Мышь аутбредной популяции ICR - лабораторная модель для оценки эффективности препаратов против оспы обезьян Овчинникова Алёна Сергеевна

Содержание к диссертации

Введение

1 Литературный обзор: лабораторные животные для оспы обезьян, используемые при оценке эффективности противовирусных препаратов 10

1.1 Чувствительность лабораторных животных, человека и их клеток к вирусу оспы обезьян 10

1.2 Диссеминация вируса оспы обезьян в организме лабораторных животных и человека 17

1.3 Изменения в органах и тканях лабораторных животных и человека, инфицированных вирусом оспы обезьян, по данным световой и электронной микроскопии 26

1.4 Оценка эффективности препаратов против оспы обезьян с использованием лабораторных видов модельных животных 37

1.5 Заключение по обзору литературы 43

2 Материалы и методы. 46

2.1 Вирусы 46

2.2 Лабораторные животные 46

2.3 Перевиваемая клеточная культура 47

2.4 Условия забора крови у людей 47

2.5 Методы приготовления первичных культур клеток подопытных животных и крови человека 48

2.6 Методы инфицирования мышей вирусом и подготовки биоматериалов от них 51

2.7 Метод определения титров противооспенных антител 52

2.8 Методы изучения динамики накопления вирусов в первичных клеточных культурах 52

2.9 Метод определения 50%-й инфицирующей дозы вируса в первичных клеточных культурах 53

2.10 Химически синтезированные соединения 54

2.11 Схемы применения и критерии эффективности химически синтезированных соединений у инфицированных вирусом мышей 54

2.12 Метод вирусологического анализа проб 55

2.13 Методы патоморфологических исследований 56

2.14 Метод прогнозной оценки 50 %-х инфицирующих доз вируса для животных и человека 56

2.15 Методы статистической обработки результатов 57

Результаты и их обсуждения 59

3 Изучение возможности использования мыши аутбред ной популяции icr в лабораторной модели для оспы обезьян с целью оценки эффективности препаратов 59

3.1 Чувствительность подопытных животных и человека к патогенным орто-поксвирусам 59

3.2 Распространение вируса оспы обезьян в организме мышей 87

3.3 Патоморфологические изменения у мышей, инфицированных вирусом оспы обезьян 93

3.4 Оценка возможности использования мыши аутбредной популяции ICR в лабораторной модели для оспы обезьян 101

3.5 Испытание лабораторной модели для оспы обезьян и пределы практического её использования 108

Заключение 114

Список сокращений и условных обозначений 117

Список литературы 118

Список иллюстративного материала

• Изменения в органах и тканях лабораторных животных и человека, инфицированных вирусом оспы обезьян, по данным световой и электронной микроскопии
• Методы приготовления первичных культур клеток подопытных животных и крови человека
• Схемы применения и критерии эффективности химически синтезированных соединений у инфицированных вирусом мышей
• Патоморфологические изменения у мышей, инфицированных вирусом оспы обезьян

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Прошло уже около 60 лет с тех пор как был открыт возбудитель особо опасной зооантропонозной вирусной инфекции у людей: вирус оспы обезьян (ВОО), который относится к тому же роду Orthopoxvirus (семейство Poxviridae), что и возбудитель натуральной оспы, и обладает высокой летальной активностью для людей (до 17%) (Jezek et al., 1987; Gispen, 1975; Di Giulio et al., 2004). Тем не менее, по настоящее время в мире не существует разрешенных к применению лечебно-профилактических химиопрепаратов против ортопоксвирусных заболеваний, включая и оспу обезьян (Magee et al., 2008; Grosenbach et al., 2011). В то же время по сравнению с 20-м веком масштабность и частота возникновения вспышек оспы обезьян среди людей в 21-м веке значительно выросла (Борисевич и др., 2012; Levine et al., 2007; Rimoin et al., 2010), что, вероятно, связано со снижением у них напряженности иммунитета и величины иммунной прослойки к возбудителю этого заболевания из-за прекратившейся более 30 лет тому назад вакцинации людей от натуральной оспы (Jezek et al., 1986; Cohen, 1997).

Одним из препятствий быстрому прогрессу в разработке медицинских средств защиты от оспы обезьян является отсутствие дешевых модельных биосистем на основе аутбредных иммунокомпетентных мышей для массового скрининга противооспенной активности препаратов (Americo et al., 2010; Hutson et al., 2010; Stabenow et al., 2010), что делает актуальной проблему разработки такой лабораторной модели.

Степень разработанности. До настоящего времени при поиске модельных видов животных для оспы обезьян с целью оценки защитной эффективности разрабатываемых препаратов ученые ориентировались только на воспроизведение внешних признаков этого заболевания человека. Тем не менее, подобранные для этой цели мыши из числа инбредных иммунодефицитных линий CAST/EiJ и C57BL/6 stat1-/- (Americo et al., 2010; Hutson et al., 2010; Stabenow et al., 2010) не моделировали основную клиническую картину оспоподобного заболевания (отсутствие сыпи и лимфаденита), и их использование было сопряжено с рядом других проблем, связанных с относительно высокой стоимостью и неадекватным отражением состояния человеческой популяции:

могут лишь частично воспроизводить инфекционный процесс у людей с подавленной иммунной системой, процент которых во время эпидемических вспышек оспы обезьян, видимо, не очень значителен;

вряд ли могут быть применены для оценки защитной эффективности препаратов, в основе действия которых лежит механизм влияния на иммунную систему;

относительно дорогие и не имеют выраженного генетического разнообразия, тогда как человеческая популяция, по существу, является аутбредной (межсемейное, межнациональное и межрасовое скрещивание).

В то же время существует другой подход по поиску лабораторной модели для оценки защитной эффективности противовирусных препаратов, сориентированный на воспроизведение не внешней клинической симптоматики вирусного заболевания у человека, а инфекционного процесса в первичных и вторичных органах и клетках-мишенях (Сергеев и др., 2013).

Цель и задачи. Основываясь на вышеупомянутом подходе, целью нашего исследования явилось изучение возможности использования иммунокомпетентной мыши аутбредной популяции ICR в лабораторной модели для оценки эффективности препаратов против оспы обезьян.

Чтобы достичь данной цели, надо было решить следующие задачи:

1. оценить чувствительность первичных клеток-мишеней животных и человека к патогенным ортопоксвирусам;

2. изучить чувствительность мышей к ВОО в экспериментах по их интраназаль-ному (и/н) заражению;

3. сделать прогнозную оценку чувствительности к патогенным ортопоксвирусам животных и человека, используя данные по заражению их первичных клеток-мишеней и животных;

4. изучить динамику распространения ВОО в организме и/н зараженных мышей;

5. исследовать патоморфологические изменения в организме мышей, и/н инфицированных ВОО;

6. оценить возможность использования мыши в лабораторной модели для оспы обезьян;

7. провести испытание лабораторной модели для оспы обезьян и определить пределы практического её использования.

Научная новизна работы:

определена чувствительность при и/н заражении мышей аутбредной популяции ICR к ВОО (центральноафриканский штамм V79-1-005) по показателю 50%-й инфицирующей дозы (ID₅₀), оцененному по наличию инфекционного процесса в легких; на основе данных по чувствительности первичных клеток животных определены прогнозные величины ID₅₀ для ВОО в отношении мышей и сурков, а также для вируса натуральной оспы (ВНО) (штамм Ind-3a) в отношении мышей аутбредной популяции ICR; используя результаты опытов in vitro, выполненных на первичных человеческих моноцитах-макрофагах крови, оценена прогнозная величина ID₅₀ ВНО для людей;

представлен патогенез оспы обезьян у и/н зараженных ВОО (центральноафри-канский штамм V79-1-005) аутбредных мышей популяции ICR с учетом динамики накопления патогена в организме этих животных (выявленные первичные и вторичные органы-мишени для вируса), гистологических изменений и идентифицированных типов клеток-мишеней;

с использованием разработанной лабораторной модели «мышь аутбредной популяции ICR – центральноафриканский штамм V79-1-005 ВОО» представлены данные по оценке защитной активности некоторых химиопрепаратов (НИОХ-14, НИОХ-32 и ST-246).

Теоретическая и практическая значимость работы:

1. с использованием разработанной нами лабораторной модели «мышь аутбред-ной популяции ICR - центральноафриканский штамм V79-1-005 ВОО» было успешно проведено доклиническое исследование российского противооспенного химически синтезированного соединения НИОХ-14, что открывает перспективу его дальнейшего продвижения в направлении клинических исследований;

2. разработанная нами лабораторная модель «мышь аутбредной популяции ICR – центральноафриканский штамм V79-1-005 ВОО», а также соответствующие методические рекомендации по ее использованию (МР 4.2.001-16 Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» - ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») могут быть применены для оценки защитной эффективности других препаратов от оспы обезьян;

3. при работе с мышами, первичными культурами клеток животных и человека с использованием ВОО и ВНО по настоящее время применяются в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» методы, описанные в разработанной нами инструкции № 1/02;

4) ранее известная методология прогнозного определения величины ID₅₀ вируса, основанная на использовании первичных клеточных культур человека и животных и продемонстрировавшая адекватность результатов при ее применении тем, которые были получены в прямых экспериментах на животных, может быть взята для оценки чувствительности того или иного макроорганизма к исследуемым патогенным ортопоксвиру-сам.

Методология и методы исследования. С целью проверки применимости выбранного вида модельного животного для оспы обезьян в работе использовали методологию оценки показателей инфицирования этого вида животных ВОО через респираторный тракт в сравнении с таковыми у человека (или известных видов модельных животных), основанную на изучении у них инфекционного процесса. Для изучения чувствительности первичных клеток-мишеней людей и подопытных животных к патогенным ортопоксвирусам (CID₅₀) применяли ранее разработанный нами подход получения таких клеток из органов и тканей и поддержания их в жизнеспособном состоянии необходимое время в экспериментах in vitro. В ряде случаев в работе была использована методология прогнозной оценки величин ID₅₀ ВОО и ВНО для животных и людей, основанная на применении для этих вирусов CID₅₀, полученных на соответствующих первичных клетках. В исследованиях также были применены традиционные вирусологические, культуральные, гистологические, электронно-микроскопические и серологические методы исследований.

Положения, выносимые на защиту:

4. значение чувствительности мышей аутбредной популяции ICR к центрально-африканскому штамму V79-1-005 ВОО (ID₅₀), оцененной с учетом регистрации вируса в легких через 7 сут после и/н заражения, составляет 2,4 (2,0…2,8) lg БОЕ;

5. мыши аутбредной популяции ICR при и/н заражении 25 ID₅₀ центральноафри-канского штамма V79-1-005 ВОО имеют генерализованную бессимптомную инфекцию, вызывающую воспалительно-некротические изменения, ограниченные в основном респираторными органами, при этом ведущий механизм диссеминации патогена в организме этих животных – гематогенный с его размножением в клетках крови и/или кровеносной системы;

6. у мышей аутбредной популяции ICR, и/н инфицированных ВОО (центрально-африканский штамм V79-1-005), происходит его размножение в первичных клетках-мишенях для этого патогена (в макрофагах и эпителиоцитах респираторных органов), а также в некоторых других типах клеток (эндотелиоцитах, фибробластах, плазмоцитах и ретикулярных клетках);

7. мыши аутбредной популяции ICR могут представляться в лабораторной модели для оспы обезьян с целью оценки защитной эффективности препаратов.

Степень достоверности и апробация результатов. Статистическую обработку и сравнение экспериментальных данных проводили стандартными методами с помощью пакета компьютерных программ «Statistica 6.0» (StatSoft Inc. 1984-2001). Результаты этой работы были доложены на 6 российских и международных научных форумах, опубликованы в 5 печатных работах, включая 2 зарубежные.

Личный вклад соискателя: в экспериментальной оценке в опытах in vitro чувствительности мышей и сурков к ВОО, а также чувствительности сурков, мышей, цыплят и человека к ВНО; в изучении чувствительности мышей к ВОО в экспериментах по их и/н заражению; в изучении динамики распространения ВОО в организме инфицированных мышей (при участии заведующего лабораторией коллекции вируса натуральной оспы и ортопоксвирусов, кандидата медицинских наук Сергеева Ар.А.); в изучении патоморфо-

логических изменений в организме мышей, инфицированных вирусом (при участии заведующего отделом микроскопических исследований Таранова О.С.); в проведении оценки возможности использования мыши аутбредной популяции ICR в качестве модельного для оспы обезьян вида животных на основе имеющихся теоретических и экспериментальных данных; в проведении оценки эффективности противооспенных препаратов на мышах (при участии научного сотрудника отдела «Коллекция микроорганизмов», кандидата медицинских наук Сергеева Ал.А.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, список сокращений и условных обозначений, список литературы и список иллюстративного материала. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 12 рисунками. Список литературы включает 196 источников, в том числе 156 зарубежных.

Изменения в органах и тканях лабораторных животных и человека, инфицированных вирусом оспы обезьян, по данным световой и электронной микроскопии

Чувствительность первичных культур клеток животных и человека к орто-поксвирусам. В научной литературе отсутствуют сведения, касающиеся оценки чувствительности различных видов животных и человека к ВОО и ВНО на основе результатов, полученных при инфицировании первичных клеток этих млекопитающих. Тем не менее, имеется достаточно противоречивая информация об особенностях взаимодействия с такими клетками некоторых ортопоксвирусов. В экспериментах на человеческих дермальных фибробластах [122] была продемонстрирована способность ВОО к размножению. Используя перитонеальные макрофаги вакцинированных и интактных кроликов и мышей, а также вирус осповакцины (ВОВ), ряд исследователей [43, 58, 103, 126, 130] отметил существенное снижение или полное отсутствие продукции вируса этими клетками, полученными от иммунизированных животных (блокирование инфекционного процесса на поздней стадии), по сравнению с выраженным его размножением в аналогичных клетках интактных животных. В противоположность последнему другие ученые [145] получили результат, доказывающий отсутствие полного цикла репродукции вируса в перитонеальных макрофагах интактных мышей (абортивное течение инфекции на ранней ее стадии) с явлением апоптоза этих клеток. При проведении исследований с ВОВ с применением культуры клеток мышиных моноцитов-макрофагов (линия клеток J774.G8) было также обнаружено абортивное течение инфекции, причем блокирование инфекционного процесса наступало также на ранней стадии [186]. В то же время в других работах [76, 126] был зарегистрирован факт размножения ВОВ и вируса оспы мышей в аналогичных клетках мышей, включая моноциты-макрофаги RAW 264.7 (TIB-71).

При выполнении таких же работ с ВОВ на человеческих макрофаг-подобных клетках (в том числе зрелые и незрелые дендритные клетки, моноциты-макрофаги), приготовленных из крови человека, не было обнаружено его размножение, при этом инфекционный процесс носил абортивный характер и был блокирован уже на ранней стадии [81, 94, 123, 153, 188, 189]. В то же время этот вирус размножался в макрофагах, полученных из моноцитов крови человека в присутствии рекомбинантных ГМ-КСФ (грану-лоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) и М-КСФ (макрофагаль-ный колониестимулирующий фактор) [154].

С целью оценки эффективности создаваемых противооспенных препаратов ряд ученых [44, 45, 46, 50] регистрировал размножение некоторых ортопоксвирусов (вирусы осповакцины, оспы верблюдов и оспы коров) и в других первичных клетках человека (кератиноциты, приготовленные из неонатальной крайней плоти в монослое или в орга-нотипической культуре плота). Продукция ВОВ наблюдалась также не только в керати-ноцитах, но и человеческих дермальных фибробластах и микроваскулярных эндотели-альных клетках, тогда как в Т-клетках, клетках Лангерганса и дермальных дендритных клетках человека происходило абортивное течение инфекции на ранней стадии [188]. В экспериментах с использованием мышиных клеток легких (LA-4), имеющих характеристику пневмоцитов 2-го порядка было отмечено активное размножение ВОВ [142], при этом данный процесс резко тормозился в присутствии клеток MH-S, полученных путем трансформации полиомавирусом (SV40) альвеолярных макрофагов мышей линии Balb/c.

Таким образом, учеными зарегистрирован факт размножения некоторых орто-поксвирусов in vitro в отдельных видах первичных клеток человека (кератиноциты, дермальные фибробласты и микроваскулярные эндотелиоциты), тогда как в других исследованных первичных клетках человека (Т-клетках, клетках Лангерганса и дермаль-ных дендритных клетках) инфекционный процесс проходил абортивно. Если одним исследователям удалось показать размножение ВОВ и вируса оспы мышей в пневмоцитах 2-го порядка, перитонеальных макрофагах и макрофаг-подобных клетках крови человека, кроликов и мышей, то другие не обнаружили репродукции ВОВ в перитонеальных макрофагах и макрофаг-подобных клетках крови человека и мышей.

Чувствительность человека и животных к вирусу оспы обезьян. Основываясь на результатах эпидемиологического анализа вспышек оспы обезьян и других респираторных вирусных инфекций, одним из исследователей [30] была проведена прогнозная оценка чувствительности человека к ВОО (ID50 10 БОЕ). В то же время в научной литературе имеется экспериментальная информация о чувствительности основных видов лабораторных животных к ВОО при разных методах заражения. Используя мышей, включая иммунодефицитных, крыс, морских свинок, хомяков, кроликов и нечеловекообразных приматов, были проведены попытки по выявлению у них внешних признаков оспоподобного заболевания при инфицировании ВОО. При этом у аутбредных мышей разного возраста при и/н, внутрибрюшинном и пероральном введении западноафриканского штамма Copenhagen ВОО в дозах, как правило, превышающих 6 lg ООЕ (оспино-образующая единица), наблюдали адинамию, уменьшение массы тела и гибель в 24…100 % случаев [52, 134]. Интрацеребральное же инфицирование этих животных сопровождалось энцефалитом, внутрикожное – образованием инфильтрата на месте введения, интраплантарное - отечностью стопы, генерализованными проявлениями, и во всех этих случаях у мышей наблюдали летальный эффект от 50 до 100 %. В экспериментах с использованием 4…7-недельных мышей линии BALB/c ряд исследователей [41, 73, 134] при заражении центральноафриканскими штаммами Congo-2003-358 и Z79-I-005 ВОО в дозах 2…7 lg БОЕ и/н регистрировали выгибание спины, взъерошенность шерсти и уменьшение массы тела животных, внутрибрюшинно - взъерошенность шерсти и анорексию, а интраплантарно - отечность стопы, хромоту, взъерошенность шерсти и уменьшение массы тела. При введении же животным западноафриканского штамма ВОО (USA-2003-044) в дозе 5 lg БОЕ и/н не было отмечено какой-либо клинической симптоматики, тогда как заражение внутрибрюшинное сопровождалось взъерошенно-стью шерсти и анорексией, а интраплантарное - отеком стопы и хромотой. В общем виде аналогичная картина заболевания той, которая описана для мышей линий BALB/c при и/н, внутрибрюшинном и интраплантарном заражении центрально- и западноафриканскими штаммами ВОО, была также отмечена и у 4…7-недельных мышей линий C57BL/6 и SCID [42, 73] с той лишь разницей, что у последней линии животных наблюдался 100 %-й летальный эффект при внутрибрюшинном введении вируса. И/н инфицирование 4…11-недельных мышей линий C57BL/6 stat1-/-, 129 stat1-/-, CAST/EiJ, MOLF/EiJ и PERA/EiJ центральноафриканским штаммом Z79-I-005 ВОО в дозах от 2 до 6 lg БОЕ вызывало у них (говоря о максимальном диапазоне клинических признаков заболевания) взъерошенность шерсти, выгибание спины, адинамию, уменьшение массы тела и гибель [41, 42, 85]. При этом определены величины LD50 вируса для некоторых этих линий мышей: C57BL/6 stat1-/- (самцы 4…8-недельные) – 47 БОЕ; C57BL/6 stat1-/-(самки 4…8-недельные) – 213 БОЕ; CAST/EiJ (5…6-недельные) – 680 БОЕ. И/н заражение 5…9-недельных мышей линии CAST/EiJ западноафриканским штаммом USA-2003 13 044 ВОО сопровождалось той же клинической картиной заболевания, что и центрально-африканским, но при этом LD50 составила 7600 БОЕ [41], тогда как при внутрибрюшин-ном заражении 9…11-недельных мышей линии CAST/EiJ центральноафриканским штаммом ВОО (Z79-I-005) LD50 была 14 БОЕ.

У взрослых белых крыс, инфицированных западноафриканским штаммом Copenhagen ВОО (доза не указана) различными способами (и/н, скарификационно и внутривенно), отсутствовали клинические признаки заболевания [134], тогда как у 1..3-дневных животных этого же вида при и/н заражении наблюдались адинамия и гибель в 100 % случаев. Внутривенное или и/н введение данного штамма в дозе 5 lg ООЕ взрослым хлопковым крысам вызывало у них цианоз, ринит, конъюнктивит, прогрессивное истощение и соответственно гибель в 100 или 50 % случаев [135]. Была также проведена попытка инфицирования данным штаммом ВОО многососковых крыс [135], однако результатов этих исследований не было представлено.

Исследования, проведенные с использованием 4-недельных морских свинок и 3-недельных хомяков, которых заражали и/н, внутрисердечно, перорально, скарификаци-онно и интраплантарно, как правило, в дозах 6…7,8 lg ООЕ штамма Copenhagen ВОО, продемонстрировали отсутствие у этих видов животных какой-либо клинической симптоматики, не считая отека стопы у морских свинок при интраплантарном введении вируса [3, 134, 171]. Инфицирование взрослых кроликов этим штаммом вируса интрацере-брально приводило у них к менингоэнцефалиту [101]; внутривенно (доза 7 lg ООЕ) – к генерализованным проявлениям с сыпью; скарификационно (доза 6 lg ООЕ) – к пустулам в месте инокуляции, генерализованным проявлениям с сыпью; внутрикожно (доза 6 lg ООЕ) – к инфильтрату в месте инокуляции; перорально (доза 9,1 lg ООЕ) – к отсутствию клинической картины заболевания [52, 134]. Тогда как у 10-дневных кроликов при и/н или пероральном введении штамма Copenhagen ВОО в дозе 6 lg ООЕ наблюдали соответственно уменьшение массы тела, адинамию и гибель у 83 % животных или генерализованные проявления с сыпью и гибелью у 85 % животных [134].

Методы приготовления первичных культур клеток подопытных животных и крови человека

Методы приготовления первичных культур клеток крови человека. Для приготовления первичных культур клеток была использована кровь от семи добровольцев, четверо из которых были вакцинированы против натуральной оспы 1-7 лет тому назад. Полученную от добровольцев кровь в растворе этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) вносили на двойной градиент плотности фиколл-верографина 1,077 и 1,119 г/мл в соотношении их объёмов 1:2. После 40 мин центрифугирования в бакет-роторе с ускорением 200 g (1500 - 1800 об./мин) при температуре 20 0С над границей градиента плотности 1,077 г/мл собирали слой клеток для получения суспензии мононуклеаров крови. Для получения суспензии гранулоцитов крови слой клеток собирали между верхней и нижней границами градиентов плотности 1,077 и 1,119 г/мл. Отобранные клетки дважды отмывали питательной средой RPMI-1640 («Вектор», Россия) путем центрифугирования при 3000 об./мин в течение 10 мин при комнатной температуре суспензии дважды. После второго центрифугирования к клеткам добавляли поддерживающую питательную среду: среда RPMI-1640 с гентамицином (80 мкг/мл) и эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (2% по объему) и подсчитывали концентрацию клеток. Перед экспериментом суспензии мононуклеаров и гранулоцитов вносили в лунки 24-луночных культуральных планшетов по 7,5 (7,0…8,0) 105 кл./лунку.

Для получения монослоя моноцитов-макрофагов крови, суспензии мононуклеаров крови заливали по 1 мл в лунки 24-луночного культурального планшета, сменив питательную среду на ростовую: среда RPMI-1640 с гентамицином (80 мкг/мл) и эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (10% по объему), и инкубировали в атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода (СО2) при температуре 37 0С в течение 24 часов. Затем не адгезированные на дне лунок клетки удаляли, путем промывания питательной средой RPMI-1640. Непосредственно перед заражением в лунках с монослоем макрофаг-подобных клеток меняли питательную среду на поддерживающую, при этом клетки из четырех лунок планшета снимали со дна и подсчитывали в камере Горяева, в среднем их концентрация составляла 9,0 (7,5…10,5) 105 кл./лунку. По данным световой микроскопии, моноциты-макрофаги в монослое сохраняли свою жизнеспособность длительное время (7 сут) в процессе инкубирования при 34,5 и 37 0С: через 3 сут про 49 цент жизнеспособных клеток был 95, а через 7 сут 83. Процент жизнеспособных клеток, находящихся в составе суспензий гранулоцитов и мононуклеаров крови, при тех же условиях менялся следующим образом: через 3 сут 60, а через 7 сут - 20.

Методы приготовления первичных культур клеток подопытных животных. У мышей, сурков и цыплят, не имеющих антител к ВОВ, брали некоторые органы и ткани для приготовления первичных культур клеток. Для получения монослоя селезеночных макрофагов у мышей после эвтаназии методом цервикальной дислокации брали селезенку, которую гомогенизировали в пробирке с помощью стеклянного пестика и отмывали питательной средой RPMI-1640. Приготовленную на основе ростовой питательной среды клеточную суспензию вносили по 1 мл в лунки 24-луночного культурального планшета и инкубировали в атмосфере, содержащей 5% СО2, при температуре 37 0С в течение 24 часов. Неадгезированные на дне лунок клетки удаляли, промывая поддерживающей питательной средой. Монослой макрофагов до эксперимента содержали в этой же среде. Перед экспериментом клетки из четырех контрольных лунок планшета аккуратно снимали со дна шпателем и подсчитывали в камере Горяева. Концентрация клеток в лунке составляла в среднем 9,0 (7,5…10,5)105 кл./лунку.

При приготовлении монослоя перитонеальных макрофагов мышам вводили внут-рибрюшинно по 1 мл эмульсию, включающую в себя 10% (по объему) неполного адъ-юванта Фрейнда. Через сутки после этого животных умерщвляли методом цервикальной дислокации и отбирали из брюшной полости асцитную жидкость, содержащую, в том числе перитонеальные макрофаги. Затем клетки этой жидкости отмывали от адъюванта Фрейнда центрифугированием, ресуспендировали в поддерживающей питательной среде и вносили по 1 мл в лунки планшета для формирования монослоя. Перед экспериментом клетки из четырех контрольных лунок планшета аккуратно снимали со дна шпателем и подсчитывали в камере Горяева. Концентрация клеток в лунке составляла в среднем 9,0 (7,5…10,5)105 кл./лунку. По данным световой микроскопии, селезеночные и перитонеальные макрофаги в монослое сохраняли свою жизнеспособность длительное время (7 сут) в процессе инкубирования при 34,5 0С: через 3 сут процент жизнеспособных клеток был 98, а через 7 сут - 87.

Суспензию клеток легких получали из легочной ткани мышей, сурков и цыплят. После проведения процедуры эвтаназии мышей и цыплят методом цервикальной дислокации, а сурков путем внутримышечного введения летальной дозы (60 мкг/кг) ветери 50 нарного раствора для анестезии, состоящего из смеси действующих веществ в соотношении 1:1 тилетамина гидрохлорида и золазепама гидрохлорида, осуществляли забор у них легких или их кусочков, которые отмывали от крови в питательной среде RPMI-1640. Легочную ткань измельчали на мелкие кусочки размером 1 мм3 и помещали в раствор трипсина с ДНК-азой для последующей инкубации при температуре 36 0С в течение 35 мин с периодическим встряхиванием через каждые 5 минут. После чего трипсин был инактивирован с помощью эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота («HyClone», США), добавленной в конечной концентрации 2% (по объему) в суспензию измельченной легочной ткани, которую затем фильтровали последовательно через нейлоновые фильтры сначала с диметром пор 100 мкм, затем – 40 мкм. Прошедшую через фильтры клеточную суспензию центрифугировали в течение 40 мин в бакет-роторе с ускорением 200 g (1500 - 1800 об./мин) при температуре 20 0С на градиенте плотности фиколл-верографина 1,077 г/мл. При этом клетки легкого собирали сверху над границей градиента, отмывали питательной средой RPMI-1640 путем 2-кратного центрифугирования в том же режиме и содержали до заражения в пластиковых пробирках Эппендорф (по 0,9 мл) при 4 0С в поддерживающей питательной среде. При этом в каждой пробирке находилось в среднем 5,0 (4,0…6,0)105 клеток. По данным световой микроскопии, клеточные суспензии легких мышей, сурков и цыплят содержали различные типы живых клеток легких животных: макрофаги 12,4 (9,0…15,8)%; эпителиоциты: альвеолоциты 1-го порядка 8,6 (7,5…9,7)%, альвеолоциты 2-го порядка 1,0 (0,1…1,9) %; реснитчатые клетки 2,1 (0,5…3,7)%. Приблизительно 70% оставшихся клеток в суспензиях были представлены лимфоцитами (60…65%) и нейтрофилами (5 – 10%) Жизнеспособность суспензии клеток легких мышей, сурков и цыплят в процессе инкубирования при 34,5 и 37,0 0С через 1 сут составила 80%, через 2 сут – 50% и через 3 сут – 30%.

Схемы применения и критерии эффективности химически синтезированных соединений у инфицированных вирусом мышей

Данные этой таблицы свидетельствовали, что величины титров антител, измеренных в реакции нейтрализации с ВНО и ВОВ, достоверно не отличались между собой. При этом первичная вакцинация людей приводила к формированию относительно невысоких титров антител, тогда как повторная вакцинация существенно стимулировала гуморальный иммунитет. В связи с этим в дальнейших исследованиях по изучению чувствительности моноцитов-макрофагов к ВНО была использована кровь от четырех добровольцев, 1 – 7 лет тому назад вакцинированных против натуральной оспы, имеющих титры антител: 1:76; 1:100; 1:128; 1:216, и трех интактных добровольцев. Используя результаты ранее представленных исследований (таблица 3.2), изучаемые значения этого показателя были рассчитаны с учетом регистрации данных через 144 часа п.з. монослоя моноцитов-макрофагов крови о наличии в них вируса. При этом были определены следующие средние величины инфекционности вируса для клеток четырех вакцинированных добровольцев: CID50 = 0,01 (-0,15…0,17) lg БОЕ. Аналогичные исследования, выполненные с использованием моноцитов-макрофагов, полученных от трех интактных добровольцев, дали следующий средний результат: CID50 = 0,09 (-0,37…0,55) lg БОЕ. Видно, что моноциты-макрофаги крови от четырех иммунизированных добровольцев против натуральной оспы и трех не иммунизированных проявляли существенно неразличимую высокую чувствительность к ВНО, что нам и позволило провести оценку средней величины этого показателя: CID50 = 0,04 (-0,08…0,16) lg БОЕ.

Учитывая то, что проведенный многими учеными поиск животных, обладающих высокой чувствительностью к ВНО по результатам регистрации клинической картины заболевания, близкой к таковой у человека, оказался слабо эффективным, в своих исследованиях по данным опытов in vitro мы акцентировали внимание на изучении инфекционного процесса в легких (один из первичных органов-мишеней для ВНО): в первичных клетках этого органа у доступных для нас видов животных. При этом, кроме традиционного вида лабораторных животных (10…14-сут мыши аутбредной популяции ICR), исследованию были подвергнуты 1…2-летние сурки породы Байбак, а также 5…7-дневные цыплята генетической линии Род-Айленд.

Применение аутбредных иммунокомпетентных мышей раннего возраста для оценки чувствительности к ВНО было обосновано тем, что эти животные проявляли некоторые признаки заболевания при и/н заражении [13, 17, 143]. При этом мы, как минимум, попытались смоделировать инфекционный процесс у людей детского возраста, натуральная оспа у которых может встречаться чаще (учитывая масштабную вакцинацию, проведенную в мире до 1980 г. против этого заболевания) и протекать тяжелее, чем у взрослых людей [158, 159, 164].

Использование сурков для этих исследований было обусловлено тем, что данный вид животных имеет некоторые ранее описанные физиологические показатели, близкие к таковым у человека. Кроме того, они проявили сходную с человеком чувствительность к ВОО (родственному ВНО) в экспериментах по данным опытов in vitro и in vivo при и/н заражении [185], и могут быть приобретены из специализированных питомников России, в которых их выращивают, проводя ветеринарный контроль и тестирование на отсутствие патогенной микрофлоры, в том числе гельминтов.

Несмотря на отсутствие признаков заболевания у 5-сут цыплят при интрацере-бральном заражении ВНО [16], основанием для включения в экспериментальные исследования этого вида животных явились следующие обстоятельства: наличие выраженной чувствительности к ВНО у 9…11-сут эмбрионов курицы, которых часто используют для титрования и наработки вируссодержащих материалов [84, 108, 133], а также появление у петухов после подкожного заражения этим вирусом некоторого подобия сыпи (мелкие узелки) на месте введения [137].

На первом этапе нами была предпринята попытка экспериментальной оценки степени чувствительности к ВНО первичных клеток легких мышей, сурков и цыплят, приготовленных ранее разработанным нами способом с максимальным сохранением (достаточное время для опытов) жизнеспособности всех видов клеток этого органа [2, 7, 34], а также первичных культур макрофагов, полученных из брюшной полости мышей и селезенки [8, 9, 11]. Перед проведением процедуры приготовления таких культур клеток используемые животные были обследованы ранее описанным методом [170] на отсутствие антител к ВОВ. Применение данных культур клеток для целевых исследований было обусловлено тем, что основные первичные клетки-мишени к ВНО у человека, судя по данным, полученным с этим вирусом на известных модельных видах животных - M. cynomolgus и мышах аутбредной популяции ICR [31, 93, 155], располагаются в респираторном тракте и являются клетками системы мононуклеарных фагоцитов и эпителиоци-тами, с которых и начинается соответствующий инфекционный процесс. Результаты определения чувствительности к этому патогену первичных культур клеток подопыт 70 ных животных были использованы в дальнейшем в рамках данного подраздела для прогнозной оценки ID50 ВОО и ВНО для подопытных животных и человека.

Первоначально необходимо было оценить возможность размножения ВНО в селезеночных и перитонеальных макрофагах мыши. Для этого монослои клеток каждой лунки инфицировали возбудителем заболевания в дозах 3,5, 4,1, 4,4 lg БОЕ/лунку, отбирая пробы для вирусологического исследования через 1, 48, 72, 144 и 148 часов п.з. Результаты этих исследований представлены в таблице 3.5.

Данные, приведенные в этой таблице, свидетельствовали о размножении ВНО в монослое селезеночных макрофагов мышей, при этом наблюдали значимый прирост биологической концентрации этих вирусов уже через 48, 72 и 168 часов п.з. Максимального уровня накопления в клеточных культурах вирус достигал через 48 часов п.з. дозой 0,017 БОЕ/кл. и через 168 часов п.з. дозой 0,003 БОЕ/кл. При проведении электронной микроскопии были обнаружены признаки размножения вируса в селезеночных макрофагах мышей (рисунки 3.3 и 3.4). В то же время не было отмечено положительной динамики накопления ВНО в монослое перитонеальных макрофагов этого вида животных.

Патоморфологические изменения у мышей, инфицированных вирусом оспы обезьян

Эксперименты по оценке эффективности противовирусного действия ST-246, НИОХ-14 и НИОХ-32 ранее проводили многие исследователи [10, 42, 169] с использованием различных видов ортопоксвирусов, культур клеток и соответствующих существующих видов модельных животных, и результаты таких исследований не противоречили нашим данным, полученным на мышах с использованием ВОО. Это обстоятельство свидетельствует о реальной возможности использования в дальнейшем для этой цели подобранного нами вида модельного животного для оспы обезьян.

С учетом результатов исследований, проведенных при разработке лабораторной модели «мышь аутбредной популяции ICR - центральноафриканский штамм V79-1-005 ВОО», и её испытаний были оценены пределы практического использования: - применение профилактической (экстренно-профилактической) или лечебно профилактической схемы введения мышам контрольных и опытных препаратов (реко мендуется подвергать испытаниям препараты, ранее показавшие противовирусное дей ствие в экспериментах in vivo и in vitro на ортопоксвирусах III и IV групп патогенности); - применение не менее 6 аутбредных разнополых мышей популяции ICR (10…16-сут) по каждому опытному и контрольному препарату; - применение центральноафриканского штамма V79-1-005 ВОО, наработанного на куриных эмбрионах или культуре клеток, с известной для этих мышей при и/н заражении инфекционностью (ID50 по наличию вируса в легких через 7 сут п.з.) в пределах 2,0-2,8 lg БОЕ; - введение мышам 10…100 ID50 центральноафриканского штамма V79-1-005 ВОО при и/н заражении в объеме 0,03 мл/мышь; - пероральное однократное введение мышам суспензии, эмульсии или раствора контрольных и опытных препаратов в объеме 0,2 мл/мышь; - обнаружение у инфицированных ВОО мышей, обработанных опытным препаратом, отсутствия или наличия вируса в легких и его концентрации спустя 7 сут п.з. в сравнении с контролями по результатам титрования их гомогенатов; - статистическое сравнение уровней накопления вируса в легких и величин показателя его наличия в данном органе в контрольных и опытных группах мышей.

Таким образом, при изучении защитной активности разрабатываемых противоос-пенных препаратов (на примере трех химически синтезированных соединений: ST-246, НИОХ-14 и НИОХ-32) на мышах аутбредной популяции ICR с применением штамма V79-1-005 ВОО подтверждено наличие ранее отмеченного нами и многими исследователями (эксперименты с использованием различных видов ортопоксвирусов, культур клеток и известных видов модельных животных) соответствующего положительного эффекта, что подтверждает возможность использования для этой цели данной лабораторной модели. Проведена оценка пределов её практического использования.

К настоящему времени многие исследователи провели поиск шести видов модельных животных для оспы обезьян: иммунодефицитных мышей (CAST/EiJ и C57BL/6 stat1-/-) [41, 42, 74], сусликов [72, 89, 97], сурков [30], чернохвостых луговых собачек [53, 83, 98], сонь Келлена [94] и нечеловекообразных приматов (M. cynomolgus и mulatta) [42, 150, 180]. Вместе с тем использование этих видов животных для оценки противовирусных препаратов сопряжено с рядом проблем, связанных с ограниченностью их ареала обитания, сложностью выращивания в неволе, высокой стоимостью, большой трудоемкостью и неадекватностью применения при моделировании оспы обезьян у людей.

В этой связи в данной диссертации приведены экспериментальные данные, нацеленные на подбор приемлемых для нас видов животных, моделирующих оспу обезьян у человека на начальном этапе инфекционного процесса, для испытания эффективности разрабатываемых противовирусных препаратов при профилактической (экстренно-профилактической) и лечебно-профилактических схемах применения.

Учитывая то, что на территории России среди людей не было ни одного случая оспы обезьян, в качестве возбудителя этого заболевания мы вынуждены были использовать известный зарубежный центральноафриканский штамм V79-1-005 ВОО, обладающий (широко признано) более высокой вирулентностью для людей (летальность - до 17%), чем западноафриканские штаммы этого вируса (летальность не выявлена).

Взятые в исследования мыши аутбредной популяции ICR при респираторном заражении проявляли близкую к человеку чувствительность к ВОО, определенную путем прогнозной оценки [30]. Эти животные воспроизводили без клинической картины заболевания (при дозе заражения вирусом 3,8 lg БОЕ) генерализованный инфекционный процесс у человека или признанных видов модельных животных в части, касающейся первого этапа распространения патогена и частично второго и третьего, включая клетки-мишени, а также патоморфологические изменения в основном в первичных органах-мишенях. В этом смысле мыши, могут быть потенциально применены в экспериментах с ВОО для оценки профилактической (экстренно-профилактической) и лечебно-профилактической эффективности препаратов.

Проведенные исследования с использованием кандидатного вида модельного животного (мыши аутбредной популяции ICR), а также ВОО (центральноафриканский штамм V79-1-005) для оценки эффективности противооспенных химиопрепаратов про 115 демонстрировали реальную возможность их применения с этой целью. В то же время такие мыши в отличие от используемых линейных и иммунодефицитных являются более дешевым иммунокомпетентным и аутбредным животным, которые имеет выраженное генетическое разнообразие, как и человеческая популяция, представляющаяся, по существу, аутбредной (межсемейное, межнациональное и межрасовое скрещивание) и в основном иммунокомпетентной. В связи с этим были разработаны соответствующие методические рекомендации ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (МР 4.2.001-16) по использованию лабораторной модели «мышь популяции ICR - центральноафриканский штамм V79-1-005 ВОО» для оценки защитной эффективности химиопрепаратов от оспы обезьян.

Основные результаты исследований с ВОО, касающиеся разработки модельной биосистемы «мышь популяции ICR - центральноафриканский штамм V79-1-005 ВОО», представлены в отечественных и зарубежной научных публикациях [4, 23, 24, 181]. С использованием этой модельной биосистемы были успешно проведены доклинические испытания российского противооспенного препарата НИОХ-14.

Методология прогнозного определения величина ID50 вируса, основанная на использовании первичных клеточных культур человека и животных и продемонстрировавшая адекватность результатов при ее применении тем, которые были получены в прямых экспериментах на животных, может быть взята для оценки чувствительности того или иного макроорганизма к исследуемым вирусным патогенам. Прогнозная величина ID50 ВНО для людей, определенная на основе экспериментов (in vitro), может быть полезной при поиске новых модельных биосистем не только для оценки защитной эффективности препаратов против соответствующей инфекции, но и для изучения показателей ее контагиозности, патогенеза и происходящих эпидемических процессов.

В перспективе дальнейшая разработка темы данной работы связана с возможностью усовершенствования созданной лабораторной модели путем изменения ее состава в части, касающейся штамма ВОО, который может быть заменен на другой после его изоляции во время новых эпидемических и эпизоотических вспышек оспы обезьян. Кроме того, пределы практического использования данной модели могут быть расширены в направлении оценки лечебной эффективности препаратов после проверки ее работоспособности, используя показатели присутствия/отсутствия и концентрации вируса в основных вторичных органах-мишенях мышей.