N6-производные аденозина. Синтез и биологическая активность Ословский Владимир Евгеньевич

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Х-Замещенные аденозины и их производные. Особенности структуры и биологическая активность (обзор литературы) 7

1.1. Природные Х-замещенные производные аденозина 7

1.1.2. Терпеновые производные аденина 9

1.2. Биологическая активность Л -замещенных аденозинов 14

1.2.1. Цитокининовые рецепторы и цитокининовая активность 14

1.2.2. Противоопухолевая активность 15

1.2.3. Противовирусная активность 19

1.2.4. Л -замещенные аденозины - антипротозойные агенты 21

1.2.5. Аденозиновые рецепторы. Физиологический эффект

1.3. Стратегия химического синтеза Л -замещенных аденозинов

1.3.1. Замещение атома галогена алкиламинами в 6-галогензамещенных пуриновых

1.3.2. 1-#-Алкилирование аденозина с последующей перегруппировкой Димрота 31

1.3.3. Конденсация активированных производных инозина с аминами 33

1.3.4. Конденсация -ацетил-2 ,3 ,5 -три-0-ацетиладенозина с алкилгалогенидами в

присутствии оснований или спиртами в условиях реакции Мицунобу 38

1.3.5. Другие методы получениях-производных аденозина 39

Глава 2. Результаты и обсуждение 44

2.1. 1-#-Алкилирование 2 ,3 ,5 -три-О-ацетиладенозина и 3 ,5 -ди-О-ацетил-2 дезоксиаденозина с последующей перегруппировкой Димрота 44

2.2. l-iV-Алкилирование триметилсилильных производных аденозина 46

2.3. РегиоселективноеХ-алкилированиеХ-ацетил-2 ,3 ,5 -три-О-ацетиладенозина 50

2.4. Аминирование 2 ,3 ,5 -три-О-ацетил-6-хлор-пуринрибозида 52

2.5. Получение -производных 2 -дезоксиаденозина и 5 -дезоксиаденозина 54

2.6. Биологическая активность -производных аденозина 56

Глава 3. Экспериментальная часть 66

3.1. Общие методы 66

3.2. Синтез 1-N-производных аденозина и 2-дезоксиаденозина с последующей перегруппировкой Димрота 67

3.3. Синтез N6-замещенных производных аденозина 77

3.4. Синтез N6-замещенных производных 2-дезоксиаденозина 90

3.5. Синтез N6-замещенных производных 5-дезоксиаденозина 93

3.6. Испытания на антивирусную активность 95 Выводы 96 Список использованных сокращений 97

Благодарности 99

Список литературы .

• Биологическая активность Л -замещенных аденозинов
• Замещение атома галогена алкиламинами в 6-галогензамещенных пуриновых
• Аминирование 2 ,3 ,5 -три-О-ацетил-6-хлор-пуринрибозида
• Синтез N6-замещенных производных 2-дезоксиаденозина

Введение к работе

Актуальность исследования. Создание лекарственных препаратов на основе природных соединений является традиционным и эффективным подходом. Анализ источников новых лекарственных препаратов за последние годы показал, что более 60% новых препаратов были получены на основе природных соединений. Среди природных соединений наиболее перспективными являются производные нуклеозидов. В настоящее время в медицине используются около 100 лекарственных препаратов, созданных на основе нуклеозидов: половина противовирусных препаратов и четверть противоопухолевых препаратов. Природные нуклеозиды имеют разнообразную структуру, они входят в состав ДНК, РНК, нуклеотидов, коферментов. Из различных типов РНК на сегодняшний день выделено 112 минорных нуклеозидов, также из различных природных источников выделено около 200 дисахаридных нуклеозидов и нуклеозидных антибиотиков, в структуре которых имеются дополнительные функциональные группы и гидрофобные остатки. Природная нуклеозидная библиотека состоит примерно из 400 соединений и является перспективной основой для создания новых биологически активных соединений.

Важным классом биологически активных соединений нуклеозидной природы являются N⁶-замещенные производные аденозина. Эти соединения широко распространены в природе. Природные N⁶-замещенные аденозины (цитокининовые нуклеозиды), выделенные из растений, являются метаболическими предшественниками гормонов растений цитокининов. Среди модифицированных нуклеозидов, выделенных из тРНК, 13 соединений являются N⁶-производными аденозина. Различные N⁶-замещенные производные аденозина демонстрируют широкий спектр биологической активности. В ряду N⁶-замещенных производных аденозина найдены соединения, проявляющие выраженную противоопухолевую и цитокининовую активности, а также соединения, демонстрирующие активность в отношении некоторых видов простейших организмов, вызывающих инфекционные заболевания. Кроме того, среди N⁶-замещенных аденозинов найдены соединения, понижающие кровяное давление, проявляющие противовоспалительный эффект, препятствующие агрегации тромбоцитов, а также способные влиять на центральную нервную систему, проявляя антипсихотическую активность. Недавно было обнаружено, что природный N⁶-бензиладенозин и его производное N⁶-(o-метилбензил)аденозин демонстрируют выраженную противовирусную активность. Целью работы является синтез и изучение биологических свойств N⁶-замещенных производных аденозина. В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

1. Разработка эффективных методик синтеза N⁶-замещенных производных аденозина.

2. Получение библиотеки новых производных аденозина, содержащих в N⁶-положении гидрофобный заместитель.

3. Определение противовирусной активности полученных соединений в отношении РНК-содержащих вирусов.

4. Изучение зависимости «структура-активность» в ряду N⁶-производных аденозина.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе исследований разработаны
эффективные методики синтеза N⁶-замещенных производных аденозина. Оптимизирован метод 1-N-
алкилирования О-ацетил-защищенного аденозина с последующей перегруппировкой Димрота,
позволяющий получать конечные N⁶-замещенные продукты с высокими выходами. Предложена новая
методика 1-N-Алкилирования триметилсилильных производных N⁶-ацетил-2,3,5-три-O-

ацетиладенозина. Усовершенствован метод получения N⁶-замещенных производных аденозина основанный на конденсации N⁶-ацетил-2,3,5-три-O-ацетиладенозина со спиртами в условиях реакции Мицунобу или алкилгалогенидами в присутствии оснований. Найдены оптимальные условия деблокирования ацетильных защитных групп, упрощающие выделение конечных продуктов и позволяющие повысить выходы конечных N⁶-замещенных производных аденозина. Получена библиотека новых N⁶- производных аденозина, содержащих в шестом положении различные гидрофобные заместители. Всего в ходе работы синтезировано 42 новых соединения, структура которых подтверждена методами ЯМР и масс-спектрометрии. Ряд N⁶-замещенных аденозинов показали высокую ингибиторную активность в отношении энтеровируса человека 71 типа (EV71) с высоким индексом селективности.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на XVI международном симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (XVI Symposium on chemistry of nucleic acid components, esk Krumlov, Czech Republic, 8-13 июня 2014 г.), на XXVIII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Института биоорганической химии им. академиков Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН (Москва, 8-11 февраля 2016 г.) и на XXII международном круглом столе по нуклеозидам, нуклеотидам и нуклеиновым кислотам (International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Paris, France, 18-22 июля 2016 г.). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 1 обзор и 4 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (___ наименований). Работа изложена на ____ страницах, включает ____ рисунков, ____схем и ____таблиц.

Биологическая активность Л -замещенных аденозинов

Предполагается, что цитокининовые нуклеозиды и нуклеотиды являются метаболическими депо-формами цитокининов, и их взаимопревращение является одним из путей регуляции фитогормональной активности и цитокининового баланса растений. Кроме того, одним из путей регуляции цитокининовой активности считается ферментативная модификация заместителя в N6 положении. Ферменты могут использовать N6-замещенные аденозины или соответствующие им нуклеотиды в качестве субстратов, либо модифицировать непосредственно N6-замещенные аденины [20]. Бензильный и изопренильный остатки гидроксилируются цитохром P450 монооксигеназой с образованием тополинов и транс-зеатина (tZ) соответственно [11]. Фермент зеатинредуктаза катализирует необратимое восстановление двойной связи боковой цепи tZ с образованием дигидрозеатина (DZ). Данный фермент имеет высокую специфичность только к tZ и не восстанавливает боковую цепь сZ или iP. Кроме того, существует возможность взаимной изомеризации транс- и цис-зеатина (cZ) катализируемой ферментом зеатинизомеразой. tZ является более активным цитокинином чем cZ, поэтому обратимая изомеризация может быть связана с регуляцией его биологического эффекта [11, 20, 22].

Альтернативным путём регуляции активности цитокининов является глюкозилирование пуринового гетероцикла по iV-3, N-7 и N-9 положениям, при этом цитокинины теряют свою активность только в случае глюкозилирования по N-7 и iV-9 положениям. Формирование как N-1-, так и #-9-глюкозидов цитокининов катализирует глюкозилтрансфераза (ЕС 2.4.1.118) с использованием уридиндифосфатглюкозы (UDPG) или тимидиндифосфатглюкозы (TDPG) в качестве доноров глюкозы. Преимущественно глюкозилирование протекает по N-7 положению. Было установлено, что iV-7- и N-9-глюкозиды цитокининов не гидролизуются действием у9-глюкозидазы (EC 3.2.1.21), в отличие от iV-З -изомеров, поэтому считается, что глюкозилирование цитокининов по N-1-и N-9 положениям приводит к необратимой инактивации, в то время как iV-3-глюкозиды сохраняют свою активность [11, 20].

Существует альтернативный путь биосинтеза цитокининов даранс-зеатинового типа, по которому изопентенилтрансфераза катализирует перенос к AMP не изопентенильной группы от DMAPP, а даранс-зеатинового остатка от 4-гидрокси-3-метил-2-бутенил дифосфата (HMBDP) - гидроксилированного производного DMAPP (Схема 2). Ранее предполагалось, что цитокинины даранс-зеатинового типа получаются только путём ферментативного гидроксилирования изопентенильного остатка [11, 23]. НО он iPRMP Схема 2. Биосинтез цитокининов транс-зеатинового типа. (1 – изопентенилтрансфераза (EC 2.5.1.27); 2 – микросомальная гидроксилаза (CYP735A1 или CYP735A2); HMBDP – 4-гидрокси-3-метил-2-бутенилдифосфат; tZRMP – транс-зеатинрибозид-5-монофосфат)).

Известно, что молекулы тРНК содержат различные модифицированные производные аденозина [5]. Некоторые молекулы тРНК содержат iPR в участке соседнем с антикодоном. Фермент тРНК-изопентенилтрансфераза катализирует N6 изопренилирование аденозина в участке тРНК (схема 3). Поскольку в процессе деградации тРНК высвобождаются активные цитокинины, этот путь также рассматривается в качестве возможного источника цитокининов в растениях. В растительных тРНК были обнаружены различные цитокининовые нуклеозиды: iPR, cZR, tZR, 2-метилтио-iPR, а также цис- и транс-2-метилтио-ZR. Самым распространённым среди них является cZR. Соотношение цис- и транс-изомеров цитокининовых нуклеозидов в тРНК составляет приблизительно 40:1. Такое распределение предположительно говорит о том, что деградация тРНК является источником цис изомеров цитокининов [11, 23].

Схема 3. Ферментативное N6-изопренилирование аденозина в составе тРНК. (1 – тРНК-изопентенилтрансфераза (EC 2.5.1.8)).

Таким образом, биосинтез изопреноидных цитокининов является сложным процессом, в котором участвуют более 10 различных ферментов.

Биосинтез ароматических цитокининов не выяснен к настоящему времени. Однако, исследования, проведенные с использованием метода хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС), подтверждают присутствие KINR в растениях, что может свидетельствовать о его участии в биосинтезе кинетина [24]. Также из природного растительного источника был выделен BAPR [12]. В различных природных источниках были обнаружены ароматические цитокинины не только в форме свободных оснований, но также соответствующие цитокининовые нуклеозиды, нуклеотиды и глюкозиды. Можно предположить, что как минимум часть пути биосинтеза ароматических цитокининов имеет аналогию с биосинтезом цитокининов изопренильного ряда. Однако ферменты участвующие в биосинтезе ароматических цитокининов пока не идентифицированы [11].

Таким образом, цитокининовые нуклеозиды широко распространены в природе. N6-замещенные аденозины и ряд схожих соединений были обнаружены в тРНК растений и животных, а также в бактериях и морских организмах. Цитокининовые нуклеозиды являются важными метаболическими предшественниками (депо-формами) цитокининов, а их взаимопревращение может являться одним из возможных путей регуляции фитогормональной активности и цитокининового баланса растений.

Биологический эффект цитокининов основан на специфических лиганд-рецепторных взаимодействиях на поверхности растительной клетки. В качестве рецептора в данном процессе выступает сенсорная гистидинкиназа [9]. Было показано, что цитокинины обладают высоким сродством к цитокининовым гистидинкиназам AHK3 и CRE1/AHK4 [8]. Этот тип рецепторов был обнаружен в различных эволюционно изолированных видах растений. Рецептор CRE1/AHK4 экспрессируется главным образом в корневой системе растения, обуславливая проявления цитокининовой активности в корнях растения, в то время как AHK3 рецептор преимущественно экспрессируется в клетках побегов и определяет цитокининовую активность в побеговой системе растения.

Рибозиды цитокининов обладают низким связыванием с данными рецепторами [8]. С другой стороны, ряд цитокининовых нуклеозидов демонстрируют высокую цитокининовую активность в биотестах на различных растительных образцах [25, 26, 27].

Синтетические аналоги BAPR, содержащие в фенильном кольце различные функциональные группы (Me, OMe, OH, Cl, F, Br, CF3, OCH2F2), демонстрировали цитокининовую активность не только равную, но и значительно превышающую активность цитокинина BAP [25, 26]. Результаты показали, что активность в большей степени зависит от положения функциональных групп в ароматическом кольце. Соединения, содержащие заместители в мета-положении, оказались более активными в сравнении с орто-изомерами. Наименьшую активность на всех биопробах показали соединения с заместителями в пара-положении. Однако, несмотря на высокую активность данные N6-замещенные аденозины, а также BAPR показали крайне низкое связывание с цитокининовыми рецепторами CRE1/AHK4 и AHK3 [25], что может свидетельствовать о том, что в клетках эти соединения превращаются в формы N6-замещенных аденинов (схема 1), которые в свою очередь связываются с цитокининовыми рецепторами и проявляют активность.

Недавно были проведены исследования цитокининовой активности N6-замещенных аденозинов на чувствительной к действию цитокининов тест-системе арабидопсиса, экспрессирующего репортерный ген GUS под контролем цитокинин-чувствительного промотора ARR5. Было показано, что ряд цитокининовых нуклеозидов демонстрируют высокую цитокининовую активность сравнимую с BAP [27].

Таким образом, существует большое количество N6-замещенных аденозинов, проявляющих цитокининовую активность на различных видах растений. Можно предположить, что цитокининовая активность N6-замещенных аденозинов связана с их внутриклеточным превращением в формы гетероциклических оснований, поскольку главным условием проявления биологического эффекта является способность образования комплексов с цитокининовыми рецепторами.

Замещение атома галогена алкиламинами в 6-галогензамещенных пуриновых

Нами была исследована возможность алкилирования триметилсилильных (TMS) производных O-ацетил защищенного аденозина 1 и тетраацетиладенозина 17 алкилгалогенидами. TMS-производные гетероциклических соединений широко используются в химии нуклеозидов [119]. В качестве силилирующего агента использовался N,O-бис(триметилсилил)ацетамид (BSA). Оказалось, что TMS-производное триацетиладенозина с алкилгалогенидами не реагирует. Напротив, TMS-производное тетраацетиладенозина 17 региоселективно алкилируется по 1-N-положению различными алкилгалогенидами, такими как изопентенилбромид и бензилбромид (схема 2). 9,18R= OQ 10, Алкилирование бензилбромидом и изопентенилбромидом в ацетонитриле протекало с хорошими выходами 59-67% (таблица 2, строки 1-4). Реакция с пропаргилбромидом протекала с низким выходом 1 -Ж-замещенного производного 20 (14%) (таблица 2, строка 6), что может быть связано с нестабильностью пропаргилбромида в условиях реакции. Использование Bu4NI значительно увеличивает скорость реакции (таблица 2, строки 2, 4). Последующие стадии деблокирования действием 7М Мїз/МеОН и перегруппировки Димрота обработкой водным аммиаком позволили выделить конечные Л -замещенные производные аденозина 9, 10 с общими выходами 32% и 54% соответственно (схема 2). 1 -ЛПропаргил-замещенное производное 20 оказалось нестабильно в водном аммиаке, в результате чего в реакционной смеси наблюдалось образование нескольких продуктов с близкой хроматографической подвижностью.

Предварительное деблокирование требовалось, поскольку ацетильная группа в Л?6-положении затрудняет перегруппировку Димрота, протекающую с образованием промежуточного продукта, содержащего альдегидную группу (схема 9, обзор литературы).

Аналогичные результаты были получены при 1 -#-алкилировании TMS-производного Л -ацетил-3 ,5 -ди-О-ацетил-2-дезоксиаденозина (21) с последующим деблокированием и перегруппировкой Димрота с получением Л -замещенных 2-дезокси производных 11, 12 с общими выходами 39-58% (схема 3) (таблица 2, строки 7, 8).

Региоселективность алкилирования была подтверждена корреляционными спектрами {1H,1H}-NOESY и {1H,13C}-HMBC. В двумерном спектре NOESY 1-N-бензил-тетраацетиладенозина 18 наблюдалась пространственная корреляция между СН2 группой бензильного остатка и H-2 протоном остатка аденина (рисунок 1). В HMBC-спектре 18 присутствуют кросс-пики между сигналами протонов CH2 группы бензильного остатка и сигналами C-2 и C-6 атомов остатка аденина, а также между атомом углерода CH2 группы и H-2 протоном остатка аденина (рисунок 2). В двумерных спектрах N6-бензил-N6-ацетил-2,3,5-три-O-ацетиладенозина, являющегося изомером нуклеозида 18, эти взаимодействия отсутствуют. Рисунок 1. NOESY спектр 1-#-бензил- -ацетил-2 ,3 ,5 -три-0-ацетиладенозина (18).

Первичные данные по биологической активности показали, что природные цитокининовые нуклеозиды Л6-бензиладенозин (9) и Л6-изопентениладенозин (10) проявляют высокую противовирусную активность, однако являются цитотоксичными (см. раздел 2.6. Биологическая активность Л6-производных аденозина). Данные природные нуклеозиды были выбраны в качестве соединений-лидеров для дальнейшей оптимизации их структуры и изучения биологической активности.

Оптимизация структуры Л6-производных аденозина заключалась в изменении структуры гидрофобного заместителя в N6 положении, а также модификации остатка рибозы (рисунок 3). Был получен ряд производных Л6-изопентениладенозина, содержащих в N6 положении различные терпеновые и алифатические заместители, а также ряд производных Л6-бензиладенозина, содержащих заместители с различной длиной и структурой линкера, соединяющего фенильный остаток с аминогруппой гетероциклического основания, дифенилметильный и тритильный заместители, и различные конденсированные ароматические заместители. большого количества коммерчески доступных алкилгалогенидов и спиртов Недавно в нашей лаборатории был разработан эффективный метод получения N6 замещенных производных аденозина путём региоселективного алкилирования тетраацетиладенозина 17 [112]. Преимуществом данного метода является возможность конденсации как с алкилгалогенидами, так и со спиртами (схема 4). Исходный субстрат 17 региоселективно алкилируется по N6-положению различными алкилгалогенидами в условиях катализа органическими основаниями (схема 4, условия i). С другой стороны, 17 региоселективно конденсируется с различными спиртами в условиях реакции Мицунобу в присутствии диэтилазодикарбоксилата (DEAD) и трифенилфосфина (схема 4, условия ii). Использование позволяет получить обширную библиотеку N6-производных аденозина, содержащих разнообразные заместители.

Реакция Мицунобу является удобным и мягким химическим методом, однако, основным его недостатком является сложность очистки защищенных аденозиновых производных от образующихся продуктов реакции – Ph3PO и (NHCOOEt)2. Для выделения ацетил-защищенных производных требуется многократная хроматографическая очистка в различных системах растворителей, что приводит к снижению выходов. В связи с этим ацилированные производные частично очищались однократной хроматографией на силикагеле, и затем подвергались деблокированию. Конечные N6-производные аденозина легко могут быть очищены от оставшихся в реакционной смеси Ph3PO и (NHCOOEt)2, поскольку имеют значительно меньшую хроматографическую подвижность. Однако, при выделении конечных N6-замещенных продуктов после деблокирования может возникнуть другая трудность. Скорость деблокирования N-ацетил и O-ацетильных групп промежуточных N6-замещенных производных аденозина при обработке аммиаком в метаноле различная: N-ацетильная группа более устойчива в этих условиях и, как следствие, в ходе деблокирования образуется большое количество ацетамида. С присутствием ацетамида связана сложность очистки конечных продуктов хроматографией на силикагеле, поскольку в ряде случаев ацетамид имеет одинаковую хроматографическую подвижность с Л -замещенными производными аденозина. Нами было обнаружено, что использование пропиламина в метаноле (схема 4, условия iii) позволяет избежать трудностей с выделением конечных продуктов 24-41 и является оптимальным условием деблокирования Л -производных аденозина, вследствие того, что образующийся #-пропилацетамид имеет большую хроматографическую подвижность на силикагеле, чем ацетамид и Л -производные аденозина.

Аминирование 2 ,3 ,5 -три-О-ацетил-6-хлор-пуринрибозида

В работе использовались аналитически чистые коммерчески доступные реагенты производства Sigma-Aldrich, Acros Organics, и Glenn Research. При необходимости очистку и абсолютирование растворителей проводили по стандартным методикам [137].

Препаративную адсорбционную хроматографию проводили на колонках с силикагелем Kieselgel 60 (0.063-0.200 mm, Merck), тонкослойную хроматографию (ТСХ) – на алюминиевых пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck) с флуоресцентным индикатором. Визуализацию проводили облучением УФ светом с длиной волны 254 нм. Элюенты для хроматографии указаны в тексте.

Спектры ЯМР регистрировали на спектрометре и Bruker AMX 400 (Германия) (400 или 600 МГц для 1Н и 100 или 150 МГц для 13С, соответственно) при 300 K. Химические сдвиги () приведены в миллионных долях (м.д.) относительно остаточных сигналов атомов водорода в дейтерированых растворителей (CDCl3, 1H: 7.26 м.д., 13C: 77.1 м.д.; DMSO-d6, 1H: 2.50 м.д, 13C: 39.5 м.д.). Величины констант спин-спинового взаимодействия (J) приведены в герцах (Гц). При описании спектров 1H-ЯМР приняты следующие сокращения: с - синглет, ус - уширенный синглет, д - дублет, дд – дублет дублетов, ддд – дублет дублетов дублетов, т – триплет, дт – дублет триплетов, к – квартет, м – мультиплет.

Точки плавления определяли в стеклянных капиллярах на приборе Electrothermal Melting Point Apparatus IA6301 (Великобритания).

Масс-спектры высокого разрешения были зарегистрированы на приборе Bruker Daltonics micrOTOF-Q II методом электрораспылительной ионизации (ESI) [138]. Измерения выполнены на положительных ионах. Напряжение на капилляре: 4500 V; диапазон сканирования масс: m/z 50 - 3000; калибровка: внешняя (Electrospray Calibrant Solution, Fluka); давление на распылителе: 0,4 бар; скорость потока: 3 мкл/мин; газ-распылитель: азот (4 л/мин); температура интерфейса: 200C. Образцы подавались в распылительную камеру масс-спектрометра после жидкостного хроматографа Agilent 1260, оснащенного колонкой Agilent Poroshell 120 EC-C18 (3,0 50 мм; 2,7 мкм); скорость потока 0,2 мл/мин; образцы вещества подавались в ВЭЖХ-хроматограф из раствора ацетонитрил-вода 1:1 (5 мкл) и элюировались в линейном градиенте концентраций ацетонитрила (50 100%). К раствору 2 ,3 ,5 -три-0-ацетиладенозина (1) (200 мг, 0.51 ммоль) в сухом DMF добавляли йодметан (0.063 мл, 1.02 ммоль) и оставляли при комнатной температуре. Через 24 часа упаривали DMF, остаток соупаривали с толуолом (2x10 мл) и растворяли в ацетоне (2 мл). Затем к раствору добавляли гексан (5 мл) и оставляли при -20С в течение 1 часа. Полученный осадок фильтровали, промывали охлажденной до -20С смесью ацетонтексан - 1:1 (2x2 мл) и сушили под вакуумом. Выход 256 мг, 94% (белый порошок); Rf = 0.08 (СН2СЬ - ЕЮН, 95:5). Н ЯМР (CD3OD): 5 = 2.07 (с, ЗН, Ас), 2.08 (с, ЗН, Ас), 2.14 (с, ЗН, Ас), 3.91 (с, ЗН, W-CH3), 4.39 (дд, Ш, 75ъ,5 а= 12.2 Гц, Ль,4 = 5.0 Гц, Н5Ъ), 4.45 (дд, Ш, J5%5b= 12.2 Гц, JyaA = 3.6 Гц, Н5 а), 4.50 (ддд, Ш, J4;y= 5.4 Гц, J4;sb = 5.0 Гц, 74 ,5 а= 3.6 Гц, Н4 ), 5.65 (дд, Ш, 7з-,2 = 5.5 Гц, 7з-,4 = 5.4 Гц, НЗ ), 5.96 (дд, Ш, J2;v = 5.0 Гц, J2;y= 5.5 Гц Н2 ), 6.30 (дд, Ш, 7г,2 = 5.0 Гц, HI ), 8.47 (с, Ш, Н2), 8.58 (s, Ш, Н8). Масс-спектр (HRMS): m/z [М]+ вычислено для C17H22N5O7: 408.1514; найдено: 408.1511.

Методика аналогична получению соединения 3, исходя из 3 ,5 -ди-0-ацетил-2 -дезоксиаденозина (2) (200 мг, 0.59 ммоль). Выход 205 мг, 73% (белый порошок); Rf = 0.12 (CH2CI2 - ЕЮН, 95:5). Н ЯМР (CD3OD): 5 = 2.04 (с, ЗН, Ас), 2.12 (с, ЗН, Ас), 2.71 (ддд, Ш, 72-8,21)= 14.3 Гц, 72 аД = 6.3 Гц, 72 а,з = 3.1 Гц, Н2 а), 3.09 (ддд, Ш, 72-ь,2 а= 14.2 Гц, 72ъд = 7.2 Гц, 72ъ,з = 6.8 Гц, Н2Ъ), 3.91 (с, ЗН, Me), 4.41-4.34 (м, ЗН, Н4 , Н5 а, Н5Ъ), 5.48 (ддд, Ш, 7з ,2-ь= 6.8 Гц, 7з ,4 = 6.0 Гц, 7з-,2 а= 3.1Гц, НЗ ), 6.49 (дд, Ш, 7г,2 а= 6.3 Гц, 7г,2Ъ= 7.2 Гц, HI ), 8.47 (с, Ш, Н8), 8.55 (с, Ш, Н2). Масс-спектр (HRMS): m/z [М]+ вычислено для C15H20N5O5: 350.1459; найдено: 350.1479.

К раствору нуклеозида 1 (200 мг, 0.51 ммоль) в DMF (2 мл) добавляли карбонат бария (246 мг, 1.25 ммоль), йодид калия (166 мг, 1 ммоль) и бензилбромид (0.119 мл, 1 ммоль). Реакционную смесь оставляли перемешиваться с обратным водяным холодильником при 65С в течение 24 часов. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этилацетатом (20 мл) и отфильтровывали через Hyflo Super Cel (целит). Целит промывали этилацетатом (20x10 мл), и полученный фильтрат последовательно промывали с 10% водн. NaHC03 (20 мл), 0.1 М водн. Na2S203 (20 мл) и диет. Н20 (2x20 мл). Органический слой сушили над безводным Na2S04, отфильтровывали и упаривали в вакууме. Остаток упаривали с толуолом (2x5 мл), затем с гексаном (5 мл) и сушили в вакууме. Выход 210 мг, 87% (сироп); Rf = 0.16 (СН2С12 -ЕЮН, 95:5). Н ЯМР (CDCb): 5 = 2.08 (с, 6Н, Ас), 2.12 (с, ЗН, Ас), 4.28-4.36 (м,Ш, Н5Ъ), 4.37-4.45 (м, 2Н, Н4 , Н5 а), 5.27 (с, 2Н, lN-CH2Ph), 5.60 (дд, Ш, Ъ,т= 5.0 Гц, h;v= 4.9 Гц, НЗ ), 5.86 (дд, Ш, Ъ,г= 6.0 Гц, J2 ,3 = 5.0 Гц, Н2 ), 5.98 (д, Ш, Jr,2 = 6.0 Гц, HI ), 7.38-7.27 (м, 5Н, Ph), 7.72 (с, Ш, Н2), 7.73 (с, Ш, Н8).

Синтез N6-замещенных производных 2-дезоксиаденозина

К раствору -ацетил-2 ,3 ,5 -три-0-ацетиладенозина (17) (435 мг, 1 ммоль), Ph3P (393 мг, 1.5 ммоль), и гераниола (0.26 мл, 1.5 ммоль) в THF (5 мл) добавляли DEAD (0.24 мл, 1.5 ммоль) и оставляли раствор при комнатной температуре в течение 24 ч. Реакцию контролировали с помощью ТСХ (силикагель, СН2С12-ЕЮН - 97:3). Затем реакционную смесь упаривали в вакууме, остаток разбавляли СН2С12 и экстрагировали насыщенным водным раствором NaCl (ЗхЮ мл). Органический слой сушили над безводным Na2S04, отфильтровывали и упаривали в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем в системе СН2СЬ-ЕЮН - 97:3. Фракции, содержащие продукт, объединяли и упаривали в вакууме. Частично очищенный нуклеозид растворяли в 4М растворе РгКНг в МеОН (50 ммоль) и оставляли при комнатной температуре в течение 24 ч, после чего реакционную смесь упаривали в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем. Колонку промывали в системе СНгСЬ-ЕЮН - 95:5, продукт элюировали в системе СНгСЬ-ЕЮН - 90:10. Фракции, содержащие продукт, объединяли, упаривали и сушили в вакууме над Р2О5. Выход 24 составил 155 мг, 39% на две стадии (белый порошок). Rf 0.13 (СН2СІ2-ЕЮН, 97:3). Т.пл. 137-140С (разложение). Н ЯМР (400 МГц, DMSO-Je): 5 = 1.54 (с, ЗН, СНз), 1.59 (с, ЗН, СНз), 1.70 (с, ЗН, СНз), 1.92-1.99 (м, 2Н, СН2СН2СН=\ 2.00-2.08 (м, 2Н, СН2СН2СШ, 3.55 (ддд, Ш, J5b,4 = 3.6, Ль,5-а= - 12.0, Уоцз-ь = 7.3, Н5Ъ), 3.68 (ддд, Ш, J5%5b = 12.0, J5 aA = 3.6, JoH,5 a = 4.6, Н5 а), 3.96 (ддд, Ш, J4;y = 3.6, 74 ,5 а= 3.6, J4;sb = 3.6 Гц, Н4 ), 4.09 (ус, 2Н, NHCHA 4.15 (ддд, Ш, Jy,2 = 5.2, Jy,4 = 3.6, JOH,3 = 4.6, ИЗ ), 4.60 (ддд, Ш, J2;v= 6.l, J2;y = 5.2, JOH,2 = 6.2, Н2 ), 5.06 (тт, Ш, JcH-cm = 7.0, JcH-Me = 1.4 (транс) СНСМе2), 5.13 (д, Ш, 7он,з = 4.6, З ОН, обменивается с D20), 5.31 (т, JCH-СШ = 6.5 Гц, NHCH2CH), 5.36 (дд, Ш, Jya,5b = 12.0, Уоцзъ = 7.2 Гц, Уоцз-а = 4.6 Гц, 5 ОН, обменивается с D20), 5.39 (д, Ш, Jon,2 = 6.2 Гц, 2 ОН, обменивается с D20), 5.88 (д, Ш, 7г,2 = 6.1 Гц, НГ), 7.84 (ус, Ш, NH), 8.19 (с, Ш, Н8), 8.32 (с, Ш, Н2). 13С ЯМР (100 МГц, DMSO-Je): 5 = 16.12, 17.48, 25.38, 25.94, (СН2, СН2, СНз, СНз, СНз), 37.68 (NHCH2), 61.63 (С5 ), 70.65 (СЗ ), 73.48 (С2 ), 85.84 (С4 ), 87.94 (СГ), 119.75 (С5), 121.73 (СН=), 123.91 (СН=), 130.75 (=С(Ме)СН2), 136.64 (=СМе2), 139.59 (С8), 148.30 (С4), 152.27 (С2), 154.35 (С6). Масс-спектр: m/z [М+Н]+ вычислено для C20H30N5O4: 404.2292, найдено: 404.2284; m/z [M+Na]+ вычислено для C2oH29N504Na: 426.2112, найдено: 426.2102.

Л6-Нериладенозин (25) Аналогичная получению нуклеозида 24 конденсация Л -ацетил-2 ,3 ,5 -три-0-ацетиладенозина (17) (435 мг, 1 ммоль) с неролом (0.26 мл, 1.5 ммоль) в присутствии Ph3P (393 мг, 1.5 ммоль) и DEAD (0.24 мл, 1.5 ммоль) в THF (5 мл) с последующим деблокированием в 4М растворе PrNH2 в МеОН (50 ммоль) приводила к нуклеозиду 25. Выход 192 мг, 48% на две стадии (белый порошок). Rf 0.15 (СН2СІ2-ЕЮН, 97:3). Т.пл. 129-130С (разложение). ЯМР (400 МГц, BMSO-d6): 5 = 1.58 (с, ЗН, СНз), 1.64 (с, ЗН, СНз), 1.67 (с, ЗН, СНз), 2.03-2.16 (м, 4Н, =С(Ме)СН2СН2, СН2СН2СН=), 3.55 (ддд, Ш, Ль,5-а = 12.2 Гц, J5b,4 = 3.5 Гц, J5b,oa = 6.5 Гц, Н5Ъ), 3.67 (ддд, Ш, Js sb = 12.2 Гц, 75 а,4 = 3.5 Гц, Js%on= 3.8 Гц, Н5 а), 3.96 (ддд, Ш, J4;y= 3.5 Гц, J4;ya = 3.5 Гц, J4;sb = 3.5 Гц, Н4 ), 4.09 (ус, 2Н, NHCH2), 4.15 (ддд, Ш, 7он,з- = 4.6 Гц, Jy,2 = 4.5 Гц, JyA = 3.5 Гц, НЗ ), 4.60 (ддд, Ш, У2д = 6.1 Гц, J2;y= 4.5 Гц, JOH,2 = 6.3 Гц, Н2 ), 5.10-5.16 (м, 2Н, З ОН, СНСМеА 5.31 (т, JcH-cm = 6.6 Гц, NHCH2CH), 5.35 (дд, Ш, Уоцз-ь = 6.5 Гц, Уоцз-а = 3.8 Гц, 5 ОН, обменивается с D20), 5.38 (д, Ш, Уон.2 = 6.3 Гц, 2 ОН, обменивается с D20), 5.88 (д, Ш, Jv,2 = 6.1 Гц, НГ), 7.80 (ус, Ш, NH), 8.18 (с, Ш, Н8), 8.32 (с, Ш, Н2). 13С ЯМР (100 МГц, DMSO-Je): 5 = 17.52, 23.09, 25.48, 26.08, 31.67, (СН2, СН2, СНз, СНз, СНз), 37.36 (NHCH2), 61.67 (С5 ), 70.64 (СЗ ), 73.50 (С2 ), 85.88 (С4 ), 87.95 (СГ), 119.80 (С5), 122.68 (СН=), 124.05 (СН=), 131.07 (=С(Ме)СН2), 136.85 (=СМе2), 139.64 (С8), 148.30 (С4), 152.29 (С2), 154.39 (С6). Масс-спектр (HRMS): m/z [М+Н]+ вычислено для C2oH3oN504: 404.2292, найдено: 404.2286; m/z [M+Na]+ вычислено для С20Н29№СШа: 426.2112, найдено: 426.2105. Л6-[(S)-()-Периллил]аденозин (26) Аналогичная получению нуклеозида 24 конденсация Л -ацетил-2 ,3 ,5 -три-0-ацетиладенозина (17) (435 мг, 1 ммоль) с (8)-(-)-периллиловым спиртом (0.238 мл, 1.5 ммоль) в присутствии РпзР (393 мг, 1.5 ммоль) и DEAD (0.24 мл, 1.5 ммоль) в THF (5 мл) с последующим деблокированием в 4М растворе PrNH2 в МеОН (50 ммоль) приводила к нуклеозиду 26. Выход 241 мг, 60% на две стадии (белый порошок). Rf 0.11 (СН2С12-ЕЮН, 97:3). Т.пл. 158-160С (с разложением). Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): 5 = 1.32-1.45 (м, Ш, Н-периллил), 1.68 (с, ЗН, СНз-периллил), 1.71-1.91 (м, 2Н, СН2- периллил), 1.98-2.13 (м, 4Н, 2хСН2- периллил), 3.55 (дд, Ш, J5b,ya = 12.1, 75-ь,4 = 3.2 Гц, Н5Ъ), 3.68 (дд, Ш, Jya,sb = 12.1 JyaA = 3.4 Гц, Н5 а), 3.96 (ддд, Ш, J4;y = 3.3 Гц, J4;s a = 3.4 Гц, J4;sb = 3.2 Гц, Н4 ), 4.03 (ус, 2Н, NHCH2), 4.12-4.18 (м, Ш, НЗ ), 4.62 (дд, Ш, J2;v= 6.l Гц, J2;y= 5.2 Гц, Н2 ), 4.68 (с, 2Н, С(СН3)=СН2 - периллил), 5.13 (ус, Ш, З ОН, обменивается с D20), 5.43-5.30 (м, 2Н, 5 ОН, =СНСН2 - периллил), 5.53 (ус, Ш, 2 ОН, обменивается с D20), 5.88 (д, Ш, Jv,2 = 6.1 Гц, НГ), 7.89 (ус, Ш, NH), 8.19 (с, Ш, Н8), 8.34 (с, Ш, Н2). 13С ЯМР (100 МГц, DMSO-Je): 5 = 20.54, 26.57, 27.06, 29.81, (СН2, СН2, СН2, СНз), 40.52 (СНС(Ме)=), 44.53 (NHCH2), 61.65 (С5 ), 70.63 (СЗ ), 73.42 (С2 ), 85.88 (С4 ), 87.94 (СГ), 108.77 (СН(Ме)С=СН2), 119.68 (С5), 120.23 (=СН), 134.77 (С(Ме)=), 139.67 (С8), 148.32 (С4), 149.25 (NHCH2C=), 152.28 (С2), 154.68 (С6). Масс-спектр (HRMS): m/z [М+Н]+ вычислено для С20Н28№О4: 402.2136, найдено 402.2135; m/z [M+Na]+ вычислено для C2oH27N504Na: 424.1955, найдено 424.1948. Л6-[(1R)-(-)-Миртенил]аденозин (27)

Аналогичная получению нуклеозида 24 конденсация Л -ацетил-2 ,3 ,5 -три-0-ацетиладенозина (17) (435 мг, 1 ммоль) с (1К)-(-)-миртенолом (0.24 мл, 1.5 ммоль) в присутствии РпзР (393 мг, 1.5 ммоль) и DEAD (0.24 мл, 1.5 ммоль) в THF (5 мл) с последующим деблокированием в 4М растворе PrNH2 в МеОН (50 ммоль) приводила к нуклеозиду 27. Выход 130 мг, 33% на две стадии (белая пена). Rf 0.11 (СН2С12-ЕЮН, 97:3). Н ЯМР (400 МГц, DMSO-Je): 5 = 0.76 (с, ЗН, СНз-миртенил), 1.10 (д, Ш, J = 8.4 Гц, Н-миртенил), 1.22 (с, ЗН, СНз-миртенил), 2.26-2.00 (м, 4Н, миртенил), 2.34