Введение к работе
Актуальность работы. Вирус кептой лихорадки /Щ/ является-эндемичным в странах Африка и йгцой Америки и вызывает тяжелейшее заболевание, которое во многих случаях приводит к летальному исходу. В настоящее время эта инфекция приобрела глобаллчое значение ввиду быстрого и интрисивного передвижения людей в современном мире, Ключевым звечом в'программе борьбы с этим инфекционным заболеванием Яізляется изучение биологических свойств вируса М, молекулярно-<5иологических особенностей вирусной репродукции и структурно-функциональных свойств вирусных белков. Для проведения таких исследований особенно перспективным является применение моноклональных антител /МКА/. Получение и использование !ЖА к основным антигенам вируса Ж - белкам E.NS1, NS3, и SS5 позволит репить не только чисто теоретические задачи, но игеет и большое значение, в частности, для усовершенствования методов дифференциальной диагностики флавивирусных инфекций и выяснения вклада каждого конкретного белка в формирование противовирусного иммунитета.
В настоящее время .ЖА к белкам Е и НЯ1 вируса ЯЛ получены
Шлезингером и Голдом /Schlfsinger J.J.et al„,1983; Gould E.A. et
al.,1936 /. Клон гибридных клеток к этому вирусу создан также к в нашем институте /Новохатский А.С. и др.,1987/. Однако, ввл-ду того, что какцый-набор МКА по-своему уникален, каждый их вид обладает индивидуальными, неповторимыми свойствами, получение широкой панели МКА к вирусу ЗЛ имеет большое значение
для изучения антигенов флавивирусов и идентификации вирусных итамглов. Особенно интересным представляется получение МКА и цальнойгаее исследование с их помощью одного из наименее изученных антигенов - белка НЕ5, который, по-видимому, играет важную роль з репродукции в;шусов этого семейства, являясь РНК-
зависішой РНК-полимзразой.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получить гибрвдомы к белкам Е и NS5 вируса ЗЯ, изучить биологические с ойства сенретируемых гибрадомами ЖА, применить 97л ?ЛКА для исследования ряда структурно-функциональных характеристик антигенов Е и NS5 и использовать эти ЫКА в качестве диагностических препаратові
Поставленная цель обусловила необходимость решения следующих задач:
получить и отобрать стабильные ктаммы гибридных клзток-продуцектоз моноклоналъкых антител к белкам Е hM изучить серологические и биологические характеристики полученных МКА. проанализировать внутриклеточную локализацию и динамику накопления белка ws5 с помощью МКА. охарактеризовать антигенные связи в семействе FlaviviridM и провести эпптопное картирование белка NS5. - определить возможность использования полученных Ї'ЛКА в іЧаушая новизна. Впервые получена панель /12 гибридом/ продуциру-^цих ЇЖА. к бейку NS5 зіфуса Ш. Используя эти МКА, изучены некоторые физико-химические к биологические свойства этого белка. Установлено, что максимальное накопление белка NS& в клетках наблюдается через 48 часов после заражения. При изучении внутриклеточной локализации этого белна методом непрямой иимунофлюореецэнции впервые было показано свечение ядер. Из полученной серии МКА только ДЕа /ГЗЛ-10 и ГЖЛ-12/ взаимодействовали, кроме вируса -11, еще я с вирусам Нтайя, остальные І.1КА э»ой Cteprai не давали перекрестных реакций с вирусам кле- -5-щевого энцефалита, японского энцефалита,' Западного Нила, Уганда(Ч Нтайя и денге 4. С помощью панели МКА серии ГЗЛ выявлено три антигенных эпитопа на неструктурном белке HS5„ МКА к белку NB5 были неактивны при проведении теста пассивной защиты мышей. Практическая ценность. Получены линии стабильных гибридом, продуцирующие МКА к белкам Е и NS5 вируса ЖЛ. Гибрвдомы, секре-тиругалие МКА, использованы для препаративного накопления иммуноглобулинов и приготовления на их основе высокоспецифичных иммунодиагностических реагентов. Препараты МКА к вирусу И, обладающие видоспецифичеокой активностью, предназначены для экспресс-индикации вируса Ш непрямым методом игялунофлюоресценции в инфицированных клетках культуры ткани, органах и тканях животных и членистоногих. Разработана "Инструкция по применении моноклоналъной асцитной жидкости к вирусу HI для реакции непрямой иммунофлюоресценции, мышиной, сухой". Препараты МКА к вирусу ЕЕ используются в лабораторних исследованиях для изучения свойств основных антигенов этого вируса в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР, а таккз в Институте вирусологии и микробиологии окружающей среди з Оксфорде. Основные положнния выносимые на защиту: Получение моноклональннх антител к белкам Е и N3 5 вируса ІЛ позволяет проводить-дальнейшее изучение свойств этих ьл-гкгенов, а также особенностей вирусной репрг :гукции. 1ЛКА ГйЯ-16 к белку В являются видоспецифичными для вируса Ел. Эти ЫКА активны в реакциях торможения гемагглютинации а радиального гемолиза, но не нейтрализуют вирус 201. МКА к 5елку t's 5 вступают в реакции непрямой иммунофлюоресценции и —о— иммуноф^рментного анализа и не защищают мышей при проведении теста пассивной защиты. 3. С помощью ЖА к белку NS5 вируса Ш выявлено три анти іКтайя; второй - обнаруживается ЖА ГЗІ-1, ГИ-5, ГМ-17 и ГІЛ-19 и характерен для всех штаммов вируса ЗЛ; третий. - определяется ГЭ1-9 и ГЖ-14 и имеется на всех штаммах вируса НЕ, кроме штамма S02S77. Белок '^5 вируса Ж локализован как в цитоплазме, так к 2 ядрах инфицированных клеток млекопитающих. Максимальное накопление этого белка в клетках наблюдается через ^8 часов после заражения. Применение ;ЖА серии Г2Л позволяет получить высокоспе-цифичкые диагностические препараты для выявления вируса И. Апробация диссертации состоялась- 27 февраля 1ЭЭ1 г. на заседании Совета предварительной экспертизы диссертационных работ при Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского АШ СССР. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на мелдународном сі«;гозігуме "Арбовирусы и арбовіфуские инфекции", в Москве, октябрь 1989 г., на Американском обществе вирусологов 1591г., на всесоюзном симпозиуме по арбовирусам в Лнткино, март 1991 г., на конференциях молодых ученых Института вирусологии им.Д.И.Ивановского АІЛН СССР в 1937 и 199С1 гг. Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных :ісследований, обсуждения полученных -7-результгтов, еызодое, списка литературы. Последний включает 203 источников отечественной и зарубежной литературы. Диссертация вюшчает 21 таблицу и 11 рисунков.
качестве диагностических препаратов.
генних эпитопа а этом белке: перзый - тестируется ІЛКА Г2Л-10
и ГКЛ-І2 и присутствует, кроме вируса ІЛ, еще и на вирусе