Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 19
1.1 Общие сведения о вирусном онколизе и онколитических вирусах 19
1.2 Классификация и свойства энтеровирусов человека 22
1.3 Механизмы проникновения энтеровирусов в клетки 25
1.4 Системы противовирусной защиты клетки и значение их поломок для приобретения чувствительности к онколитическим вирусам 32
1.5 Онколитические свойства энтеровирусов 38
1.6 Перспективы использования энтеровирусов в качестве онколитических средств 52
ГЛАВА 2. Материалы и методы 56
2.1 Материалы и реагенты, использованные в работе 56
2.2 Препараты энтеровирусных штаммов, использованных в работе 59
2.3 Наработка плазмидной ДНК в Echerichia Coli, штамм 10-beta 59
2.4 Разрезание ДНК эндонуклеазами рестрикции 60
2.5 Фракционирование ДНК электрофорезом в агарозном геле 60
2.6 Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля 61
2.7 Лигирование векторной плазмиды с фрагментами ДНК 61
2.8 Проведение ПЦР 62
2.9 Определение чувствительности линий опухолевых клеток к штаммам энтеровирусов
2.10 Определение продуктивности вирусной инфекции в линиях опухолевых клеток путем титрования методом Рида и Менча 65
2.11 Получение ксенографтов опухолей модельных линий клеток в иммунодефицитных мышах 65
2.12 Введение энтеровирусов в организм иммунодефицитных мышей с целью индукции вирусного онколиза 66
2.13 Волюмометрия ксенографтов модельных и первичных линий опухолевых клеток 66
2.14 Получение моноклональных сублиний клеток после трансфекции плазмиды pCas-Guide-2A-RFP 67
2.15 Выделение геномной ДНК 68
2.16 Получение первичных культур опухолевых клеток из клинических образцов 68
2.17 Криоконсервация культур опухолевых клеток 69
2.18 Трансфекция клеток плазмидной ДНК 69
2.19 Клонирование энтеровирусных штаммов методом бляшек 70
2.20 Наработка препаратов энтеровирусов 71
2.21 Выделение плазмидной ДНК 72
2.22 Проведение ПЦР в реальном времени 73
2.23 Детекция белков вирусных рецепторов методом Вестерн блоттинга 74
2.24 Математический анализ взаимосвязи дифференциальной экспрессии генов и чувствительности клеточных линий к вирусам и статистическая обработка данных 75 2.25 Проведение высокопроизводительного секвенирования транскриптомов клеточных линий 76
2.26 Создание плазмид pCas-Guide-2A-RFP для выключения генов 77
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 80
3.1. Анализ структуры генома непатогенного штамма Коксаки В5/ЖЭВ14 80
3.2 Получение первичных культур опухолевых клеток аденокарциномы простаты от пациентов 86
3.3 Оценка онколитических свойств штаммов энтеровирусов на моделях in vitro 89
3.4 Онколитическая активность вирусного штамма ЖЭВ14 на модели подкожных ксенографтов клеток рака предстательной железы в иммунодефицитных мышах .
3.5 Исследование влияния поверхностного рецептора CXADR на заражения вирусом ЖЭВ14 98
3.6 Изучение влияния состояния клеточной системы врожденного противовирусного иммунитета на чувствительность клеток к действию онколитических энтеровирусов 103
3.7 Выявление генов клетки-хозяина, экспрессия которых связана с эффективностью продукции онколитического энтеровируса ЖЭВ14 113
3.8 Исследование влияния нокаута гена STAT2 на чувствительность клеток к онколитическим вирусам 126
Заключение 129
Выводы 132
Благодарности 133
Список литературы 134
- Системы противовирусной защиты клетки и значение их поломок для приобретения чувствительности к онколитическим вирусам
- Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля
- Выделение геномной ДНК
- Онколитическая активность вирусного штамма ЖЭВ14 на модели подкожных ксенографтов клеток рака предстательной железы в иммунодефицитных мышах
Системы противовирусной защиты клетки и значение их поломок для приобретения чувствительности к онколитическим вирусам
Термин «вирусный онколиз» означает процесс уничтожения опухолевых (злокачественных) клеток посредством вирусов. Многие вирусы обладают способностью в процессе репликации вызывать лизис (гибель) клетки. Это происходит либо в результате запрограммированного процесса, вызванного необходимостью новообразованным вирусным частицам выйти из зараженной клетки, либо в результате истощения ресурсов клетки в процессе вирусной репликации. Третий механизм вирусного онколиза связан с иммунной смертью, вызванной распознаванием зараженных клеток компонентами иммунной системы. Так или иначе, но внутри организма зараженная вирусом клетка обычно подвергается уничтожению. Еще в начале прошлого века стали появляться сообщения о ремиссиях онкологических заболеваний после перенесенных вирусных инфекций [71, 72]. Дальнейшие исследования показали, что вирусы способны эффективно размножаться в опухолях и вызывать уничтожение опухолевых клеток [73-75]. В связи с этим появились предположения, что вирусы могут быть использованы для лечения рака [76-79]. В середине 20 века были предприняты попытки экспериментальной терапии рака рядом известных на то время вирусов [80-85]. Однако в связи с тем, что использовавшиеся вирусы обладали патогенностью, при достаточно скромном терапевтическом эффекте у пациентов наблюдались серьезные осложнения, что привело к прекращению на долгое время попыток использовать вирусный онколиз для лечения онкологических больных.
Дальнейшее исследование онколитических свойств вирусов продолжалось параллельно с изучением биологии вирусов и механизмов злокачественной трансформации клеток. Прогресс в понимании процессов, лежащих в основе вирусного онколиза, в настоящее время позволяет эффективно решать многие практические проблемы, стоящие на пути использования вирусов в онкологической практике. Установлены основные причины преимущественной чувствительности опухолевых клеток к вирусам. При опухолевой трансформации клетки перестают выполнять свои специфические функции в организме и начинают эволюционировать в сторону все более быстрой пролиферации и экспансии. Это достигается за счет поломки контролирующих механизмов и утраты всех лишних функций. Лишними оказываются присутствующие в каждой клетке механизмы неспецифической противовирусной защиты, система индукции интерферона в ответ на вирусную инфекцию, а также механизмы реакции клеток на обработку интерфероном, которые в нормальных клетках обеспечивают невосприимчивость к вирусной инфекции [54, 86-88]. Кроме этого, опухолевые клетки обладают усиленным метаболизмом, их энергетический статус обеспечивает вирусам более благоприятные условия для репликации. Нарушенная система выбраковки дефектных клеток посредством р53-зависимых механизмов и дефекты индукции апоптоза позволяют избежать преждевременной гибели зараженной клетки, ограничивающей процесс вирусной репликации [25, 89]. Существенным фактором является большая доступность клеток опухоли к проникновению вирусов. Это дезорганизованная опухолевая структура, нарушения межклеточных контактов с экспонированием поверхностных рецепторов для проникновения вирусов, неполноценность быстро растущих капилляров, имеющих нарушения целостности эндотелия, проницаемые для вирусов [90, 91].
Исследования в области фундаментальной вирусологии позволили установить молекулярно-биологические основы патогенности вирусов, определить гены вирусов, отвечающие за противодействие защитным системам организма. Развитие технологий биоинженерии на вирусных геномах позволяет произвольно модифицировать гены вирусов, в том числе проводить направленное аттенуирование вирусов, делая их безопасными для человека [92, 93]. Такие вирусы обладают ограниченными способностями к репликации в нормальных клетках, но свободно размножаются в опухолевых клетках, благодаря описанным выше дефектам [94].
Онколитическими свойствами обладают представители самых разных семейств вирусов, от мелких ДНК-содержащих парвовирусов до очень крупных поксвирусов, представителем которых является вирус осповакцины [29, 94, 95]. Многие представители семейств РНК-содержащих вирусов также могут использоваться в качестве основы для создания онколитических штаммов. Это и вирусы с негативной одноцепочечной РНК (парамиксовирусы, рабдовирусы, альфавирусы, тогавирусы и др.), вирусы с двуцепочечным сегментированным геном (реовирусы), а также многие представители пикорнавирусов, среди которых особое место занимают энтеровирусы человека.
Типичным представителями энтеровирусов являются полиовирусы. Еще в конце 1950-х годов была установлена потенциальная онколитическая активность полиовирусов [96, 97], а после разработки живых непатогенных вакцинных штаммов полиовирусов появились наблюдения о ремиссиях онкологических заболеваний после вакцинации [98]. Тогда же в ходе наблюдений за формированием иммунитета против полиомиелита после вакцинации от здоровых детей были выделены штаммы родственных полиовирусу энтеровирусов, которые также обладали онколитическими свойствами [99-101]. Энтеровирусы человека представляют обширное семейство вирусов. Многие представители энтеровирусов обладают патогенностью и вызывают вспышки заболеваний. Однако кроме патогенных существуют и непатогенные штаммы, которые могут быть использованы в качестве онколитических препаратов. Привлекательность энтеровирусов связана с тем, что они обладают способностью проникать в клетки с использованием разных рецепторных белков на поверхности клетки. Известно, что различные клеточные линии обладают дифференциальной чувствительностью к энтеровирусам. Однако, линия, которая малочувствительна к одному вирусу может оказаться высокочувствительной к другому. Из этого следует вывод, что для эффективной терапии следует иметь набор вирусов, использующих разные механизмы проникновения в клетку, а также обладающие различающимися требованиями к клетке-хозяину. Комбинируя эти штаммы, можно надеяться на большую вероятность позитивного ответа на лечение, и иметь возможность назначать более длительные курсы терапии, не опасаясь развития противовирусного иммунитета против отдельного применяемого вирусного препарата, используя в следующем курсе терапии вирусный штамм, к которому еще не сформировался противовирусный иммунитет. Для формирования эффективных панелей онколитических вирусов на основе энтеровирусов требуются дополнительные исследования, направленные на установление конкретных биомаркеров опухолевой клетки пациента, определяющих чувствительность к тому или иному представителю семейства энтеровирусов. Предварительное тестирование опухолевого материала пациента может позволить проводить выбор наиболее подходящих для данного больного штаммов онколитических вирусов из числа вирусов, входящих в состав имеющейся панели.
Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля
Полиовирусы выделены как возбудители паралитического полиомиелита. Это заболевание поражает моторные нейроны передних рогов спинного мозга и может вызывать стойкие параличи. Существует три иммунологически различающихся разновидностей полиовируса, на основе которых А. Сэбиным были созданы аттенуированные вакцинные штаммы, полностью лишенные нейровирулентности, но сохраняющие способность заселяться в кишечник и вызывать пожизненный иммунитет против заболевания. Вакцинные штаммы полиовируса являются типичными непатогенными энтеровирусами, пригодными для испытания онколитических свойств. Онколитическая активность полиовирусной вакцины была описана в ряде публикаций. В последние годы полиовирусы стали популярной моделью для создания рекомбинантных вариантов, в том числе рекомбинантных штаммов с усиленными онколитическими свойствами [183, 199, 200]. Как уже упоминалось, для проникновения в клетки полиовирусы используют единственный рецептор, представитель суперсемейства иммуноглобулинов гликопротеин CD155 или PVR [201]. Как и многие другие рецепторы энтеровирусов, данный белок в больших количествах присутствует на поверхности злокачественных клеток различного происхождения, в том числе в злокачественных клетках нейроэктодермального происхождения, мультиформной глиобластомы, астроцитомы и проч. [117, 202, 203]. При этом в нетрансформированных клетках содержание CD155 исключительно низкое, что, по-видимому, определяет их нечувствительность к полиовирусам. Выяснено также, что CD155 представлен в большей степени в клетках в маргинальной зоне опухоли и на высоко злокачественных клетках на периферии опухоли, которые осуществляют инвазию в окружающие здоровые ткани мозга. Повышенная продукция этого белка также наблюдается при отдаленных рецидивах глиобластом, образованных клетками, мигрировавшими из первичного очага, и характеризующимися крайне высоким инвазивным потенциалом [204].
Повышенная экспрессия PVR на поверхности ряда злокачественных клеток контролируется морфогенным фактором sonic hedgehog (Shh), а также транскрипционными факторами Gli1 и Gli3 [205]. Данный сигнальный путь в норме функционирует исключительно в процессе эмбриогенеза, однако, для многих карцином характерна его патологическая активация. Благодаря этому PVR может использоваться в качестве опухолевого маркера, причем экспрессирующие его клетки, могут рассматриваться как потенциальные мишени для полиовирусов.
В виду потенциальной угрозы появления болезнетворных ревертантов полиовируса большое внимание при создании онколитических штаммов на основе полиовирусов уделяется вопросам безопасности. Для предотвращения рекомбинаций на основе полиовируса I типа (штамм Mahoney) на начальных стадиях изучения онколитической активности были созданы полиовирусные противоопухолевые репликоны, В полученном векторе ген, кодирующий капсидный белок VP1, был заменен на чужеродный ген gag вируса иммунодефицита человека 1-го типа. Сборка полноценных вирусных частиц достигалась одновременным заражением клеток вирусом-помощником – штаммом вируса осповакцины, несущим ген вирусного белка капсида VP1. Такой рекомбинантный репликон полиовируса мог заражать клетку и реплицироваться, но образующиеся вирусные частицы были неспособны к заражению. Было установлено, что искусственный полиовирусный репликон обладал способностью к амплификации в ряде первичных культур клеток опухолей ЦНС, включая клетки глиобластомы, нейробластомы, астроцитомы, менингиомы и глиосаркомы [206]. При заражении искусственным полиовирусным репликоном наблюдается характерное для полиовируса цитопатическое действие – образование вакуолей, округление клеток, разрывы клеточной мембраны. При испытании его на линиях клеток опухолей различного происхождения, молочной железы (BT20), рака прямой кишки (DLD-1), плоскоклеточного рака кожи (A-431), и меланом (SK MEL-2, SK-MEL-21, SK-MEL-28) для всех из перечисленных линий наблюдалось в той или иной мере цитопатическое действие. Однако, нечувствительными оказались клетки лимфомы Беркита Raji, где PVR не транскрибируется. Чувствительность к полиовирусным репликонам была также продемонстрирована in vivo с использованием ксенотрансплантатов клеток глиомы D54-MG на иммунодефицитных мышах. Виротерапия сопровождалась достоверным увеличением выживаемости мышей с трансплантированной опухолью по сравнению с контрольной группой мышей [206].
Безопасность рекомбинантных полиовирусных репликонов испытывалась на трансгенных мышах, имеющих человеческий полиовирусный рецептор и чувствительных к заражению полиовирусом дикого типа путем внутриспинального введения полиовирусных репликонов в дозе, соответствующей 10000 летальных доз, в пересчете на дикий вирус. По мнению авторов такие репликоны могут оказаться эффективными для лечения микрометастазов опухолей расположенных в ЦНС, после хирургического удаления первичной опухоли [206].
С внедрением онколитической виротерапии связывают большие надежды в отношении терапии злокачественных опухолей ЦНС, в частности злокачественных глиом головного мозга. В настоящее время мультиформная глиобластома является неизлечимым заболеванием со средней продолжительностью жизни около одного года. Доставка химиотерапевтических средств в ЦНС затрудняется из-за существования гематоэнцефалического барьера, а лучевая терапия приводит лишь к кратковременным ремиссиям. Специально для лечения глиом были разработаны варианты рекомбинантного полиовируса PV1-RIPO и PVS-RIPO, являющегося производными дикого и вакцинного штамма полиовируса I типа, соответственно. В этом рекомбинантном вирусном штамме внутренний сайт посадки рибосомы (IRES) полиовируса был заменен на IRES риновируса 2-го типа человека (HRV2). Риновирус не способен реплицироваться в клетках ЦНС благодаря отсутствию в его IRESе определенного элемента. Поэтому и PV-RIPO не способен размножаться в нормальных клетках нейрогенного происхождения и, в отличие от исходного штамма полиовируса, также он не способен вызывать менингиты у трансгенных мышей, несущих CD155/PVR [207].
При исследовании молекулярных аспектов взаимодействия нейронов с PV-RIPO было обнаружено, что HRV2 IRES связывается с ядерным фактором активированных Т-клеток (NF45), а также гетеродимером белка DRBP76, который взаимодействует с двуцепочечными РНК. Гетеродимер DRBP76 обнаруживается в нейронах и принимает участие в процессах трансляции, располагаясь преимущественно в цитоплазме. Связывание данного гетеродимера предотвращает инициацию синтеза белка в нейронах. Было показано, что замена IRES-элемента в RV-RIPO не нарушает высокую онколитическую активность полиовируса. Повышенная активность HRV2 IRES в быстрорастущих опухолевых клетках говорит о наличии принципиальных отличий в регуляции скорости белкового синтеза в этих клетках, повышая их чувствительность к PV-RIPO. Некоторые аспекты молекулярных механизмов онколитического действия вирусов остаются не изученными, в связи с тем, что в этом процессе участвует большое количество регуляторных белков, канонических и неканонических факторов трансляции, IRES-связывающих белков и пр.
Выделение геномной ДНК
На сегодняшний день изучение вирусного онколиза проводится на моделях опухолевых клеток человека. Одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний является рак предстательной железы, для которого доступно лишь ограниченное число модельных линий клеток. Так в Американской коллекции культур (АТСС) имеется три основные линии - PC-3, DU-145 и LNCaP. Они были получены из метастазов опухолей предстательной железы и не охватывают широкий фенотипический диапазон злокачественных новообразований для данной локализации, поскольку не представляют модели первичных аденокарцином. Для получения первичных культур клеток рака предстательной железы была проведена отработка условий получения таких культур из образцов интраоперационных биоптатов. Биоматериал был взят в ходе проведения хирургического удаления опухолей в ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. Сложность получения первичных культур состоит в присутствии в опухолевом материале значительного числа клеток стромы -фибробластов, клеток эндотелия, а также клеток лейкоцитарного ряда. Особую проблему представляют фибробласты, которые активно пролиферируют в культуре и способны к десяткам делений до достижения состояния репликативного старения. При получении первичных культур опухоли фибробласты способны быстро вытеснять клетки других типов, включая опухолевые клетки. В связи с этим в ходе работ были отработаны условия очистки первичных культур от фибробластов и получения опухолевых клеток простаты в чистом виде. В результате были получены и охарактеризованы две стабильные первичные линии аденокарциномы простаты.
Для очистки от фибробластов в качестве простейшей процедуры был использован дифференциальный рассев клеток на бессывороточной среде, содержащей эпидермальный фактор роста. Более детальные условия процедуры описаны в разделе «Материалы и методы». В таких условиях фибробласты, рассеянные с низкой плотностью, прекращают пролиферацию, в то время как клетки эпителиальных опухолей продолжают расти и формируют колонии. При последовательном пассировании в таких условиях удается избавиться от большей части фибробластов. Для дальнейшей очистки культур от фибробластов проводился отбор опухолевых клеток из образующихся колоний. Культуры, частично очищенные от фибробластов, рассевали с низкой плотностью (примерно 5000 клеток на 10 см культуральную чашку) на бессывороточную среду. Колонии опухолевых клеток диаметром 2-3 мм образовывались через 10-15 суток, после чего их изолировали с помощью клонирующих дисков и помещали в отдельные емкости для последующего наращивания и изучения. Для получения репрезентативной модели опухолевой культуры 5-10 клонов, полученных из одной первичной клеточной линии, объединяли и далее пассировали в виде смешанной культуры. Такие первичные клеточные линии были полностью свободны от загрязнений фибробластами (Рис. 9.).
Первичная культура аденокарциномы простаты на ранних пассажах. А. Видны эпителиальные опухолевые клетки и тяжи фибробластов; Б. Первичная культура аденокарциномы простаты на 10-14 пассажах, значительно загрязненная нормальными фибробластами стромы; В. Клонированная линия аденокарциномы простаты PRC3 после проведения редкого рассева. В ходе работ были получены и охарактеризованы линии аденокарциномы предстательной железы PRC3 и PRC6, которые были помещены в лабораторную коллекцию культур на уровне 5-6 пассажей после клонирования. Для детальной молекулярно-генетической характеристики полученных культур из них была выделена тотальная клеточная РНК и проведено полнотранскриптомное секвенирование с последующим биоинформатическим анализом. В ходе транскриптомного секвенирования были получены данные об уровне экспрессии более чем 26 000 генов. Эти результаты будут рассмотрены ниже. В Табл. 6 даны некоторые клинические характеристики опухолей пациентов, из которых были получены культуры PRC3 и PRC6, а также данные о присутствии в клетках транскриптов опухолевых маркеров. Табл. 6. Характеристики первичных клеточных линий аденокарциномы простаты Название линии и характеристики опухоли PRC3 PRC6 Возраст пациента 63 48 Степень дифференцировки по шкале Глисона 7 (3+4) 6 (2+4) Экспрессия AR - Экспрессия PSA + Цитокератин CK 5 + Цитокератин CK 8 + + Цитокератин CK 19 + + Молекула адгезии эпителия EpCam + + Кислая фосфатаза ACPP - Простатический специфический мембранный антиген PSMA + Синтаза жирных кислот FASN + FSP 1 (S100) - + Полученные линии далее использовались в качестве модельных наряду со стандартными линиями опухолевых клеток человека.
Онколитические свойства вирусов складываются из способности избирательно размножаться в опухолевых клетках, вызывая их гибель, а также из их способности стимулировать реакции организма, направленные на уничтожение опухолевых клеток.
В настоящее время наиболее изученным механизмом вирусного онколиза является прямое цитотоксическое действие вируса на опухолевые клетки. Эти свойства вирусов можно реконструировать и на моделях in vitro, используя культуры опухолевых клеток. Что касается способности вирусов к стимулированию противоопухолевого иммунитета, то эти процессы можно изучать главным образом на моделях in vivo, с использованием лабораторных животных или при экспериментальной терапии больных онкологическими заболеваниями. Хотя остается неясным степень вклада прямого вирусного онколиза в суммарное терапевтическое действие, очевидно, что для реализации этого действия важна способность вируса проникать в опухолевые клетки и, избирательно размножаясь в них, инициировать реакцию организма на вирусную инфекцию внутри опухоли. Размножение вируса в опухолевых клетках индуцирует комплекс реакций врожденного и адаптивного противоопухолевого иммунитета, приводит к высвобождению из гибнущих опухолевых клеток опухоль-ассоциированных антигенов, ряда продуктов, привлекающих иммунные клетки (так называемые DAMP или молекулярные автографы поврежденных клеток), а также к секреции клетками опухолевой стромы и самими опухолевыми клетками ряда факторов -цитокинов и хемокинов. Эти процессы приводят к ослаблению супрессивного действия опухолевого микроокружения и способствуют более эффективной атаке злокачественных клеток иммунными клетками. Поэтому ключевым фактором, определяющим способность конкретного штамма онколитического вируса оказывать терапевтическое воздействие на опухоль пациента, является его способность эффективно размножаться в клетках опухоли. Это свойство может быть успешно испытано в культуре клеток, а также на простейших животных моделях – иммунодефицитных мышах, несущих ксенографты опухолей человека.
С целью установления индивидуальных различий для пяти штаммов онколитических энтеровирусов и вируса везикулярного стоматита в отношении их способности размножаться и убивать опухолевые клетки человека в культуре было проведено параллельное заражение четырнадцати модельных перевиваемых линий опухолевых клеток человека, одной клеточной трансформированной in vitro (НЕК293Т), двух первичных линий опухолевых клеток, а также диплоидных клеток легкого эмбриона человека (ЛЭЧ-4). Перечень линий и их происхождение даны в Табл. 2 раздела Материалы и методы.
Онколитическая активность вирусного штамма ЖЭВ14 на модели подкожных ксенографтов клеток рака предстательной железы в иммунодефицитных мышах
Как видно, гены экспрессия которых наиболее положительно коррелирует с репликационной способностью вируса ЖЭВ14 кодируют белки, относящиеся к самым разнообразным семействам, а для многих из этих генов информация об их функции практически отсутствует. Среди продуктов этих генов много мембранных белков, имеется несколько протеинкиназ и протеинфосфатаз, компонентов внутриклеточной сигнализации, ферментов метаболизма. Возможно, что не все из выявленных генов непосредственно влияют на репликацию вируса. Их возможная роль в увеличении чувствительности клеток к ЖЭВ14 может быть проверена в отдельном исследовании путем выключения экспрессии соответствующих генов.
Анализ генов, входящих в список наиболее сильно отрицательно коррелирующих с репликацией ЖЭВ14 дает больше оснований для построения гипотез, поскольку среди продуктов этих генов выявляются компоненты противовирусных механизмов. Однако, более впечатляющие предположения, вытекающие из полученных транскриптомных данных и их сравнения с репликативной способностью вирусов, могут быть получены с учетом распределения коррелирующих генов по функциональным группам и сигнальным путям.
Для выявления клеточных процессов, влияющих на продуктивность вирусной инфекции и репликации вируса, нами были использованы приложения для анализа обогащения списков генов – базы данных DAVID [223] (с включенной в нее базой KEGG [224-227]). Этот анализ выявил множество генов, относящихся к определенным функциональным группам или сигнальным путям. Наиболее надежно коррелирующие гены приведены в Табл. 11.
Среди генов, отрицательно коррелирующих с репликативной способностью штамма ЖЭВ14 отмечено много представителей белковых семейств, участвующих в процессе эндоцитоза, везикулярном транспорте и функции лизосом. Все эти процессы могут быть связаны с этапами, предшествующими инициации репликации вируса, но уже после специфического связывания вируса с рецептором на поверхности клеток.
Выявленные с помощью транскриптомного анализа корреляции с экспрессией генов, участвующих в эндоцитозе, везикулярном транспорте, мембранной динамике, слиянии везикул (например, семейство белков SNARE), функциях эндосом и лизосом указывают на их возможную роль в процессах, которые могут оказаться лимитирующими для эффективной репликации вирусов в данной клеточной системе. Сюда же можно отнести ряд генов, экспрессия которых положительно коррелирует с репликационной способностью ЖЭВ14 и включает в себя, в частности, белки клеточной адгезии. Не исключено, что эти белки могут либо участвовать в качестве корецепторов, либо их наличие может отражать физиологическое состояние клетки, в котором она восприимчива к вирусной инфекции. Однако для верификации роли каждого из этих генов, или сигнальных путей, в которых они участвуют, требуется проведение отдельных исследований. Эти исследования будут заключаться в выключении отдельных выявленных компонентов с помощью генных нокаутов с последующим анализом изменений чувствительности клеток к вирусам.
Наиболее очевидными для интерпретации представляются выявленные корреляции с экспрессией генов, участвующих в индукции интерферона, и генов сигнальных путей индукции интерферона (через внутриклеточные RIG-I-подобные рецепторы, RLR) и интерферонового ответа (JAK-STAT). Компоненты системы индукции интерферона включают рецепторы RIG-I и MDA-5, белок MAVS/IPS-1, TMEM178/MITA и ряд других. Компоненты этих сигнальных путей, а также мера их взаимосвязи с репликативной способностью ЖЭВ14, выявленная корреляционным анализом, показаны на Рис. 28 и 29. IiiflaiiМІЛІЙі v tytoki CXCL Рис. 28. Схема w внимание отсутствие в списке генов, уровни экспрессии которых коррелируют с продукцией ЖЭВ14 - генов CXADR и CD55, которые являются рецепторами для проникновения ЖЭВ14.
С целью установления взаимосвязи чувствительности опухолевых клеток к ЖЭВ14 и уровня CXADR методом ПЦР в реальном времени был исследован уровень экспрессии этого гена в исследованных ранее клеточных линиях (Рис. 30 и 31).
Из представленных диаграмм на Рис. 30 и 31 следует, что, хотя CXADR и является необходимым для эффективного заражения клеток, уровни его экспрессии не определяют наблюдаемые различия в способности клеток реплицировать вирусы группы Коксаки В.
С целью проверки данного утверждения был также исследованы уровни экспрессии таких рецепторов как CD55, PVR, ICAM1, SCARB2 (данные не представлены). Результаты этого исследования были сопоставлены со способностью клеточных линий реплицировать различные вирусы. На диаграмме ниже (Рис.32.) приведена тепловая карта, отражающая коэффициенты корреляции Спирмена между уровнем экспрессии рецепторных генов и эффективностью репликации вирусов ЖЭВ14, ЖЭВ7, VSV, ЖЭВ15, ЖЭВ8, PV1S в исследованных клеточных линиях.
Как видно из представленных данных достоверной взаимосвязи между экспрессией генов вирусных рецепторов и способностью вирусов эффективно реплицироваться в клетках не выявляется.
Таким образом, хотя экспрессия генов рецепторов для проникновения энтеровирусов в клетку и необходима для эффективного заражения клеток, что подтверждено результатами экспериментов с выключением экспрессии рецепторов CXADR и PVR, колебание ее уровней не отражается на способности клеток заражаться соответствующими вирусами. Это наблюдение указывает на то, что количество рецепторов не является лимитирующим для инициации вирусной инфекции, и что важнейшими молекулярно-генетическими маркерами, которые определяют различия в чувствительности опухолевых клеток к вирусам, могут быть гены, выявленные нами в результате корреляционного анализа. После проведения верификации роли этих генов в процессе вирусной репликации могут быть получены новые биомаркеры, исследование которых сделает возможным предсказание большей или меньшей чувствительности опухоли пациента к терапевтическому действию онколитических вирусов.