoV может являться триггером бронхиальной астмы [Alvarez R. et al. 2004]. Mandelcwajg А. и коллеги [Mandelcwajg A. et al. 2009] обследовали детей с острыми приступами астмы. Результаты показали, что HBoV достоверно чаще встречается среди госпитализированных пациентов (12%), чем среди амбулаторных (3%). Авторы пришли к заключению, что парвовирус способен провоцировать обострения бронхиальной астмы у детей, в большинстве случаев требующих терапевтической помощи в условиях стационара. Имеются данные по обнаружению HBoV у детей первых двух месяцев жизни, госпитализированных с ОРЗ (6,1%). Клиническими особенностями HBoV инфекции в этом возрасте были значительное затруднение носового дыхания и диспноэ на фоне выраженного катара верхних ДП [Souza Е. L. et al. 2009].
Таким образом, в структуре респираторной заболеваемости нижних ДП у детей HBoV имеет значительный удельный вес [Sloots Т. P. et al. 2008; Chow В. D. et al. 2008; Brodzinski H. et al. 2009], и несколько групп исследователей даже определили новый парвовирус в качестве одного из наиболее часто встречающихся респираторных патогенов [Hengst М. et al. 2008; Esposito S. et al. 2008; Cilia G. et al. 2008; Garcia M. L. et al. 2009].
Частота выявления HBoV среди взрослых с респираторными инфекциями незначительна (около 1,5%). Например, среди 143 взрослых больных ОРИ, HBoV был обнаружен лишь у 2 [Ebihara Т. et al. 2005]. По данным Ringshausen FC, среди взрослых пациентов с обострением хронических бронхолегочных заболеваний процент детекции данного вируса также низкий (0,7%) [Ringshausen F. С. et al. 2009]. Chow В. D. и его коллеги выявили, что все HBoV-позитивные взрослые пациенты имели в анамнезе хронические заболевания легких и половина из них — заболевания сердца (50%). Все указанные больные были госпитализированы, но при этом никто не требовал интенсивной терапии [Chow В. D. et al. 2008]. На основании этих данных можно предположить, что у взрослых людей HBoV инфекция встречается редко и протекает достаточно благоприятно.
Имеются случаи выявления HBoV в респираторных образцах у детей и взрослых со злокачественными заболеваниями крови, ВИЧ-инфекцией, Т-клеточным иммунодефицитом, трансплантатами костного мозга. Однако такие случаи редки. Например, из 128 взрослых пациентов с острыми лейкозами и пневмонией лишь у 1 пациента была выявлена HBoV-инфекция [Miiller A. et al. 2009]. В клинической картине иммунокомпро-метированных больных с HBoV инфекцией имели место лихорадка [Schenk Т. et al. 2007 (а)], симптомы поражения верхних и нижних дыхательных путей [Garbino J. et al. 2008, Koskenvuo M. et al. 2008; Miiller A. et al. 2009], пароксизмы, гастроинтестинальные симптомы [Koskenvuo M. et al. 2008; Miiller A. et al. 2009] и признаки поражения печени [Kainulainen L. et al. 2008]. При исследовании цельной крови иммуно компрометированных детей HBoV был обнаружен в 2,6% случаев. [Tozer S. J. et al. 2009]. Роль HBoV как основного патогена в таких случаях остается под сомнением, и, соответственно, вопрос об иммунокомпрометированности как факторе риска развития тяжелой HBoV-инфекции остается открытым. В группу риска, по-видимому, можно отнести детей, имеющих в анамнезе недоношенность и кардиальную патологию. Так, изучив истории болезней детей с тяжелым течением HBoV инфекции, ученые выявили, что 31,3% из них были недоношенными и 18,8% имели сердечные заболевания [Chow В. D. et al. 2008].
HBoV и острые отиты. В ряде статей указывается на связь изучаемого парвовируса с отитами. В Японии ученые исследовали 176 образцов жидкости из среднего уха от детей с острыми средними отитами. HBoV был идентифицирован у 6 (2.7%) детей. По мнению авторов, HBoV способен ухудшать клинические симптомы и пролонгировать течение среднего отита у детей, а также провоцировать присоединение вторичной бактериальной инфекции (S. pneumonia) [Beder L. В. et al. 2009].
HBoV и гастроэнтериты. Сообщения о детекции нового парвовируса у детей в кале появились в литературе не так давно. Большинство исследований направлено на изучение распределения HBoV инфекции в структуре заболеваний ЖКТ. Суммарный анализ литературных источников показал, что среди детей с изолированными симптомами гастроэнтеритов, ДНК HBoV в образцах стула определяется достаточно редко - в 2-9% случаев [Сатре Н. et al. 2008; Tozer S. J. et al. 2009; Szomor K. N. et al. 2009; Huang Y. et al. 2009]. При этом снова следует подчеркнуть, что диапазон частоты детекции HBoV может быть ложным в силу применения в исследованиях неоптимальных праймеров. Клинических особенностей гастроэнтеритов, вызванных HBoV, в литературе не описано.
Изучение противовирусной активности лекарственных препаратов в отношении HMPV в клетках культуры ткани Chang Conjunctiva и в организме белых мышей
Наибольшей противовирусной активностью in vivo по данным ИФА обладал Оциллококцинум, вызывая подавление репродукции HMPV в легких мышей на 53,2- 68,9% в зависимости от времени после инфицирования. Референс-препарат Рибавирин менее активно ингибировал репродукцию HMPV — через 72 ч после инфицирования на 28,7%, а через 120 ч - на 40,7%. Минимальное снижение вирусной активности вируса в легких мышей отмечалось при использовании препарата Арбидол. На 3 сутки после инфицирования препарат снижал вирусную активность на 31,3%, а на 5 —лишь на 25,7%.
Изучение влияния препаратов Арбидол, Оциллококцинум и Рибавирин на динамику и уровень репродукции HMPV в легких белых мышей выявило, что Оциллококцинум в изученных дозах па протяжении всего срока наблюдения наиболее эффективно подавлял репродукцию вируса в легких белых мышей.
Таким образом, HMPV занимает важное место в структуре заболеваний дыхательных путей в детском возрасте: с этим вирусом ассоциировано 12% госпитализаций детей с респираторной патологией за период с 2003 по 2009 гг. в г. Москве. Циркуляция HMPV отмечается на протяжении всех календарных месяцев. Подъем заболеваемости регистрируется с сентября по декабрь и с марта по июнь. В 61,3-75,8% случаев HMPV формирует ассоциации с другими респираторными вирусами, наиболее часто — с вирусами гриппа и HRSV.
Установлено, что наибольший удельный вес (27,2%) HMPV имеет в структуре патологии нижних ДП. Основными нозологическими формами инфекции являются бронхиты, пневмонии (29,2%о) и бронхиолиты (16,7%). Наиболее восприимчивы к HMPV дети грудного возраста. Серологическое исследование показало, что 54,5% детей к 3 годам жизни и почти 2/3 (60,9%) детей к 5-летнему возрасту имеют доказательства перенесенной HMPV инфекции.
Клиническая манифестация HMPV инфекции подобна HRSV, однако в ряде случаев HMPV может вызывать патологию не только органов дыхания, но и ЦНС. Ко-инфекции HMPV с вирусами гриппа и парагриппа протекают тяжелее, чем аналогичные моно-инфекции.
При культивировании HMPV на клеточных линиях различного видового и тканевого генеза установлено, что пермиссивными к вирусу из линий человека являются Chang Conjunctiva, А 549, НТ-29, Hep 2, из линий животных - CRFK, LLC-MK2, Vero, СПЭВ и ВНК-21. Сравнительное изучение показало, что культура клеток почки кошки CRFK наиболее чувствительна для HMPV: регистрируются более раннее начало репликации (с 4 дня после инфицирования) и высокий уровень вирусной нагрузки ( 0,83 lg). Однако ЦПЭ не имеет характерных для HMPV особенностей, и, как следствие, единственным способом установить его природу является исследование инфицированных супернатантов клеточных культур на присутствие РНК- и ДНК-содержащих вирусов в ПЦР.
При моделировании экспериментальной HMPV инфекции in vivo установлено, что при интраназальном заражении белых мышей HMPV проникает в легкие, где уже на 3 сутки накапливается в титрах, доступных для детекции в ПЦР. Продемонстрирована бифазная кинетика репликации вируса в легких животных на 5 и 28 дни после заражения. Установлено, что, несмотря на значительное повышение вирусной нагрузки HMPV в легочной ткани на 28 день, вес инфицированных животных к этому сроку нарастает в 1,7 раз по сравнению с исходным. Титр специфических антител достигает максимальных значений на 32 сутки после инфицирования мышей.
Впервые показана активность против HMPV лекарственных препаратов Арбидол и Оциллококцинум in vitro и in vivo. Под действием препаратов инфекционная активность вируса на клеточной линии Chang Conjunctiva снижалась незначительно (на 1,5-1,0 lg). На модели in vivo наиболее эффективным оказался Оциллококцинум, который подавлял репродукцию HMPV в легких белых мышей на 2,1 lg через 3 суток после инфицирования и на 3,7 lg через 5 суток. Штамм «НМ-1» ГКВ № 2476 HMPV сем. Paramyxoviridae, рода Metapnemovirus. HMPV вьщелен из носоглоточного смьгеа ребенка на второй день болезни с диагнозом ОРВИ на культуре клеток CRFK. После 8 пассажа на той же клеточной линии вирус репродуцируется до инфекционного титра 6,0 TCID 5о /мл.
Цитопатогенное действие вируса проявляется в слабой степени с 4 дня после инфицирования и достигает 80%-90% к 12-14 дню. ЦПЭ HMPV не имеет характерных особенностей отличных от других ОРВИ и активность вируса определяется в ОТ-ПЦР. HMPV идентифицировали с использованием тест-системы ООО «Биоком» в соответствии с рекомендациями производителя (электорофореграмма).
Штамм «НМ-1» взаимодействовал в ИФА с сывороткой крови ребенка на 12 день болезни в титре 1:80 при полном отсутствии реакции с сывороткой крови, полученной в первый день поступления в больницу. Четырехкратный прирост титра антител в парных сыворотках свидетельствует об аутентичности выделенного от этого пациента вируса. Полученный вариант HMPV нейтрализуется антителами в сыворотке крови инфицированного ребенка в реакции биологической нейтрализации и сам способен индуцировать выработку антител в организме иммунизированных животных . Иммунная сыворотка кролика реагировала с вирусом в титре 1:320, а в реакции биологической нейтрализации нейтрализовала активность вируса на 6,0 lg.
Штамм «НМ-1» может найти применение в вирусологической практике для изучения противовирусных препаратов in vitro и in vivo и популяционного иммунитета населения с целью надзора за распрстранением HMPV в человеческой популяции.
Эпидемиологические особенности HBoV инфекции в Москве HBoV в структуре респираторной заболеваемости детей. Из 2189 детей в возрасте до 15 лет, находящихся в условиях детских стационаров в связи с ОРЗ, HBoV инфекция была зарегистрирована у 306 (14,0%). Этот процент формируют как моно-(3,9%), так и ко-инфекции (10,1%). Частота MOHO-HMPV и MOHO-HBOV инфекций в общей структуре ОРВИ идентична — 3,9% (рис.7, стр. 56).
В разные периоды исследования частота детекции HBoV варьировала от 9,6% в 2009 г. до 17,0% в 2008 г. (табл. 20). Максимальный процент моно-НВоУ-инфекций зарегистрирован в 2006 г. — 5,0, минимальный - в 2007 г. - 3,1.
Клиническая характеристика HBoV инфекции в детском возрасте
Проведенное нами исследование продемонстрировало, что HMPV может провоцировать у детей развитие заболеваний любых отделов респираторного тракта, однако наиболее часто HMPV инфекция ассоциируется с бронхитами и пневмониями, несколько реже - с бронхиолитами и обструктивными ларинготрахеитами. Общий процент детекции вируса в структуре патологии нижних ДП (27,2%), зарегистрированный в нашей работе, соответствует описанному большинством зарубежных авторов [Peiris J. S. et al. 2003; Williams J. V. et al. 2004; Xing J. M. et al. 2008; Hara M. et al. 2008; Chun J. K. et al. 2009; Calico I. et al. 2009; Escobar С et al. 2009; Oliveira D. B. et al. 2009].
В структуре этиологии острых обструктивных ларинготрахеитов и бронхитов в детском возрасте HMPV преимущественно встречается как моновирусная инфекция. Вирусологический профиль этиологии бронхиолитов и пневмоний представлен в основном ко-инфекциями HMPV с другими респираторными вирусами, чаще с HRSV.
Клиническое исследование показало, что в эпидемический сезон острые ларингиты, ларинготрахеиты и бронхиты в раннем детском и дошкольном возрасте в 97,6% случаев обусловлены вирусными инфекциями.
Наиболее важное место HMPV занимает в этиологии ОРЗ у детей до года: с этим вирусом связано 41,18% всех острых бронхитов среди госпитализированных пациентов грудного возраста. По мере взросления детей частота выявления данного вируса снижается, однако в дошкольном возрасте все же остается существенной — 7,6%. Установленное нами возрастное распределение HMPV инфекции соответствует данным многих авторов [van den Hoogen В. G. et al. 2003; Acosta B. et al. 2006; Hara M. et al. 2008; Xing J. M. et al. 2008; Heininger U. et al. 2009; Zou L. R. et al. 2009]. В исследовании же E. Л. Евсеевой и соавторов [Евсеева Е. Л. 2009] HMPV инфекция наиболее часто регистрировалась у детей от 3 до 7 лет жизни, а группа HMPV инфицированных детей грудного возраста была самой малочисленной.
Клинические проявления HMPV инфекции подобны таковым при HRSV, на что указывают и многие зарубежные источники [Wolf D. G. et al. 2006; Sun H. et al. 2008; Chun J. K. et al. 2009; Milder E. et al. 2009]. Однако в литературе имеются лишь две статьи, описывающие связь HMPV с заболеваниями ЦНС [Kashiwa Н. et al. 2004; Schildgen О. et al. 2005 (б)]. Зарегистрированный в нашем исследовании судорожный синдром у одного из HMPV-инфицированных детей грудного возраста дополняет эти данные. Хотя говорить о достоверной ассоциации изучаемого вируса с патологией ЦНС у наблюдаемого нами ребенка, учитывая гипоксически-ишемическое поражение мозга в анамнезе, неправомочно.
Клиническая картина HMPV инфекции имеет особенности в первые месяцы и годы жизни. У детей в возрасте до 6 месяцев в патологический процесс вовлекаются нижние отделы респираторного тракта, в ранние сроки развивается дыхательная недостаточность, что связано с анатомо-физиологическими особенностями дыхательной системы. Температурная реакция не соответствует тяжести инфекционного процесса. В возрасте от б месяцев до 2 лет заболевания, ассоциированные с HMPV, характеризуются яркостью клинических симптомов: развитием у большинства детей фебрильной лихорадки, симптомов интоксикации и респираторной недостаточности, а также в 18,2% случаев присоединением острых средних отитов.
Наблюдаемая в нашем исследовании ОРВИ сочетанной этиологии (HMPV с вирусом гриппа), осложненная сегментарным ателектазом легкого, позволяет предположить, что ассоциация указанных вирусов утяжеляет течение инфекции. Превалирование в клинике симптомов, в большей степени характерных для HMPV, а не для гриппа, указывает на то, что HMPV выступает в качестве основного патогена, а вирус гриппа — ко-фактора. Относительно ко-инфекции HMPV с вирусом парагриппа, зарегистрированной в клиническом исследовании, можно предположить эффект «комплементации». В пользу этого свидетельствует развитие крупа II степени в 5-летнем возрасте в отсутствии неблагоприятного преморбидного фона, что не характерно для моновирусной инфекции парагриппа или HMPV.
Учитывая важную роль HMPV в этиологии респираторной заболеваемости детей в Москве, представилось необходимым создание экспериментальной модели in vitro и in vivo для изучения патогенеза и лекарственной терапии инфекции. Первым шагом к достижению поставленной задачи было исследование спектра клеточных линий человека и животных на чувствительность к HMPV.
По данным зарубежной литературы, HMPV слабо реплицируется в традиционно используемых для выделения респираторных вирусов клеточных линиях. Явный ЦПЭ наблюдается лишь в третичных клетках почек обезьян LLC-MK2 и некоторых вариантах клеток Vero, QT-35 и А 549 [Landry М. L. et al. 2005; Maranich A. et al. 2009]. Рост вируса в этих тканевых культурах происходит медленно и часто требует 2 недели или более для максимальной репродукции. HMPV способен реплицироваться и в клетках Нер-2, несмотря на отсутствие ЦПЭ [Hamelin М. Е. et al. 2004]. Результаты нашего исследования подтверждают эти данные. Однако, изучение широкого спектра клеточных культур различного видового и тканевого происхождения, проведенное в нашей работе, показало более высокую пермиссивность к HMPV культур клеток Chang Conjunctiva и CRPK. Данные клеточные линии исследовались на способность поддерживать репродукцию HMPV впервые.
При сравнении с культурами клеток Vero и LLC-MK2, применяющимися для рутинной изоляции HMPV за рубежом, нами установлено, что в клетках CRPK отмечается более ранний срок начала и пика репликации, более высокий уровень вирусной нагрузки и, как следствие, большая возможность получения хороших урожаев вируса. Вместе с тем ЦПЭ HMPV в культуре CRPK не имеет характерных особенностей, следовательно, присутствие вируса необходимо подтверждать исследованием супернатантов культуры в ОТ-ПЦР. Исследование кинетики репликации HMPV показало, что в клеточной линии Chang Conjunctiva вирус накапливается приблизительно в тех же титрах, что и в клетках почек эмбрионов макаки-резус LLC-MK2 и почек обезьяны Vero, но начало репликации и пик активности определяются значительно раньше.
Таким образом, результаты проведенной серии экспериментов позволяют считать оптимальными для последующих исследований 2 перевиваемые клеточные линии — Chang Conjunctiva и CRFK. Выделив на данных культурах вирус HMPV, в нашей стране появилась возможность изучения патогенеза HMPV инфекции и патогенеза на экспериментальных моделях in vitro и in vivo.
Согласно данным зарубежной литературы, создание экспериментальной модели HMPV инфекции у животных ограничено узким спектром хозяев. Для изучения патогенеза этой инфекции были использованы различные модели. Вирусная репликация была продемонстрирована в респираторном тракте на морских свинках, хлопковых крысах и других грызунах [Boukhvalova М. S. et al. 2009; Darniot М. et al. 2009]. Показана возможность инфицирования приматов, включая cynomolgus и rhesus макак, африканских зеленых мартышек и шимпанзе [Kuiken Т. et al. 2004; MacPhail М. et al. 2004].
Мы использовали для создания экспериментальной модели HMPV инфекции белых беспородных мышей. В ходе эксперимента было установлено, что данные животные чувствительны к HMPV, репликация в легких мышей характеризовалась двумя пиками активности на 5-7 и 28 дни после заражения, и персистенция вируса в легких отмечалась более месяца. При этом в тканях селезенки, печени и мозга РНК вируса не определялась.
В некоторой степени кинетика HMPV инфекции сходна с таковой HRSV инфекции, продемонстрированной на мышах линии BALB/c: HRSV, введенный интраназально, проникает в легкие и реплицируется до максимальных титров на 5 и 7 сутки после инфицирования [Graham В. S. et al. 1988; Taylor G. et al. 1984]. Однако элиминация HRSV из легочной ткани достигается уже на 7-10 сутки [Graham В. S. et al. 1988].