Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Материалы и методы 46
Краткое описание наиболее важных методов 46
1. Перевиваемые и первичные клеточные линии 46
2. Конструирование плазмид 47
3. Трансфекция и вирусная инфекция 47
4. Стандартизация вирусной инфекции 47
5. Получение и очистка VLP 47
6. Поверхностное иодирование белков оболочки вирусных частиц 48
7. Конструкция рекомбинантных вирусов осповакцины 49
8. РНК и анализ на микрочипах 49
9. Амплификация методом RT-PCR 49
10. Выделение РНК и синтез кДНК 49
11. Количественный анализ RT-PCR 50
12. Последовательности праймеров и зондов 50
13. Изоляция белков липидного рафта 50
14. Внутримышечная иммунизация 51
15. Определение чувствительности ВИЧ/SIV к нейтрализации специфическими антителами или нейтрализующей активности антител 51
16. Оценка показателей клеточного иммунитета 51
17. Определение вируцидной активности кандидатов в микробициды 52
18. Анализ связывания gp120 c CD4 в присутствии кандидатов в микробициды 52
19. Анализ цитотоксичности компаундов 52
ГЛАВА 2. Биологические свойства гликопротеинов ENV 53
2.1. Сборка белков Env с полноразмерным и укороченным цитоплазматическим доменом 53
2.2. Влияние цитоплазматического домена Env на включение гетерологичных белков в оболочку ВИЧ 63
2.3. Влияние Env на вирусную репликацию и чувствительность к нейтрализации 71
2.4. Роль гликопротеина Env на ранних и поздних стадиях SIV инфекции 82
ГЛАВА 3. Влияние цитоплазматического домена гликопротеина env на конформацию функциональных областей gp120 96
3.1. Влияние цитоплазматического домена на стабильность тримеров Env 96
3.2. Влияние цитоплазматического домена на области gp120, ответственные за связывание с рецептором 104
3.3.Влияние цитоплазматического домена на области gp120, ответственные за связывание с корецептором 111
ГЛАВА 4. Модификация гликопротеинов env для создания вакцины против ВИЧ на основе вирусоподобных частиц (VLP)...
4.1. Иммуногенность нативных белков Env SIV 116
4.2.Усиление иммуногенности Env ВИЧ с помощью изменения сигналов эндоцитоза в цитоплазматическом домене 120
4.3.Усиление иммуногенности Env, содержащих мутации, влияющие на гликозилирование 128
4.4. Влияние модификаций цитоплазматического домена на иммуногенность Env 135
4.5. Иммуногенность VLP, содержащих вспомогательные иммуностимуляторы 146
4.6. Индукция специфических иммунных ответов VLP на слизистых оболочках 161
4.7. Использование VLP для создания вакцины против ВИЧ 165
ГЛАВА 5. Разработка микробицидов против ВИЧ-1 172
5.1. Предупреждение инфекции ВИЧ-1 с помощью синтетических порфиринов 174
5.2. Предупреждение инфекции ВИЧ-1 с помощью фталоцианинов. 185
5.3. Предупреждение инфекции ВИЧ-1 с помощью платиновых триазинов 192
5.4. Сульфированные нафтиловые порфирины как средство против ВИЧ-1 198
5.5. Параметры ингибирования инфекции ВИЧ-1 с помощью анионных микромолекул-кандидатов в микробициды 203
Обсуждение 215
Выводы 236
Список литературы
- Поверхностное иодирование белков оболочки вирусных частиц
- Влияние цитоплазматического домена Env на включение гетерологичных белков в оболочку ВИЧ
- Влияние цитоплазматического домена на области gp120, ответственные за связывание с рецептором
- Влияние модификаций цитоплазматического домена на иммуногенность Env
Поверхностное иодирование белков оболочки вирусных частиц
Половой путь передачи – один из основных путей распространения ВИЧ-инфекции во всем мире (UNAIDS, 2012). В более чем 80% вновь выявляемых случаев инфекции ВИЧ-1 заражение происходит во время полового акта. Этот путь инфицирования можно предотвратить с помощью нейтрализующих IgG-антител (NAbs) и секреторных IgA (Mascola and Montefiori, 2010; Watkins et al., 2013). Недавно обнаружены мощные NAbs широкого действия (bNAbs), способные нейтрализовать широкий спектр внеклеточных и клеточноассоциированных штаммов ВИЧ (Walker et al., 2009; Wu et al., 2010; Scheid et al., 2011; Walker et al., 2011; Haynes et al., 2012; Kwong et al., 2012; Klein et al., 2013; Kwong et al., 2013; Mascola and Haynes, 2013; Gruell and Klein, 2014). Эти антитела, как показано, эффективно защищают нечеловекообразных приматов и мышей, несущих функциональные человеческие гены, от экспериментального заражения вирусом (Klein et al., 2012; Klein et al., 2012a; Veselinovic et al., 2012; Barouch et al., 2013; McCoy et al., 2013; Shingai et al., 2013; West et al., 2014). Следует отметить, что bNAbs имеют очень специфические структурные и иммунологические характеристики и их чрезвычайно трудно индуцировать. Только 10–30% пациентов вырабатывают bNAbs (Moog et al., 1997; Burrer et al., 2001; Binley et al., 2008; Sather et al., 2009; Simek et al., 2009), и попытки индуцировать их с помощью вакцинаций закончились неудачно. bNAbs характеризуются необычайно длинными комплементарно обусловленными петлями и экстенсивной соматической гипермутацией, что указывает на необходимость длительного процесса созревания, и делает их индукцию с помощью вакцинаций чрезвычайно сложной. Интересно, что ограниченная защита, составляющая 31%, наблюдалась при испытании вакцины RV144 при отсутствии определяемых титров NAbs в образцах плазмы/сывороток, что указывало, на возможность других защитных функций анти-Env антител (Rerks-Ngarm et al., 2009; Haynes et al., 2012) и что эти дополнительные свойства крайне важны. Появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что Fc-рецептор IgG (FcR) участвует в процессе ингибирования ВИЧ-инфекции антителами, что ведет к фагоцитозу или антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (Рисунок 1). Молекулы FcR экспрессируются на различных антигенпрезентируюших клетках (АРС) и естественных клетках-киллерах (NK), присутствующих на слизистых оболочках. Предполагается, что Fc-опосредованное ингибирование ВИЧ-инфекции реализуется при транслокации вируса через слизистую оболочку. Предполагается, что эти клетки играют решающую роль при половом пути заражения, так как, будучи первыми мишенями ВИЧ, служат воротами инфекции (Shattock and Moore et al., 2003; Hladik et al., 2007; Piquet et al., 2007). В экспериментах in vivo показано, что ВИЧ-специфические антитела, не проявляющие нейтрализующей активности, ингибируют инфекцию по Fc-опосредованному механизму и снижают вирусную нагрузку у вагинально зараженных макак (Burton et al., 2011; Moog et al., 2014). Кроме того, известны и другие защитные функции антител на слизистой оболочке, такие как агрегация, ингибирование с помощью комплемента, ингибирование с помощью индукции антивирусных цитокинов, а также индуцированные цитокины могут способствовать другим анти-ВИЧ защитным механизмам.
Пути проникновкния ВИЧ- 1 через слизистую оболочку и механизмы защиты. Очень мало известно о том, как ВИЧ проникает и инфицирует через слизистые оболочки. Отбор трансмиссивного штамма/основателя, T/F, вируса происходит на слизистых оболочках – основных воротах проникновения ВИЧ (Keele et al., 2008; Wilen et al., 2011; Ochsenbauer et al., 2012; Harman et al., 2013; Parker et al., 2013; Parrish et al., 2013). Слизистые оболочки содержат множество различных клеток иммунной системы, которые служат мишенями ВИЧ: различные типы дендритных клеток (DC), макрофаги, NK-клетки и CD4 Т-лимфоциты (Shattock and Moore et al., 2003; Hladik et al., 2007; Piquet et al., 2007; Haase, 2010; Mesman et al., 2012; Cunningham et al., 2013; Xu et al., 2013). Но точный механизм, который используют вирусные частицы для миграции через эпителиальный барьер, пока неясен. Предположительно существует два основных способа транслокации вируса через эпителиальные клетки: (а) транспорт ВИЧ дендритными клетками, присутсвующими на слизистых оболочках, (б) прямое инфицирование CD4 Т-клеток (Cunningham et al., 2013; Wu et al., 2006; Iwasaki, 2007; Carias et al., 2013; Cavarelli et al., 2013). Помимо прямой инфекции клеток иммунной системы внеклеточным вирусом, межклеточный тип передачи играет важнейшую роль в воспроизводстве ВИЧ и его распространении in vivo. Распространение ВИЧ путем передачи от клетки к клетке в 100–1000 раз эффективнее, чем заражение внеклеточными вирионами (Dimitrov et al., 1993; Carr et al., 1999; Chen et al., 2007; Sourisseau et al., 2007; Martin et al., 2010; Zhong et al., 2013). На слизистой оболочке, помимо CD4 T-клеток, присутствует множество других клеток, которые являются мишенями для внеклеточного или связанного с клетками ВИЧ-1. Ингибирование этих множественных путей заражения связано с различными иммунологическими защитными механизмами (Horton et al., 2013), такими как агрегация sIgA, Fc-опосредованное ингибирование антителами, нейтрализация инфекции CD4 T-клеток, лизис инфицированных клеток под воздействием NK-клеток, фагоцитоз после презентации антигена и, наконец, ингибирование, вследствие производства цитокина и хемокина. Например, ВИЧ-1, захваченный дендритными клетками, может быть блокирован по Fc-опосредованному механизму, в то время, как в ингибирование передачи ВИЧ-1 от дендритных Т-клеткам вовлечены ВИЧ-специфические NAbs (Su et al., 2012). В зависимости от количества и типа ВИЧ-1 и от типа клеток слизистой оболочки, специфические bNAbs принимают участие в ВИЧ-1 ингибировании, используя многочисленные ингибирующие пути и, в дополнение к нейтрализации CD4 T-клеток, зараженных ВИЧ-1, могут привести к снижению концентрации NAbs, необходимой для защиты. Адаптивные иммунные реакции, такие как выработка ВИЧ-1-специфических нейтрализующих IgG, имеют важное значение для предотвращения инфекции, обусловленной внеклеточным ВИЧ-1. Только NAbs способны ингибировать ВИЧ-инфекцию CD4 T-лимфоцитов, в то время, как оба вида, NAbs и FcR-опосредованные ингибирующие антитела, могут ингибировать распространение инфекции через межклеточные пути передачи. Продукция ингибирующих ВИЧ-инфекцию NAbs, эпитопами которых служат сайты связывания вируса с клеточными мишенями, такими как CCR5 или другими рецепторами/корецепторами, – важная цель для рациональной разработки новых вакцин-кандидатов.
Влияние цитоплазматического домена Env на включение гетерологичных белков в оболочку ВИЧ
К сожалению, этот класс препаратов наносит ущерб тканевым поверхностям в организме человека, вызывая воспаления и изъязвления (Stafford et al., 1998). После интенсивного изучения установлено, что использование этого сурфактанта повышает риск приобретения ВИЧ при половом пути передачи (Fichorova et al., 2001; Richardson et al., 2001; van de Wijgert and Coggins, 2002), а потому его разработка как микробицирного препарата не целесообразна.
Вторая группа препаратов включает пептиды и антитела, которые усиливают естественные вагинальные защитные механизмы (Mascola, 2002; Weber et al., 2001). Сложностью в использовании подобных препаратов в качестве вагинальных микробицидов является составление эффективных композиционных форм и способов доставки. К третьей группе относятся неспецифические энхансеры естественных вагинальных защитных механизмов таких как, молочно-кислые бактерии, кислотные буферы и пероксидазы (Clarke et al., 2002). Эти препараты не способны полностью инактивировать индивидуальные вирусные частицы, которые, проникая через трещины или травмированные участки мукозного эпителия, являются потенциальным источником заражения. Четвертая группа включает полимеры такие, как CarraGuard или сульфатный carrageenan (Maguire et al., 1998; Spieler, 2002). Этот вагинальный микробицидальный гель, содержащий экстракт из красных морских водорослей carrageenan, способен блокировать ВИЧ и другие источники инфекционных заболеваний, передающиеся половым путём, in vitro. Другими полимерами, кандидатами в микробициды, являются T-PSS[poly]sodium-4-styrene sulfonate (Herold et al., 2000), PRO 2000, химическое соединение из полимерного сульфированного нафталина (Profy et al., 1998); Ushercell, гель на основе сульфатно-натриевой целлюлозы (Anderson et al., 2002) и высоко сульфатные полианионы, полученные из K5 лоусахарида Escherichia coli (Vicenzi et al., 2003). Однако подобные полимеры не могут оказать полную защиту, т.к. ВИЧ-1 R5-и X4-изоляты способны проникнуть в клетки посредством двух различных механизмов: мембранного слияния и эндоцитоза (Smith and Helenius, 2004). Мембранное слияние, которое считается специфическим процессом для ВИЧ-1, ассоциировано с важнейшей ролью V3 петли поверхностной субъединицы gp120 белка Env и клеточных рецепторов и корецепторов CD4, CXCR4 и CCR5 (Ray and Doms, 2006). Для эндоцитоза V3 петля не является критическим фактором, а множественные факторы прикрепления играют роль (Smith and Helenius, 2004; Bobardt et al., 2004). Взаимодействие полимерных полианионов с V3 петлёй может предотвратить прикрепление вируса к клетке посредством взаимодействия отрицательно заряженных препаратов с положительно заряженными аминокислотами в V3 петле, что является возможным механизмом для ингибирования ВИЧ (Debnath et al., 1994; Neurath et al., 1995; Song et al., 1997). Вирусы, резистентные к полимерным полианионам, демонстрируют снижение количества положительно заряженных аминокислот в V3 петле, которое приводит к снижению инфекционности и способности к слиянию (Bobardt et al., 2004). Очень важной характеристикой микробицидов является способность ингибировать два существующих пути входа в клетку: вхождение в клетку с помощью мембранного слияния и эндоцитоза. Полианионы высокоэффективно ингибируют инфекцию, вызываемую X4 вирусами. С помощью различных подходов показано, что мономерные молекулы gp120 вирусов X4 и R5X4 способны эффективно связываться с полимерными полианионами, в то время как gp120 вирусов R5 связываются с полимерными полианионами сравнительно слабо (gp120Bal) или совсем не связываются (gp120JRFL) (Moulard et al., 2000). Положительный заряд на белке gp120 вируса ВИЧ-X4, использующего CXCR4, значительно выше, чем подобный заряд вирусов R5, использующих для входа в клетку корецепторы CCR5 (Moulard et al., 2000). В работах (Greenhead et al., 2000; Vicenzi et al., 2003; Dezzutti et al., 2004; Scordi-Bello et al., 2005) было показано, что сульфонатные или сульфатные полианионы способны ингибировать R5 вирусы, но только в том случаи, когда клетки экспонированы для вируса в присутствии химического препарата. В этих публикациях отмечено, что полимерные полианионы не взаимодействуют эффективно с положительно заряженными последовательностями R5 вирусов, и R5-вирусы беспрепятственно избегают ингибирующей активности некоторых полимеров. Пятая группа включает ингибиторы, действующие после проникновения вируса в клетку. В тех случаях, когда вирус не блокирован перед проникновением в клетку, он может быть подавлен посредством ингибирования кодируемой вирусом обратной транскриптазы (RT) или интегразы (IN). Целый ряд RT ингибиторов являются потенциальными микробицидами (Balzarini and Van Damme, 2007). Для конвертирования NtRTI tenofovir в активную форму, ему необходимо время для внутриклеточного преобразования, однако, этот препарат обладает высоким генетическим барьером. Оценка генетического барьера базируется на подсчёте мутаций, ассоциированных с резистентностью, которые необходимы вирусу для его нормального функционирования (Beerenwinkel et al., 2005). Ряд специфических ингибиторов ВИЧ-1 NNRTIs обладает преимуществами по сравнению с NtRTI, т.к. они имеют более высокий терапевтический индекс и активны без предварительной модификации в клетке. Недавно разработали новый ингибитор мембранного слияния (fusion inhibitor (FI)) L 644, основанный на последовательности HR2, С34, сконъюгированной с холестериновой группой, функционирующей в качестве мембранного якоря для усиления его функции (Ingallinella et al., 2009; Harman et al., 2012) . Блокирование происходит путем связывания FI с доменами HR1 или HR2 gp41 белка. Ингибитор L 644 более активен, чем другие FI, против вирусного мутанта, резистентного к ингибиторам обратной транскриптазы (reverse transcriptase inhibitors (RTIs); предполагается, что L 644 может быть включён как часть высокоактивного антиретровирусного (antiretroviral - ARV) комбинированного микробицида. Разработка микробицидов основана на предупреждении полового пути передачи ВИЧ. Микробицид с одним механизмом действия не будет эффективен, а только комбинация микробицидов с множественными механизмами действия, нацеленными на разные этапы вирусной репликации, будет являться самой надёжной защитой
Влияние цитоплазматического домена на области gp120, ответственные за связывание с рецептором
Определение физической ассоциации между клеточными белками и ретровирусными частицами может быть осложнено присутствием клеточного дебриса, содержащего белки клеток хозяев (Bess et al., 1997; Gluschankof et al., 1997). В качестве контроля подобной контаминации проведено несколько экспериментов. Первое, мы очищали вирус из супернатанта, полученного после культивирования SIVmac239-трансфицированных HUT78 клеток в течение 3 или 11 недель. Как было детектировано с помощью RT анализа, высвобожденный вирус присутствовал только в образцах, собранных на 11 неделе. Белки SIV, как и клеточные хозяйские белки (HLA-I и HLA-II), были найдены только в образцах полученных после 11 недель и не определялись после 3 недель, представляя доказательства, что клеточные HLA белки не высвобождаются с клеточными компонентами, которые ко-седиментируют с вирионами. Во втором варианте эксперимента, VSV частицы очищали из супернатанта клеток HUT78, заражённых VSV. В вирионах определялись только специфические белки VSV, а потому было сделано заключение, что клеточные HLA белки не включаются в определяемых количествах в вирионы VSV, т.е. эти вирионы не контаминированы клеточными везикулами. В дополнительном эксперименте для определения профиля молекул HLA в вирусной оболочке мы использовали связывающую вирус ELISA (virus binding ELISA). Когда мы использовали одинаковое количество вирусных частиц с полноразмерным и транкированным Env, в соответствии с определённым уровнем Gag белков, одинаковое количество интактных вирионов захватывалось антителами анти-gp41. Количество молекул HLA-II приблизительно в 3 раза больше, чем белков HLA-I в обоих вирусах SIVmac239 и SIVmac1А11. Рисунок 12. Включение HLA-I и HLA-II в SIV частицы. HUT78 заражали SIVmac239 (А, дорожки 1, 2, 5 и 6; B, дорожки 1, 3 и 5) или SIVmac1А11 (А, дорожки 3, 4, 7 и 8; B, дорожки 2, 4 и 6). Через одну неделю нового пассажа, культуральную среду собирали и вирусы очищали в 20-60% (А) или 15-40% и 20-60% (В) сахарозных градиентах. Количество p27 определяли с помощью core antigen ELISA (Immunotech); одинаковое количество вирионов использовали во всех образцах на Рисунке А; одинаковое количество культуральной среды от одинакового количества клеток использовали во всех образцах на Рисунке В. Присутствие белков анализировали с помощью SHPP-125I (А, дорожки 1 и 3). Присутствие белков на вирусной поверхности анализировали с помощью sulfo-SHPP-125I (А, дорожки 2, 4 и 5- 8; В, все дорожки) и иммунопреципитированы с помощью моноклональных антител: anti-p27 (А, дорожки 1 и 3), анти-gp41А, дорожки 2 и 4; B, дорожки 1 и 2), анти-HLA-I (А, дорожки 5 и 7; B, дорожки 3 и 4), анти-HLA-II (L-243) (А, дорожки 6 и 8; B, дорожки 5 и 6). Белки анализированы с помощью SDS-ПААГ (12% гель) и количество белков подсчитано с помощью денситомерного анализа (NIH Image version 1.54).
Включение гетерологичных вирусных гликопротеинов в SIV частицы Для проверки предположения, что длина цитоплазматического хвоста белков Env SIV может влиять на включение гетерологичных вирусных гликопротеинов в вирусные частицы, клетки HUT78, продуцирующие SIVmac239 или SIVmac1А11 вирионы, трансфицировали плазмидой pCMV/H1, экспрессирущий A/PR/8/34 (H1N1) вируса гриппа HA белки. Через 7 дней культуральную среду собирали и частицы со смешенным фенотипом, то есть SIV частицы, содержащие HA белки вируса гриппа, анализировали с помощью поверхностного иодирования. Присутствие HA белков обнаруживали в образцах SIV частиц с полноразмерным и транкированым
Env. Для сравнения включения HA белков использовали, связывающую вирус ELISA (virus binding ELISA). Частицы SIVmac239 эффективно связывались с кроличьими и мышиными анти-HA антителами. Оба вида антител имели одинаковую способность связываться с вирусом. Однако, по сравнению с вирусом SIVmac239, содержащим полноразмерным Env, у вирусных частиц SIVmac1А11 снижалась способность связываться с anti-HA антителам приблизительно в 3 раза. Захвата вирусных частиц, в лунках без кроличьих и мышиных анти-HA антител и в контрольных лунках, содержащих везикулы или SIV, полученных из клеток не ко-экспрессирующих HA белки, не наблюдалось. Эти результаты показали, что кроличьи и мышиные антитела против HA белков специфично распознают HA молекулы, ассоциированные с высвобождением SIVmac239, а также способны определять HA в SIVmac1А11, но со значительно более низкой эффективностью. Чувствительность SIV к нейтрализации специфическими антителами.
Вначале проверяли, будет ли уровень включения HLA белков в вирионы влиять на чувствительность SIV к нейтрализации анти-HLA антителами. Антитела анти-HLA-I и анти-HLA-II имели очень ограниченный нейтрализующий эффект на SIV вирионы. После обработки анти-HLA антителами, вирионы SIVmac239 подвергались нейтрализации только на 10% и отсутствие нейтрализации наблюдалось для SIVmac1А11 (Рисунок 13). Далее определили, будет ли обработка вторичными антителами усиливать нейтрализующий эффект. Вторичные анти-мышиные антитела значительно усиливали нейтрализующий эффект; анти-HLA-I плюс анти-мышиная сыворотка приблизительно на 30% и анти-HLA-II плюс анти-мышиная сыворотка на 56% нейтрализовали при обработки SIVmac239 вирионы (Рисунок 13). В отличие от этого, снижения инфекционности SIVmac1А11 вирионов после обработки анти-HLA-I плюс анти-мышиной сывороткой не происходило, и только приблизительно 10% снижения инфекционности обнаруживалось с анти-HLA-II плюс анти-мышиной сывороткой. В качестве контроля, использовались анти-VSV антитела, которые не имели нейтрализующего эффекта на SIV вирионы. Эти результаты продемонстрировали, что в отличие от SIVmac239, SIVmac1А11 вирионы почти полностью резистентны к нейтрализации анти-HLA антителами.
Также сравнили нейтрализацию SIV вирионов с помощью анти-НА антител. Усилить чувствительность к нейтрализации анти-НА антителами пытались с помощью увеличения включения НА белков в SIV частицы. Для этого заражали HUT78 клетки вирусами SIVmac239 или SIVmac1А11 с инфекционной множественностью 0.001 и после 2 часов инкубации клетки трансфицировали плазмидой pCMV/H1, экспрессирующей НА-белки. Супернатанты от заражённых и трансфицированных клеток собирали после трёх дней и использовали для анализа нейтрализации. После обработки анти-НА сывороткой, около 84% SIVmac239 оказалось чувствительно к нейтрализации. В отличие от этого, только 65% SIVmac1А11 вирионов оказалось нейтрализовано.
Влияние модификаций цитоплазматического домена на иммуногенность Env
Для сравнения входа псевдотипированных вирионов с FL или с короткими белками Env в клетки с различными рецепторами использовали HeLaT4 (низкое количество СD4), TZM-bl (высокое количество СD4) и HeLaT8 (СD8) клетки. Для определения инфекционности ВИЧ использовалась индикаторная клеточная линия TZM-bl или инфекционность определялась с помощью псевдотипированных вирионов, кодирующих люциферазу (He et al., 1999). Вирионы псевдотипированные с Env СТ17 92UG046 проникали в клетки с СD4 и СD8 рецепторами (HeLaT4, HeLaT8 и TZM-bl клетки) (Рисунок 30). Вирионы псевдотипированные с Env FL 92UG046 проникали в клетки с СD4 рецепторами (HeLaT4 и TZM-bl клетки) и заражали СD4+–HeLa клетки с высокой эффективностью. В отличие от этого, вирионы псевдотипированные с 92UG046 Env СТ84 заражали HeLaT8 клетки, используя рецептор СD8-опосредованный вход. Эффективность инфекции, вызванной вирионами псевдотипированными с СТ84 Env, наблюдалась относительно низкой, около 100 relative luciferase unites (относительных люциферазных единиц) на 1Х104 клеток. Результаты показали, что СТ-домен имеет значительный эффект на проникновение Env ВИЧ-1 92UG046 псевдотипированных вирионов в HeLa клетки со специфическими рецепторами и, что длина СТ домена способна оказывать эффект на инфекционность.
Проникновение вирионов псевдотипированных Env ВИЧ -1 92UG046 с FL или коротким СТ в TZM-bl, HeLaT4 и HeLaT8 клетки. Один цикл инфекции исполнен в HeLa или производных от клеток HeLa с рецепторами CD4 или CD8 с использованием дефектный по репликации NL4-3 вируса, несущего люциферазный репортер псевдотипированный с белками FL, CT84, CT17 Env. Активность люциферазы рассчитана при сравнении активности люциферазы из экстрактов клеток, зараженных FL (100 %) (а , б) или с CT84 (100 %) (с). Неинфицированные клетки использовали в качестве контроля. Результаты показаны со стандартным отклонением (n = 3).
Блокирование антителами проникновения вирионов псевдотипированных с FL или короткими белками Env в СD4 или СD8 HeLa клетки
На основании предыдущих данных можно предположить, что укорочение СТ84 цитоплазматического домена приводит к конформационным изменениям в наружном домене Env, которое ответственно за наблюдаемые различия в тропизме белков Env 92UG046. Для дальнейшего исследования воздействий укороченного СТ домена белка Env на специфичность рецептора, использовался способ блокирования (blocking assay) с анти-СD4 (Q4120, RPA–T4 клоны) или анти-СD8 моноклональными антителами проникновения вирионов в HeLaT4 или HeLaT8 клетки. Неделящиеся HeLaT4 или HeLaT8 клетки приготавливали путём приостановки клеточного цикла в G1-S фазе с помощью 2 мкг/мл афидиколина, ингибитора эукариотической ДНК-полимеразы альфы (Huberman, 1981). Инфекция в HeLaT8 клетках, вызванная вирионами псевдотипированными с Env СТ84, обработанных анти-СD8 антителами, снижалась по сравнению с инфекцией в необработанных HeLaT8 клетках. Однако анти-СD8 антитела не влияли на инфекцию, вызванную вирионами псевдотипированными с Env FL. Анти-СD4 антитела (Q4120, RPA–T4 клоны) не блокировали вход псевдотипированных вирионов с модифицированными или с немодифицированными Env в HeLaT4 или HeLaT8 клетки. В отличие от RPA–T4, Q4120 блокировали инфекцию, вызванную вирионами псевдотипированными с Env FL в TZM-bl клетках. Анти-СD8 антитела частично блокировали вход псевдотипированных вирионов с СТ62LLP2 в HeLaT8 клетки, но не влияли на вход псевдотипированных вирионов с СТ62LLP2-4А (Рисунок 31), что может быть следствием нарушения в -спиральной структуре LLP-2 домена в СТ62LLP2-4А Env. Анти-СD4 и анти-СD8 антитела не эффективны в блокирование инфекции вызываемой вирионами псевдотипированными с Env СТ17. Эти результаты показывают, что структура и длина СТ домена способны изменить специфичность рецептора для Env ВИЧ-1. Блокирование антителами связывания вирионов псевдотипированных с FL или короткими белками Env с СD4 или СD8 рецепторами Для понимания механизма с помощью которого СТ домен модулирует эффективность инфекции в клетках, сравнивали действия антител на связывание вирионов псевдотипированных с FL или короткими белками Env с СD4 или СD8 белками. Связывание псевдотипированных вирионов измеряли с помощью конкурентного ELISA (competitive binding ELISA) в присутствии анти-СD4 или анти-СD8 моноклональных антител или контроля антител. Псевдотипированные вирионы СТ84 и СТ17 эффективно распознавали СD4 или СD8 молекулы, в то время как анти-СD4 блокировали связывание Env FL псевдотипированных вирионов. Связывание коротких СТ84, СТ17 и Env FL псевдотипированных вирионов с СD4 снижалось в присутствии анти-СD4 (Q4120) антител (около 35% до 75% снижения), но такого эффекта не наблюдалось с RPA–T4 антителами. 110 Примечательно, связывание СТ84 псевдотипированных вирионов с СD8 снижалось в присутствии анти-СD8 антител (около 74% снижения).