Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 14
Глава 1.1. Модификации C-концевого домена РНК-полимеразы II (CTD) 14
1.1.1. CTD 14
1.1.2. Формирование преинициаторного комплекса 15
1.1.3. Фосфорилирование CTD РНК-пол II 17
1.1.4. Другие модификации CTD РНК-пол II 21
1.1.5. Динамика фосфорилирования CTD во время транскрипции 22
1.1.6. Модель capping checkpoint 23
Глава 1.2. мРНП и CBC комплексы 25
1.2.1. мРНП комплекс 25
1.2.2. Привлечение компонентов мРНП во время биогенеза мРНК 25
1.2.3. CBC комплекс, синтез 7mG 27
1.2.4. CBC и транскрипция 29
1.2.5. CBC и биогенез мРНК 31
Глава 1.3. Транспорт белков, локализация компонентов аппарата трансляции в ядрах 33
1.3.1. Импорт и экспорт белков 33
1.3.2. Компоненты аппарата трансляции в ядрах 34
Глава 1.4. Фактор Paip2 42
1.4.1. Paip2 - ингибитор трансляции 42
1.4.2. Участие Paip2 в других процессах 46
2. Материалы и методы 49
Глава 2.1. Линии клеток и мух 49
2.1.1. Штаммы Escherichia coli 49
2.1.2. Компетентные клетки и электропорация 49
2.1.3. Линия клеток Schneider 2 (S2) D. melanogaster 49
2.1.4. Трансфекция 50
2.1.5. РНК-интерференция 50
2.1.6. Линии мух 50
Глава 2.2. Методы работы с нуклеиновыми кислотами 51
2.2.1. ПЦР и количественный ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) 51
2.2.2. Выделение РНК 51
2.2.3. Обратная транскрипция (RT-Reverse Transcription) - синтез кДНК 51
2.2.4. Синтез двуцепочечной РНК (дцРНК) 52
2.2.5. Клонирование 52
2.2.6. Список праймеров 53
Глава 2.3. Методы работы с рекомбинантными белками 56
2.3.1. Экспрессия белка индуктором - Изопропил--D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) 56
2.3.2. Аутоиндукция 56
2.3.3. Выделение рекомбинантных белков 57
2.3.4. Очистка и анализ белкового комплекса 57
2.3.5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (SDS/ПААГ) 58
2.3.6. Вестерн-блот анализ 58
2.3.7. Окрашивание белковых гелей Coomassie Blue R250 59
2.3.8. Окрашивание белковых гелей нитратом серебра 59
Глава 2.4. Иммунологические методы 60
2.4.1. Антитела, использованные в работе 60
2.4.2. Получение антител 60
2.4.3. Триазиновый метод посадки белка на сефарозу 61
2.4.4. Очистка антител на колонке с пришитым антигеном 62
2.4.5. Иммунопреципитация белков 62
2.4.6. Иммунопреципитация хроматина 63
2.4.7. Иммунопреципитация РНК 64
2.4.8. Иммуноокрашивание клеток 64
2.4.9. Приготовление препаратов политенных хромосом 65
2.4.10. Иммуноокрашивание семенников 66
3. Результаты 67
Глава 3.1. Белок Paip2 локализован в ядрах различных клеток 67
3.1.1. Paip2 в ядрах S2 клеток 67
3.1.2. Paip2 в ядрах других клеток D. melanogaster 72
Глава 3.2. Paip2 ассоциирован с промоторами активных генов посредством РНК 76
3.2.1. Локализация Paip2 на политенных хромосомах 76
3.2.2. Привлечение Paip2 на промоторы экдизон-зависимых генов 77
3.2.3. Привлечение Paip2 на ген теплового шока 81
3.2.4. Paip2 связывается с ядерной мРНК 83
Глава 3.3. Очистка Paip2-содержащего белкового комплекса из ядерного эмбрионального экстракта D. melanogaster. Функциональное значение Paip2 в ядрах клеток. 86
3.3.1. Paip2 связан с факторами, локализующимися на промоторах активных генов 86
3.3.2. Paip2 и Cbp80 оказывают влияние на фосфорилированный серин 5 CTD РНК-пол II 88
3.3.3. Paip2 модифицируется PARP-полимеразой 92
4. Обсуждение 95
Заключение 98
Выводы 99
Благодарности 100
Список литературы 101
- Фосфорилирование CTD РНК-пол II
- Участие Paip2 в других процессах
- Paip2 в ядрах других клеток D. melanogaster
- Paip2 модифицируется PARP-полимеразой
Фосфорилирование CTD РНК-пол II
Фосфорилирование CTD динамично регулируется на разных стадиях транскрипции и тесно связано с привлечением некоторых транскрипционных комплексов. Как уже было отмечено выше, на ранних этапах транскрипции нефосфорилированная РНК-пол II, общие факторы транскрипции и Медиаторный комплекс привлекаются на промоторы генов [46]. Медиаторный комплекс стимулирует киназную активность TFIIH (CDK7 в млекопитающих и Kin28 в дрожжах). CDK7/Kin28 фосфорилирует серин 5 (S5-P) и серин 7 (S7-P) CTD РНК-пол II [53, 54]. Другая киназа - CDK8 (у млекопитающих) или Srb10 (в дрожжах) является компонентом Медиаторного комплекса. Она фосфорилирует S5 и серин 2 (S2-P) CTD in vitro [55, 56]. S5-P способствует диссоциации Медиаторного комплекса от PIC и последующего перехода транскрипции от стадии инициации в элонгацию [57, 58]. Более того, S5-P привлекает пре-мРНК кэпирующие ферменты [59, 60]. В большей степени S5-P представлен на 5 -конце гена во время инициации транскрипции и намного меньше на 3 -конце (Рис. 2) [40, 57, 61].
Предполагается, что дефосфорилирование S5-P является важным этапом экспрессии генов. RPAP2 (белок, ассоциированный с РНК-пол II) человека как и его гомолог Rtr1 в дрожжах, дефосфорилирует S5-P [62, 63]. Нокдаун Rtr1/RPAP2 приводит к увеличению уровня S5-P в экстрактах клеток. Кроме того, Rtr1/RPAP2 селективно удаляет S5 фосфат с фосфорилированного CTD in vitro. Таким образом, нокдаун RPAP2 и Rtr1 нарушает транскрипцию. Подобным образом, нокдаун Ssu72 (другая S5 фосфатаза дрожжей) также влияет на элонгацию транскрипции [64].
Как уже было отмечено выше, одна из функций S5-P - это привлечение кэпирующих ферментов на незрелые мРНК [65]. После кэпирования РНК, дефосфорилированный S5 участвует в диссоциации кэпирующих ферментов. Это приводит к переходу транскрипции в элонгацию [64]. Задержка кэпирующих ферментов и РНК-пол II на промоторе приводит к репрессии транскрипции [66]. При этом снижение или полное удаление S5-P может нарушить повторный раунд транскрипции. Нокдаун Rtr1 или Ssu72 приводит к нарушению терминации [67]. S5-P фосфатазная активность может иметь критическое значение для 3 -процессинга транскриптов, так как in vitro данные предполагают, что S5-P может нарушать привлечение факторов процессинга/терминации на 3 концы генов [18]. Например, S5-P негативно влияет на связывание Int11 (субъединица Интеграторного комплекса - Int) с CTD. Мультисубъединичный Int комплекс взаимодействует с РНК-пол II и участвует в переходе РНК-пол II из состояния паузы в продуктивную элонгацию [68]. Таким образом, эти результаты предполагают, что S5-P является ключевой модификацией, которая влияет на диссоциацию PIC, кэпирование и процессинг РНК, а также на терминацию и реинициацию транскрипции.
В почкующихся дрожжах известны две киназы, которые фосфорилируют S2 CTD РНК-пол II: Bur1 и Ctk1 (Cdk9 и Lsk1 в S. pombe). Фосфорилирование S2 активирует элонгацию транскрипции [40, 69, 70]. Bur1 киназа взаимодействует с S5-P CTD РНК-пол II и фосфорилирует S2 во время элонгации транскрипции [71, 72]. Также показано, что Bur1 фосфорилирует S5 и S7 CTD in vitro [72, 73]. Дрожжевой Ctk1, компонент CTD киназного комплекса 1 (CTDK1), состоящего из комплекса 1 (Ctk1 и циклина Ctk2/3), является еще одной киназой, которая фосфорилирует S2 CTD РНК-пол II. Ctk1 диссоциирует РНК-пол II от общих факторов транскрипции на 5 - концах генов. Фосфорилирование S2 также играет важную роль в связывании транскрипции с 3 процессингом незрелых транскриптов, обеспечивая привлечение факторов, которые необходимы для процессинга мРНК [69, 72].
Известны четыре CTD S2-P киназ человека: CDK9 – каталитическая субъединица PEFb, CDK12, CDK13 и BRD4 [73-75]. Киназа CDK9 человека (гомолог в дрожжах - Bur1) фосфорилирует CTD S2 на 5 - концах генов [74]. PEFb привлекается его посредниками, такими как CDK8, MED26, BRD4 или факторами сплайсинга и усиливает элонгацию [73]. В высших эукариотах комплексы DSIF (DRB Sensitivity Inducing Factor) или NELF (Negative Elongation Factor) участвуют в задержке или паузинге РНК-полимеразы II в области между +20 и +60 п.н. от TSS [76]. PEFb фосфорилирует NELF и DSIF. В результате РНК-пол II переходит из состояния паузы в продуктивную элонгацию [77]. Киназа CDK12 фосфорилирует S2 CTD РНК-пол II in vivo, преимущественно на 3 -концах генов. При этом показано, что она фосфорилирует S5 и S7 CTD РНК-пол II in vitro [74, 75, 78]. CDK13 киназа также фосфорилирует S2 CTD РНК-пол II in vitro [74, 78]. BRD4 является нетипичной киназой, которая фосфорилирует S2 преимущественно на 5 - концах генов и стимулирует привлечение PEFb [79].
Известно, что CyclinK формирует комплекс с киназой CDK12 [74, 80]. У D. melanogaster CDK12/CyclinK считается основным киназным комплексом, который фосфорилирует S2 CTD РНК-пол II во время элонгации транскрипции [74]. Кроме того, CDK12 фосфорилирует S2 в середине и на 3 концах генов [72, 81, 82] (Рис. 2). При этом CDK9 фосфорилирует S2 CTD РНК-пол II в основном на 5 концах генов [33] (Рис. 2).
Фосфорилирование серина S7 CTD РНК-пол II происходит как на белок кодирующих, так и не кодирующих генах [53, 83, 84]. Эта модификация обнаружена на промоторах генов и остается стабильной между кодирующей областью и 3 концами в дрожжах и у человека [40, 83, 85]. При этом в дрожжах уровень S7-Р CTD РНК-пол II выше, чем у человека на промоторной области генов (Рис. 2). Показано, что Kin28, Bur1 (S. cerevisiae) и Mcs6 , Cdk9 (S. pombe), а также человеческая CDK7 фосфорилируют CTD S7 in vivo [84, 86]. DNA-PK человека (ДНК-зависимая протеин киназа) и PEFb также фосфорилируют S7-P in vitro [86]. Фосфорилирование S7-P приводит к привлечению RPAP2 и Интеграторного комплекса на гены, кодирующие малые ядерные РНК (мяРНК), для последующей транскрипции и процессинга [62, 87]. S7-P также играет важную роль в стимулировании киназы CDK9, которая фосфорилирует S2-P CTD.
Фосфорилирование тирозина (Y1-P) впервые обнаружено в клетках млекопитающих и позже было выявлено в дрожжах [88, 89]. У млекопитающих Y1-P модификация CTD в основном распределена на промоторах и в меньшей степени на 3 концах генов. Паттерн Y1-P подобен паттерну S5-P [90] (Рис. 2). В дрожжах Y1-P обнаружено на всех активных генах. В этом случае фосфорилирование тирозина в меньшей степени представлено на промоторах, и уровень данной модификации возрастает в направлении к 3 концам генов [89]. Y1-P участвует в регуляции транскрипции некоторых генов. Например, в дрожжах Y1-P активирует привлечение элонгирующего фактора Spt6, но при этом нарушается привлечение CID (CTD-взаимодействующий домен)-содержащих факторов терминации - Nrd1, Pcf11 и Rtt103 [89]. In vitro показано, что Y1-P предотвращает 20S протеосомную деградацию РНК-пол II CTD [91]. Кроме того, Y1-P участвует в транскрипции с антисмысловых промоторов и с активных энхансеров в клетках млекопитающих [90]. На сегодняшний день c-Abl является единственной киназой человека, которая фосфорилирует Y1 [88].
Фосфорилирование CTD треонина 4 (T4-P) обнаружено в кодирующей области генов (Рис. 2). Ее паттерны совпадают с S2-P и Y1-P в дрожжах [83]. Известно, что человеческие Pololike kinase-3 (PLK3) и CDK9 фосфорилируют T4 CTD РНК-пол II [91, 92]. Полногеномное ChIP секвенирование (ChIP-seq) на B-клетках человека показывает, что уровень T4-P снижается на TSS и сильно возрастает в направлении к 3 концам генов (Рис. 2). Уровень этой модификации возрастает примерно на 300 п.н. от промотора в направлении к кодирующей области гена. В этой области высокий уровень привлечения показано также и для S2-P. Поэтому предполагается, что фосфорилирование S2-P CTD является важной предпосылкой для последующего фосфорилирования T4 [92]. Полногеномный анализ в дрожжах показывает, что T4-P в основном представлена в кодирующей области и в меньшей степени на поли(А) сайте (Рис. 2). Это облегчает привлечение таких факторов терминации транскрипции как Pcf11 или Rtt103 на 3 концы генов [89]. T4-P необходимо для индукции некоторых генов [18].
Участие Paip2 в других процессах
Опубликовано множество работ, в которых подробно описываются и другие аспекты, характеризующие фактор Paip2 в различных клетках.
Например, показано, что на экспрессию гена Paip2 влияет киназный ингибитор ROCK1 (Rho-associated, coiled-coil-containing protein kinase). ROCK1 работает как кофактор белка HNF4A (transcription factor hepatocyte nuclear factor 4 alpha), что способствует усилению транскрипции Paip2 [224].
На экспрессию Paip2 также могут повлиять некоторые вирусы. Инфицирование клеток нейровирулентным фактором птичьего герпесвируса первого серотипа, вызывающий болезнь Марека (MDV1: Marek s disease (MD) virus serotype 1), подавляет экспрессию Paip2 примерно на 50 % [225].. В отличие от вируса простого герпеса первого типа (HSV1: Herpes simplex virus) и вируса герпеса 8-го типа или Саркомы Капоши (KSHV: Kaposi s sarcoma-associated herpes virus), снижение уровня Paip2 не влияет на накопление и локализацию PABP в инфицированных клетках[225].. Вирусные микро-РНК (miR-M6, miR-M7, miR-M8, miR-M10 и miR-M13) репрессируют синтез белка Paip2 на этапе трансляции, что создает оптимальные условия для посадки мРНК на внутренний сайт рибосомы (IRES: Internal Ribosome Entry Site) [225]. miR-128 РНК, который относится классу микро-РНК, связывается с 3 UTR мРНК Paip2. Это приводит к подавлению синтеза белка Paip2 на 70 %. Mir-128 участвует в блокировке главных сигнальных путей, таких как ERK (extracellular signal-regulated kinase) и AKT (Akt-kinase) во время развития опухоли. МикроРНК узнают большой класс генов модуляторов, регулирующих множество физиологических и патологических процессов. Предполагается, что микроРНК участвует в регуляции экспрессии более 30 % генов из общего количества и могут обеспечивать часть аберрантной экспрессии генов в раковых клетках [226]. Изменение уровня регуляторных белков в клетках может привести к возникновению различных болезней, включая опухоли различного генеза. Поэтому, предполагается, что белок Paip2 может косвенно повлиять на эти процессы [226].
Некоторые данные указывают на позитивные и негативные эффекты белка Paip2 для различных клеток. Например, на клеточной линии эмбриональных фибробластов мыши (NIH/3T3) показано, что гиперэкспрессия Paip2 приводит к снижению формирования колоний на полутвердой поверхности, а также к снижению плотности клеточного монослоя [227]. При этом мы наблюдали обратный процесс, что не только при повышении уровня экспрессии Paip2, но и при его снижении посредством нокдауна, происходит замедление роста S2 клеток примерно на 10-20 %.
Последние данные указывают на то, что Paip2 может оказывать влияние на репликативную машинерию вирусов. Накопление PABP способствует синтезу белка цитомегаловируса человека (HCMV), что в свою очередь приводит к накоплению Paip2 и EDD1 E3 убиквитин лигазы. EDD1 E3 таргетирует белок Paip2 для его последующей деградации. Координирование контроля PABP, Paip2 и EDD1 требует наличие активатора UL38 mTORC1 (кодируется вирусом) [228, 229]. Это приводит к стабильному увеличению синтеза и ассоциации Paip2 с PABP. Стоит отметить, что накопление Paip2 приводит к повышению уровня PABP в клетках, блокируя тем самым репликацию вирусной ДНК. Более того, нокдаун Paip2 нарушает способность инфицированных клеток к сборке фактора инициации трансляции eIF4F, что приводит к синтезу вирусных белков и репликации без увеличения PABP. Это устанавливает новую роль Paip2 в качестве репрессора вирусных белков и репликации [228].
Белок Paip2 также может связываться непосредственно с мРНК. Так, Paip2 связывается с 3 нетранслируемым регионом мРНК - фактора роста эндотелия сосудов (VEGF; Vascular endothelial growth factor) человека [230]. Снижение количества Paip2 в клетках приводит к деградации мРНК VEGF. Таким образом, Paip2 играет ключевую роль в стабилизации VEGF мРНК. РНК-связывающий белок ELAV-like protein 1 или HuR (human antigen R), который играет большую роль в биогензе мРНК, подобно Paip2 связывается с VEGF мРНК. Paip2 и Hur взаимодействуют друг с другом, и такая кооперация необходима для пролонгации периода полужизни VEGF мРНК [230]. Также Paip2 играет важную роль в стабилизации мРНК GLUT5 (транспортер сахара) у человека. Paip2 входит в состав белкового комплекса I, с молекулярной массой 140 кДа. Данный комплекс связывается с 3 -UTR GLUT5 РНК [231].
Paip2 имеет важное значение во время сперматогенеза. Сперматогенез имеет ключевое значение для всех эукариот. На последнем этапе сперматогенеза мышей происходят следующие морфологические изменения сперматозоида: ядерная конденсация, формирование акросомы и хвоста спермия, а также формирование митохондриальной оболочки средней части жгутика [232]. Было показано участие белка Paip2 в сперматогенезе мышей на поздних этапах транскрипции. Двойной нокаут Paip2a/Paip2b и отдельно Paip2а приводит к бесплодию у самцов. При двойном нокауте Paip2a/Paip2b трансляция белков значительно снижается, хотя логично было бы ожидать обратный эффект [24]. Для поиска белков мишеней Paip2a/Paip2b в семенниках был осуществлен протеомный анализ линий мышей нуль мутантов и с двойным -Paip2a/Paip2b нокаутом. Было обнаружено более 300 белков, и из них только 13% процентов регулируется белками Paip2a/Paip2b. При этом снижение экспрессии на уровне трансляции происходит только у 1/3 белков, остальные активируются в незначительной степени. Нужно отметить, что нокаут Paip2a/Paip2b не имел эффекта на экспрессию генов, кодирующих эти белки [25]. Таким образом, Paip2a/Paip2b имеют ключевое значение на поздних этапах сперматогенеза.
Показана связь белка Paip2a с когнитивными функциями мышей [233]. После активации нейронов, Paip2a подвергается быстрому протеолизу кальпаинами, что оказывает влияние на развитие контекстуальной памяти. Контекстуальная память относится к долговременной памяти. Она необходима для воспоминания различных обстоятельств, которые связаны с определенными событиями [234]. Ингибирование протеасомы вызывает накопление ингибиторов трансляции в клетках, таких как Paip2 и 4E-binding protein 2 (4E-BP2) [233]. Это приводит к нарушению контекстуальной памяти. Нокаут Paip2a в мышах ингибирует ДПП (долгосрочную память потенцирования). Следовательно, Paip2a играет ключевую роль в регуляции генов, связанных с памятью, на уровне трансляции, через реактивацию PABP [233].
Paip2 в ядрах других клеток D. melanogaster
На основе паттерна локализации Paip2 в S2 клетках нами было предположено присутствие этого белка и в ядрах других клеток дрозофилы. В соответствии с данными, которые приведены в базе FlyBase, можно заметить высокий уровень экспрессии Paip2 в семенниках взрослых самцов [242].
Семенники D. melanogaster представляют собой свернутые трубчатые структуры, которые содержат нишу стволовых герминальных и соматических клеток в их апикальной области, а также структуру, известную как хаб (Рис. 17) [43]. В конце митотического деления, после S фазы, герминальные клетки переходят в фазу G2. В результате этого из этих клеток формируются 16 первичных сперматоцитов. Сперматоциты увеличиваются 25 раз в объеме и в них включается программа транскрипции, чтобы активировать гены необходимые для последующего мейотического деления и терминальной дифференцировки сперматоцитов [45].
Герминальные стволовые клетки (ГСК) и соматические стволовые клетки цист (ССКЦ) окружают хаб. ГСК и ССКЦ делятся и формируют по две дочерние клетки, одна из которых сохраняет стволовое состояние и остается в нише, а вторая покидает нишу и дифференцируется. ГСК участвуют в формировании сперматоцитов. Из ССКЦ образуются соматические клетки цисты (КЦ), которые покрывают цисту из 16 первичных сперматоцитов. Фьюсома — структура, характерная только для клеток герминальной линии — сперматогониев. ССКЦ такой структуры не имеют. Она подобна эндоплазматическому ретикулуму, изначально имеет сферическую форму (спектросома), а затем разветвляется, соединяя первичные сперматоциты в цисте цитоплазматическими мостиками и организуя сперматоцисту в единую структуру. Из первичных сперматоцитов путем мейотического деления образуются вторичные сперматоциты, которые затем развиваются до зрелых сперматозоидов. Адаптировано из [243].
Иммуноокрашивание семенников антителами к Paip2 показало, что в зависимости от стадии дифференцировки половых клеток, экспрессия Paip2 изменяется. Так, в стволовых клетках зародышевой линии, на апикальный части семенников, Paip2 практически отсутствует (область 1, Рис. 18А), тогда как в делящихся гонобластах уровень Paip2 незначительно выше. Экспрессия Paip2 существенно повышается в первичных сперматоцитах (область 2, Рис. 18А). На этом этапе развития синтезируются множество белков, которые необходимы для последующей дифференциации сперматозоида. Paip2 был обнаружен в ядрах этих клеток. На поздних стадиях сперматогенеза Paip2 был обнаружен в зоне мейотического деления и дифференцировки сперматид (область 3, Рис. 18А), где он отсутствует в ядрах, но формирует области множественных гранул в цитоплазме. Можно отметить, что на поздних стадиях сперматогенеза транскрипция выключается [244]. Наконец, Paip2 нами был обнаружен в хвостах элонгирующих сперматид (область 4, Рис. 18А), тогда как в семенной везикуле он отсутствует (область 5, Рис. 18А).
Для того, чтобы подтвердить ядерную локализацию Paip2, мы получили две трансгенные линии мух, в которых синтезируется Paip2 с 3FLAG эпитопом. Для этого были собраны конструкции на основе вектора pCaSpEr3 таким образом, чтобы они экспрессировали 3FLAG на N или C концах белка Paip2. Конструкции для экспрессии Paip2 с FLAG эпитопом под эндогенным промотором были интегрированы в геном. Паттерны окрашивания семенников антителами к FLAG и эндогенному белку Paip2 оказались абсолютно одинаковыми. Во всех трех случаях Paip2 был локализован в ядрах первичных сперматоцитов (Рис. 18Б). Так как прежде было показано, что Paip2 экспрессируется во время эмбриогенеза [245], мы проверили его внутриклеточную локализацию на ранних эмбрионах Drosophila. На стадии синцитиальной бластодермы Paip2 имел диффузное распределение в цитоплазме, но при этом его можно обнаружить и в ядрах (Рис. 18В). На этапе формирования клеток (cellularization), когда активируется зиготическая транскрипция [246], мы наблюдали высокий уровень Paip2 в соматических ядрах. Интересно, что Paip2 также был обнаружен в ядрах сформировавшихся предшественников половых клеток (PGC) (Рис. 18Г). В отличие от соматических клеток, транскрипция в PGC на этой стадии инактивирована. Следовательно, локализация Paip2 в ядре не всегда коррелирует с высоким уровнем транскрипции.
Так как прежде было показано, что Paip2 экспрессируется во время эмбриогенеза [245], мы проверили его внутриклеточную локализацию на ранних эмбрионах Drosophila. На стадии синцитиальной бластодермы Paip2 имел преимущетсвенно ядерную локализацию (Рис. 18В). На этапе формирования клеток (cellularization), когда активируется зиготическая транскрипция [246], мы наблюдали высокий уровень Paip2 в соматических ядрах (SN) (Рис. 18Г). Интересно, что Paip2 также был обнаружен в ядрах сформировавшихся предшественников половых клеток (PGC) (Рис. 18Г). В отличие от соматических клеток, транскрипция в PGC на этой стадии инактивирована. Следовательно, локализация Paip2 в ядре не всегда коррелирует с высоким уровнем транскрипции.
Конфокальная визуализация для всех картинок, увеличение400. А) Иммуноокрашивание семенников с помощью антител к Paip2 (красный) и к ламину (зеленый) и DAPI (фиолетовый). Приведено совмещенное изображением. 1) Хаб и зона митотического деления, 2) зона первичных сперматоцитов, 3) зона мейотического деления, 4) элонгирующие сперматиды, 5) семенная везикула. Б) Иммуноокрашивание апикальной части семенников (хаб и зона первичных сперматоцитов) с помощью антител к Paip2, FLAG и ламину в диком типе мух (левая колонка) и линиях мух, экспрессирующих FLAG-Paip2 (центральная колонка) или Paip2-FLAG (правая колонка). В) Иммуноокрашивание ранних эмбрионов (стадия 3) с помощью антител к Paip2 и ламину. Г) Иммуноокрашивание заднего полюса эмбриона на 4-5 стадии (синцитиальной бластодермы) с помощью антител к Paip2 и ламину: соматические ядра (SN), ядра примордиальных герминальных клеток (PGCN).
Paip2 модифицируется PARP-полимеразой
Так как PARP был обнаружен среди Paip2-ассоциированных белков, мы изучили возможность модифицикации этим ферментом белка Paip2. Прежде нами было показано, что в клетках Paip2 представлен двумя формами с электрофоретической подвижностью около 25 кДа (Рис. 13). Мы иммунопреципетировали Paip2 из ядерного экстракта S2 клеток и провели вестерн-блот анализ с использованием антител к Paip2 и к модификации PAR (поли-АДФ-рибозилирование). Оказалось, что верхняя форма Paip2 имеет ту же подвижность, что и полоска, которая детектируется антителами к PAR (Рис. 28В). Кроме того, мы осуществили нокдаун PARP, после чего проанализировали соотношение интенсивности двух форм Paip2 в контроле и после нокдауна (RI) (Рис. 28Г и Д). Количественный анализ показал снижение интенсивности верхней полоски на вестерн-блоте (р = 0.042) (Рис. 28Д). Уровень мРНК гена PARP снизился всего лишь три раза (Рис. 28Е), что обуславливает относительно слабый эффект на соотношение форм Paip2. Таким образом, наши данные указывают на то, что Paip2 может модифицироваться поли-АДФ-рибозилированием.
А) ChIP анализ промоторных областей DHR3, DHR4 и Hsp70 в нормальных клетках и после нокдауна Paip2 и Cbp80 в присутствии экдизона и после теплового шока соответственно. Уровень CDK7 показан в процентах относительно исходной фракции.
Б) Уровни мРНК генов DHR3, DHR4 после экдизона (ночь) и Hsp70 после теплового шока (нормализовано относительно мРНК актина). Значения выражены в относительных единицах, за единицу взята активность гена до добавления экдизона.
В) Поли-АДФ-рибозилирование Paip2 при участии полимеразы PARP. Обозначения на вестерн-блот мембране: исходная фракция (ИФ) клеточного лизата S2 клеток; иммунопреципитация антителами Paip2, PAR и IgG. Полоска, обозначенная с помощью стрелки, соответствует легкой цепи IgG. Показаны результаты, полученные при разных экспозициях: КЭ - короткая экспозиция; ДЭ - длинная экспозиция.
Г) Нокдаун PARP (РНКи PARP) осуществлен в S2 клетках, в 5 независимых экспериментах. Образцы: контроль и РНКи PARP были покрашены антителами к Paip2.
Д) Анализ интенсивности верхней полосы относительно нижней (RI) показало достоверное снижение после нокдауна PARP - РНКи PARP (p = 0.042).
Е) Усредненные значения из 5 независимых экспериментов: уровень мРНК в контроле и после нокдауна PARP. Значения выражены в относительных единицах, за 1 взят уровень транскрипции PARP до нокдауна. На диаграммах показаны стандартные отклонения. Отличие является достоверным (p 0,05).
На основе полученных нами данных была предположена модель функционирования белка Paip2 на промоторах модельных генов (Рис. 29). Данная модель иллюстрирует привлечение Paip2 на промоторы активных генов. Присутствие Paip2 на промоторах является РНК-зависимым. Paip2 взаимодействует с Cbp80, и оба эти белка способны повлиять на статус фосфорилирования S5 CTD РНК-пол II. Этот эффект не зависит от CDK7, поскольку нокдаун Paip2 и Cbp80 не влияет на уровень привлечения CDK7. Наконец, наши данные указывают на то, что Paip2 может модифицироваться поли-АДФ-рибозилированием.