Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. РНКазы 9
1.1.1. Бактериальные РНКазы семейства Т1 9
1.2. Цитотоксичность РНКаз 11
1.2.1. Цитотоксичные РНКазы животных 11
1.2.2. Цитотоксические свойства РНКаз растительного происхождения 13
1.2.3. Цитотоксические свойства РНКаз грибов 15
1.2.4. Цитотоксические свойства бактериальных РНКаз 16
1.2.5. Механизм цитотоксического действия РНКаз 1.2.5.1. Интернализация РНКаз 18
1.2.5.2. Внутриклеточные мишени цитотоксичных РНКаз 21
1.2.5.3. Клеточные ответы на действие цитотоксичных РНКаз 29
1.3. Исследование противоопухолевого действия РНКаз на уровне организма 32
Глава 2. Материалы и методы исследований 35
2.1. Объекты и материалы 35
2.1.1. Бактериальные РНКазы 35
2.1.2. Клеточные культуры 35
2.1.3. Лабораторные животные и опухолевые модели 35
2.2. Методы исследований 36
2.2.1. Выделение и очистка биназы 36
2.2.2. Определение концентрации и каталитической активности РНКаз 39
2.2.3. Определение количества клеток 40
2.2.4. Оценка жизнеспособности клеток 40
2.2.5. Оценка параметров клеток методом проточной цитометрии 41
2.2.6. Иммуноблоттинг 46
2.2.7. Оценка экспрессии генов з
2.2.8. Метод измерения клеточного индекса 53
2.2.9. Морфологические методы 54
2.2.10. Статистический анализ 55
Глава 3. Результаты и их обсуждение 56
3.1. Молекулярные детерминанты цитотоксического действия биназы на злокачественные клетки 56
3.1.1. Цитотоксическое и цитостатическое действие биназы на клетки Касуми-1 56
3.1.2. Влияние биназы на изменение экспрессии апоптических генов в клетках Касуми-1 59
3.1.3. Влияние биназы на реализацию NF-B-зависимых сигнальных путей в клетках Касуми-1 62
3.1.4. Влияние биназы на внутриклеточные параметры клеток Касуми-1 62
3.1.5. Влияние ингибирования Akt1/2 киназ в клетках Касуми-1 на их чувствительность к действию биназы 71
3.1.6. Механизм апоптического действия биназы на клетки Касуми-1 74
3.1.7. Роль экспрессии тирозинкиназы KIT в чувствительности клеток нейробластом к цитотоксическому действию биназы 77
3.1.8. Цитотоксическое действие биназы на клетки острого Т-лимфобластного лейкоза 81
3.2. Влияние изменения общего заряда молекулы РНКазы Sa на ее цитотоксичность по отношению к клеткам Касуми-1 88
3.3. Влияние биназы на печень животных в модели карциномы легких Льюиса 96
Выводы 104
Список сокращений и условных обозначений 105
Приложение 108
Благодарности 111
Список литературы
- Цитотоксичность РНКаз
- Лабораторные животные и опухолевые модели
- Влияние биназы на изменение экспрессии апоптических генов в клетках Касуми-1
- Влияние изменения общего заряда молекулы РНКазы Sa на ее цитотоксичность по отношению к клеткам Касуми-1
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время в мире развернут широкий фронт работ, направленных на поиск и создание новых эффективных соединений, обладающих специфическим терапевтическим действием в отношении определенных групп онкологических заболеваний. Используемые на сегодняшний день химиотерапевтические средства в основном повреждают ДНК опухолевых клеток. Вследствие отсутствия принципиальных различий между ДНК опухолевых и нормальных клеток химиотерапия системно повреждает и здоровые ткани. Избирательность действия противоопухолевых агентов, действующих на РНК, более высока, а побочные эффекты существенно меньше, поскольку РНК в опухолевых клетках отличается по спектру и регуляторным функциям от РНК нормальных клеток.
Накопленные сведения о роли и функциях микробных рибонуклеаз (РНКаз) позволяют рассматривать их как многообещающую альтернативу применяемым в настоящее время химиотерапевтическим средствам терапии злокачественных новообразований.
Степень разработанности темы исследования. На сегодняшний день известно значительное количество РНКаз, обладающих селективным цитотоксическим действием по отношению к клеткам опухолей. Наиболее изученным ферментом этого ряда является РНКаза лягушки Rana pipiens - онконаза, которая дошла до III стадии клинических испытаний как противоопухолевый препарат в комплексной терапии злокачественных новообразований легких (Fang et al., 2011). Бактериальные РНКазы составляют важное семейство РНКаз, некоторые представители которого, в частности, РНКаза из Bacillus pumilus (ранее B. intermedius), биназа, также обладают цитотоксическими свойствами. Одним из важных факторов цитотоксичности микробных РНКаз по отношению к злокачественным клеткам является их невосприимчивость к действию цитоплазматического ингибитора РНКаз, присутствующего практически во всех тканях млекопитающих (Makarov et al., 2008). Несмотря на то, что РНКазы активно исследуются, молекулярный механизм их цитотоксического действия во многом остается неизвестен. Цели и задачи. Целью настоящей работы являлось определение молекулярного механизма цитотоксического действия рибонуклеазы Bacillus pumilus по отношению к злокачественным клеткам. В задачи работы входило:
-
Выявление внутриклеточных параметров, изменение которых сопровождает индукцию апоптоза в клетах острого миелогенного лейкоза Касуми-1, и анализ пути апоптоза, по которому происходит гибель этих клеток под действием биназы.
-
Установление зависимости токсического действия биназы на клетки нейробластом (НБ) от уровня экспрессии гена тирозинкиназы KIT.
-
Исследование токсического действия биназы на клетки острого Т-лимфобластного лейкоза (Т-ОЛЛ).
-
Установление роли заряда молекулы РНКазы в ее цитотоксических свойствах на примере гомологичной биназе РНКазы Sa и ее мутантов.
5. Исследование влияния биназы на печень мышей, несущих карциному легких Льюиса.
Научная новизна исследования. В данной работе впервые установлен механизм апоптоза,
индуцированного биназой в клетках Касуми-1. Выявлено, что ингибирование Akt-сигнального
пути усиливает чувствительность этих клеток к действию биназы. Впервые обнаружено
цитотоксическое действие биназы на клетки нейробластом и острого Т-лимфобластного лейкоза.
Установлено, что цитотоксическое действие биназы на клетки НБ коррелирует с уровнем
экспрессии гена тирозинкиназы KIT в этих клетках. Впервые показано, что катионизация
молекулы РНКазы Sa путем замены отрицательно заряженных аминокислотных остатков на
поверхности молекулы белка положительно заряженными остатками приводит к резкому
усилению цитотоксических свойств фермента по отношению к клеткам Касуми-1. Установлено,
что общий заряд молекулы более важен для токсичности, чем его локализация на молекуле
фермента. Впервые установлено, что биназа в концентрациях, эффективных для угнетения
опухолевого роста, не проявляет гепатотоксических свойств. Обнаружено, что биназа снижает
деструктивные изменения, вызванные развитием опухоли, в печени мышей и восстанавливает ее
регенераторный потенциал.
Теоретическая и практическая значимость работы. В ходе диссертационной работы установлены молекулярные детерминанты цитотоксического действия биназы на ряд линий злокачественных клеток, что важно для терапии конкретных типов онкологических заболеваний. Результаты работы свидетельствуют о том, что цитотоксичность РНКаз в значительной степени определяется положительным зарядом их молекул, поэтому РНКазы с увеличенным зарядом будут обладать более высоким терапевтическим потенциалом. Обнаружение гепатопротекторных свойств биназы характеризует данный фермент как перспективный монотерапевтический противораковый препарат, а также как эффективную компоненту при комбинированной химиотерапии.
Методология и методы исследования. Для выделения и очистки биназы использовали метод теплового шока для трансформации бактерий и методы ионообменной хроматографии и диализа. Эффективность очистки белка анализировали методом электрофореза в ПААГ по Лэммли. Концентрации и каталитические активности РНКаз оценивали спектрофотометрически. Для анализа цитотоксического действия РНКаз на злокачественные клетки использовали современные методы молекулярной и клеточной биологии: генную инженерию, иммуноблоттинг, ОТ-ПЦР, проточную цитометрию, оценку клеточного индекса с использованием технологии xCELLigence,
определение количества клеток с использованием камеры Горяева, тест на жизнеспособность клеток на основе реактива WST-1 и морфологические методы.
Положения, выносимые на защиту.
-
Установлено, что биназа вызывает гибель клеток острого миелогенного лейкоза человека Касуми-1, активируя в них как митохондриальный, так и рецепторный путь апоптоза, при этом биназа не оказывает цитостатического действия. Особенностью апоптоза, индуцированного биназой, является активация канонического и неканонического сигнальных путей NF-B. Показано, что ингибирование Akt-зависимого сигнального пути усиливает действие биназы по отношению к клеткам Касуми-1.
-
Показано, что токсическое действие биназы на клетки нейробластом коррелирует с уровнем экспрессии в них гена тирозинкиназы KIT, что указывает на роль этого белка в индуцированной биназой гибели клеток.
-
Установлено, что биназа подавляет рост клеток острого Т-лимфобластного лейкоза Jurkat и CEMss, индуцируя в них апоптоз. Обнаружено, что апоптическое действие биназы сопряжено со снижением в клетках уровня активных форм кислорода и активацией редокс-чувствительного сигнального пути NF-B.
-
С использованием мутантов РНКазы Sa показано, что цитотоксичность фермента коррелирует с величиной положительного заряда и не зависит от его распределения по поверхности молекулы. Выявлено, что гибель клеток Касуми-1 под действием цитотоксичных мутантов РНКазы Sa обусловлена индукцией в них апоптоза.
-
Показано, что биназа в дозах, оказывающих терапевтический эффект на мышей, несущих опухоли, не проявляет гепатотоксичности как по отношению к здоровым мышам, так и к животным, несущим карциному легкого Льюиса. Обнаружено, что биназа снижает деструктивные изменения в печени, вызванные развитием опухоли, и восстанавливает ее регенераторный потенциал.
Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты работы были представлены на первой Российской конференции по Медицинской химии "MedChem 2013" (Москва, 2013), XIII-ой ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-Вузы (Москва, 2013) и 40-м конгрессе Федерации Европейских Биохимических Обществ (FEBS) (Берлин, Германия, 2015).
Материалы диссертационной работы отражены в четырех статьях, из них три статьи – в зарубежных профильных рецензируемых журналах, одна статья - в отечественном профильном рецензируемом журнале.
Личное участие автора в получении научных результатов. Основные результаты диссертационной работы получены автором или при ее непосредственном участии.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 127 страницах текста и включает в себя 4 таблицы и 44 рисунка. Работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и их обсуждение, выводы, список сокращений и условных обозначений, приложение и список литературы. Список литературы включает 167 наименований.
Цитотоксичность РНКаз
Обнаружение цитотоксических эффектов РНКаз по отношению к онкотрансформированным клеткам послужило толчком к изучению этих ферментов в качестве противоопухолевых агентов. По мере исследования РНКаз было установлено, что некоторые из них проявляют ангиогенную, нейротоксичную, противоопухолевую и иммуноподавляющую активность. Особый интерес ученых вызвал тот факт, что определенные РНКазы могут селективно атаковать злокачественные клетки, вызывая в них апоптоз. Это позволило рассматривать такие РНКазы в качестве альтернативы классическим химиотерапевтическим препаратам [13].
На сегодняшний день среди РНКаз животных с противоопухолевой активностью наиболее известна онконаза, также называемая ранпирназой или по первоначальному названию Р30. Онконаза является РНКазой земноводных и была обнаружена в ранних эмбрионах и неоплодотворенных ооцитах леопардовой лягушки (Rana Pipiens). Она представляет собой небольшой белок из 104 а.к. и имеет ряд особенностей, отличающих ее от других РНКаз семейства РНКазы А: (1) онконаза является очень стабильным белком, денатурирующим при температуре 90С; (2) обладает низкой каталитической активностью (на три порядка ниже РНКазы А) и практически не ингибируется ингибитором РНКаз млекопитающих; (3) онконаза и ее модификации продемонстрировали значительную противоопухолевую активность по отношению к ряду опухолей, таких как рак шейки матки, груди, кишечника, поджелудочной железы, яичников и простаты [14-17]. Исследования онконазы дошли до III фазы клинических испытаний против неоперабельной злокачественной мезотелиомы легких [14, 18, 19]. Однако, на этой стадии клинических исследований оказалось, что онконаза не столь эффективна, как ожидалось, и у некоторых больных вызывает иммунный ответ. Несмотря на то, что онконазу перестали рассматривать как препарат для химиотерапии первой линии, считается, что она может быть использована в комплексной терапии злокачественных образований [17, 20]. После открытия онконазы были установлены цитотоксические эффекты ее близких аналогов: РНКазы из ооцитов и печени лягушек R.catesbeiana (сSBL) [21-26] и R. Japonica (jSBL) [27].
РНКазы, обладающие противоопухолевыми и противовирусными свойствами, были обнаружены и у других животных [26, 28-32]. Наиболее изученными являются РНКазы из семенников быка и поджелудочной железы, BS РНКаза и BP-РНКаза, соответственно. Исследования BS-РНКазы показали ее токсичность по отношению к клеткам миелоидной лейкемии ML-2, нейробластомы NB-1 и NB-2 и к онкотрасформированным клеткам щитовидной железы линий NPA, ARO, CAL62 и KAT4 [26, 31, 32]. Известно, что BS-РНКаза токсична по отношению к злокачественным клеткам только в форме димера. Данная конформация позволяет ферменту избегать ингибирования внутриклеточным ингибитором РНКаз [31]. В свою очередь, BP-РНКаза в форме мономера, подобно онконазе, не подвергается действию ингибитора РНКаз, однако, и не проявляет цитотоксических эффектов. Известно, что BP-РНКаза может существовать как мономер, димер, тример и тетрамер, при этом ее противоопухолевая активность увеличивается с размером. На клетках миелоидной лейкемии ML-2 и HL-60 и в экспериментах in vivo на человеческой непигментированной меланоме димер и тример BP-РНКазы проявили чуть более низкую цитотоксичность, чем димер BS-РНКазы. При этом тетрамер BP-РНКазы продемонстрировал сравнимую или более высокую токсичность по отношению к этим клеткам, чем димер BS-РНКазы, что связывают с увеличением активных центров на молекуле фермента и, соответственно, ее РНКазной активности [28-30]. Однако, низкая специфичность и выявленные побочные эффекты при применении BS-РНКазы и BP-РНКазы показали, что дальнейшее использование и изучение этих РНКаз как потенциальных противоопухолевых агентов требует усовершенствований методами биоинженерии [14].
Некоторые РНКазы человека также имеют потенциал для медицинского применения. Так 18-кДа белок, РНКаза 18К, выделенный из мочи, вызывает мощный цитотоксический эффект и апоптоз-индуцирующиую активность по отношению к клеткам саркомы Капоши, KS, Y-1 in vitro и в мышах, страдающих иммунодефицитом, а также сокращает площадь поражения саркомой у ВИЧ инфицированных пациентов [33, 34]. Было также обнаружено, что внутриклеточная РНКаза L человека ингибирует пролиферацию клеток лейкемии H9 [35]. ИммуноРНКаза человека способна ингибировать рост ErbB-2 положительной карциномы [36], в то время как РНКаза 7 проявляет противомикробную активность [37]. Кроме того, РНКазы, проявляющие цитотоксическое действие по отношению к злокачественным клеткам человека, были выделены из растений, грибов и бактерий [1].
Лабораторные животные и опухолевые модели
В работе использовали клетки острого миелогенного лейкоза человека Касуми-1, клетки нейробластомы человека линий SK-N-SH, SK-N-AS и SH-SY5Y и клетки острого лимфобластного лейкоза (Т-ОЛЛ) Jurkat и CEMss.
Клетки культивировали на среде RPMI-1640 (Invitrogen, США), которая содержала 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Invitrogen, США), 2 мМ глутамина (Invitrogen, США), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия). Клетки выращивали при 37С в атмосфере с 5% CO2 и 20% О2.
Работа с животными была выполнена совместно с сотрудниками лаборатории биохимии нуклеиновых кислот Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского Отделения Российской Академии Наук (ИХБФМ СО РАН). Использовали самки мышей линии C57Bl/6 возраста 10-12-недель. Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург,1986). Животных содержали в освещенном месте при обычном световом режиме (день-ночь), при температуре окружающей среды 20-22 С, влажности не более 50%, в стандартных пластиковых боксах с подстилкой из мелких древесных опилок, по 6-11 особей в боксе. Животные получали стандартный пищевой рацион и имели свободный доступ к воде и пище. Солидные опухоли карциномы легкого Льюиса индуцировали путем внутримышечных инъекций клеток карциномы легкого Льюиса (106, 0,1 мл) в правые бедра мышей. С четвертого дня после трансплантации опухоли животным, несущим карциному легкого Льюиса, делали внутримышечно или внутрибрюшинно инъекции солевого буфера или биназы в дозах 0,1, 0,5 и 1 мг/кг. В общей сложности, в течение двух недель было сделано 8 инъекций. Здоровым животным вводили биназу внутрибрюшинно в концентрации 1 мг/кг три раза в неделю в течение двух недель. Материал для гистологического исследования (печень) был собран на 15-й день после трансплантации карциномы легкого Льюиса.
Для выделения и очистки биназы за основу была взята методика, разработанная Шульгой А.А. [120, 121]. В качестве плазмидного вектора для трансформации клеток E. coli использовали генетическую конструкцию pGemex-1/Pr/ent/Bi на основе продукта pGemex-1 компании Promega, предоставленную Шульгой А.А. (Рисунок 7). В вектор лигированы гены биназы и барстара. В базовом варианте вектор предполагает экспрессию целевого белка под контролем T7 промотора в DE3 штаммах E. coli, однако в данной работе ген биназы экспрессировали под контролем термоиндуцибельного Pr-промотора [122]. После Pr-промотора в начало транскрибируемой части гена встроен лидерный сигнал секреции биназы в культуральную среду, который процессируется при выходе белка из клетки. Барстар при этом остается внутри клеток E. coli, что облегчает очистку биназы (биназа и барстар образуют комплексы с константой диссоциации порядка 10-11М [120]). Экспрессия барстара необходима для снижения токсичности биназы для клеток E.coli. Маркером селективности для данного вектора является устойчивость к ампициллину, которую обеспечивает экспрессия бета-лактамазы.
Плазмидная карта экспрессионного вектора pGemex-1/Pr/ent/Bi для биназы. BAR – ген барстара, STII-Bi – ген биназы с лидерным сигналом, CI857 – термочувствительный CI репрессор фага лямбда, bla – ген бета-лактамазы [120]. В качестве экспрессионного штамма использовали клетки E. coli BL21(DE3), а в качестве штамма для наработки плазмиды – клетки E. coli XL1.
Для культивирования клеток E. coli BL21(DE3) и XL1 использовали среды YT (бакто-триптон 0,8%, дрожжевой экстракт 0,5%, NaCl 0,5% в H2O) и TB (бакто-триптон 1,2%, дрожжевой экстракт 2,4%, глицерин 0,4%, фосфатный буфер 0,1 М, pH 7,2). Все среды стерилизовали автоклавированием и фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Трансформированные клетки выращивали в присутствии ампициллина в концентрации 100 или 200 мг/л. Клетки наращивали до OD550 2 о.е. на качалке при 28С на 250 об/мин. Экспрессию белка индуцировали поднятием температуры до 37С. Выдерживали соотношение объема сосуда к объему среды не менее 5:1 для сохранения достаточной аэрации. Для контроля титра бактерий в культивируемых средах измеряли оптическую плотность культуры при 550 нм с помощью спектрофотометра Jasco V560 (“Jasco”, Япония).
Для проведения первого этапа очистки биназы к охлажденной бактериальной культуре добавляли ледяную уксусную кислоту до pH 4,5, суспензию перемешивали в течение часа при 4С, затем клетки удаляли центрифугированием в течение 15 минут при 6000g. К разбавленной в 5 раз водой культуральной среде добавляли преформированную и уравновешенную в 20 мМ Na-ацетатном буфере (pH 4,5) фосфоцеллюлозу и оставляли на ночь перемешиваться при 4С для осуществления объемной сорбции белка. Затем фосфоцеллюлозу переносили на колонку XK50 (GE Healthcare, США), промывали последовательно 20 мМ Na-ацетатным буфером (pH 4,5) и 20 мМ Na-фосфатным буфером (рН 7,0). Элюировали белок с колонки буфером, содержащим 50 мМ NaH2PO4 и 1,7 М NH4Cl при pH 7,0, и диализовали сначала против воды Milli-Q в течение 4 часов при комнатной температуре, а затем против 20 мМ Na-ацетатного буфера (pH 4,5) в течение ночи при 4С. Диализат фильтровали через мембранные фильтры (0,22 мкм) и наносили на колонку Mono-S HR 50/10, уравновешенную 20 мМ Na-ацетатном буфером (pH 5,0). Элюировали белок линейным градиентом 1 М NaCl (0-50%). После этой стадии фракцию, содержащую биназу, промывали водой Milli-Q и концентрировали в центрифужных концентраторах Amicon Ultra-15 с диаметром пор 3 кДа. Эффективность очистки белка анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) [123] (Рисунок 8). Результаты анализа показали, что на геле присутствует только одна полоса, соответствующая по молекулярной массе биназе. Это подтвердает, что биназа получена в гомогенном состоянии с чистотой выше 95%.
Влияние биназы на изменение экспрессии апоптических генов в клетках Касуми-1
Апоптические клетки регистрировали с помощью Аннексина V (Molecular Probes, США), меченного флуоресцеином (FITC, Ex/Em 494/518 нм) или Pacific Blue (Ex/Em 410/455 нм). При апоптозе фосфатидилсерин, в норме локализованный на внутренней стороне мембраны, переходит на ее внешнюю сторону. Аннексии V связывается с фосфатидилсерином, экспонированным на поверхности клеток [127]. Для детектирования фосфатидилсерина на поверхности клеток, их суспензию центрифугировали (100 g, 10 мин), отбирали супернатант и ресуспендировали в буфере для связывания Аннексина V (10 мМ HEPES, 140 мМ NaCl и 2,5 мМ СаС12, рН 7,4). Затем к 100 мкл суспензии клеток с концентрацией 106 клеток/мл добавляли 5 мкл раствора коньюгата Аннексина V. Пробы инкубировали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре, после чего добавляли 300 мкл буфера для связывания Аннексина V и ставили на лед.
Целостность плазматической мембраны клеток оценивали с помощью пропидий йодида (PI) (Sigma, США) (Ex/Em 535/617 нм). PI проникает только в клетки с поврежденной мембраной и связывается с ДНК. РI добавляли к клеточной суспензии до конечной концентрации 10 мкг/мл за 1 мин до начала измерений. Клетки, окрашиваемые только PI (PI-положительные), характеризовали как некротические. Клетки, которые окрашивались как РI, так и Аннексином V, считали находящимися на поздних стадиях апоптоза. Клетки, которые окрашивались только Аннексином V, характеризовали как раннеапоптические.
Митохондриальный мембранный потенциал оценивали с помощью окрашивания липофильными катионными красителями JC-1 (Ex/Em – 514/529 для мономерных форм красителя и 585/590 нм для агрегированных форм красителя) или DilC1(5) (Ex/Em – 638/658) (Life Technologies, США). Нормальные клетки с высоким митохондриальным потенциалом накапливают краситель в матриксе митохондрии. Высокая концентрация красителя в матриксе активных митохондрий приводит к интенсивной флуоресценции в красной области спектра. В апоптических клетках митохондриальный потенциал снижается, а красители в основном локализуются в цитозоле в мономерной форме. Таким образом, митохондриальная деполяризация приводит к снижению интенсивности флуоресценции в красной области спектра для красителя DilC1(5) и снижению отношения интенсивности флуоресценции в красной области спектра к интенсивности флуоресценции в зеленой области спектра для красителя JC-1. Митохондриальный потенциал оценивали одновременно с апоптозом, используя двойное окрашивание. Клетки с концентрацией 1106 клеток/мл инкубировали с 1 мкМ JC-1 или DilC1(5) в течение 30 минут при температуре 37С в темноте. Затем клетки отмывали фосфатным буфером, ресуспендировали в 0,1 мл аннексин-связывающего буфера (10 мМ Hepes,140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl2, рН 7,4) и инкубировали с 2,5 мкл Аннексина V, меченного Pacific Blue, в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. После этого добавляли 300 мкл аннексин-связывающего буфера и помещали образцы на лед.
Открытие пор, вызывающих переход мембраны митохондрий в состояние высокой проницаемости (MPT пора), оценивали с помощью окрашивания Calcein AM (кальцеина) в сочетании с CoCl2 (MitoProbe Transition Pore Assay Kit, Invitrogen, США). Кальцеин пассивно диффундирует в клетку и накапливается в клеточных компартментах, включая митохондрии. Митохондриальную флуоресценцию кальцеина детектировали пока МРТ поры закрыты, и CoCl2 не проникал в митохондрии. Открытие МРТ пор приводило к тому, что митохондриальная флуоресценция кальцеина гасилась CoCl2, который свободно диффундировал внутрь митохондрий. Для оценки открытия митохондриальных пор клетки инкубировали с 0,01 мкМ кальцеина и 0,4 М CoCl2 в (10 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl2, рН 7,4) в течение 20 минут при температуре 37С. Затем клетки отмывали в фосфатном буфере и анализировали зеленую флуоресценцию кальцеина в митохондриях (Ex/Em – 494/517 нм). В качестве положительного контроля открытия МРТ пор использовали иономицин (0,5 мкМ). Уровень внутриклеточного кальция оценивали с помощью окрашивания fluo-4 (Ex/Em – 494/516 нм) (Molecular Probes, США). Клетки инкубировали в течение 30 минут с 2,5 мкМ красителя при 37С. Затем клетки отмывали и ресуспендировали в фосфатном буфере.
Уровень активных форм кислорода (АФК) оценивали с помощью окрашивания H2DCF-DA (Ex/Em – 495/525 нм) или DHR 123 (Ex/Em – 507/525 нм) (Molecular Probes, США). В отличие от H2DCF-DA, DHR может проникать не только в клетку, но и в митохондрии. Окисление H2DCF-DA и DHR ведет к увеличению квантового выхода флуоресценции и, следовательно, к увеличению интенсивности флуоресценции клетки. Для окрашивания клетки инкубировали с H2DCF-DA или DHR в концентрациях 100 мкМ и 10 мкМ, соответственно, в течение 30 минут при температуре 37С. Затем клетки отмывали и ресуспендировали в фосфатном буфере.
Уровень восстановленного глутатиона оценивали с помощью красителя CMFDA (Ex/Em –492/ 517) (Molecular Probes, США). Краситель CMFDA – производное флуоресцеина, способное проникать сквозь плазмалемму и превращаться в не проходящее сквозь мембрану соединение под действием клеточных ферментов. Свойство CMFDA увеличивать квантовый выход флуоресценции при связывании с восстановленным глутатионом позволяет использовать его для определения уровня глутатиона в клетке [128]. Для оценки уровня восстановленного глутатиона клетки переводили в 100 мкл фосфатного буфера центрифугированием (10 мин, 100 g) и инкубировали с 2 мкМ CMFDA в течение 30 минут при температуре 37С в темноте. Затем клетки отмывали, ресуспендировали с фосфатным буфером и помещали образцы на лед.
Влияние изменения общего заряда молекулы РНКазы Sa на ее цитотоксичность по отношению к клеткам Касуми-1
Ранее было показано, что мишенью токсического действия биназы в клетках Касуми-1 является онкоген KIT [69, 136]. Биназа блокирует путь пролиферации, обусловленный экспрессией этого онкогена, и, таким образом, запускает апоптоз в клетках. При этом часть клеток Касуми-1 оказывается менее чувствительной к действию биназы. Можно предположить, что выживаемость таких клеток при блокировки сигнального пути KIT обусловлена запуском альтернативного пути пролиферации. Анализ литературных данных показал, что в клетках Касуми-1 это может быть путь, опосредованный Akt киназой [107, 137].
В данной работе было исследовано апоптическое действие биназы в присутствии ингибитора Akt1/2 киназ на клетки Касуми-1. Было установлено, что ингибитор Akt1/2 киназ вызывает гибель клеток Касуми-1 по пути апоптоза. Через 24 ч действия ингибитора доля апоптических клеток в популяции Касуми-1 увеличивалась с 8% в контроле до 25 и 33% в присутствии 15 и 25 мкМ ингибитора, соответственно (Рисунок 27). При совместном применении ингибитора Akt1/2 киназ с биназой их цитотоксическое действие складывается: доля апоптических клеток увеличивается с 45% в присутствии биназы (8 мкМ) до 65 и 70% в присутствии биназы и ингибитора Akt1/2 киназ в концентрациях 15 и 25 мкМ, соответственно (Рисунок 27).
Известно, что активация Akt киназ оказывает антиапоптическое действие на клетки преимущественно через ингибирование апоптоз-зависимых событий в митохондриях [138]. Поэтому можно было бы ожидать, что ингибитор Akt1/2 киназ приведет к активации митохондриального пути апоптоза. Однако, ингибитор Akt1/2 киназ в концентрациях 15 и 25 мкМ вызывает лишь незначительное, на 2-4%, увеличение процента клеток со сниженным митохондриальным потенциалом (Рисунок 28). При комплексном применении с биназой ингибитор Akt1/2 киназ даже немного снижает процент клеток со сниженным митохондриальным потенциалом, обусловленным действием биназы. Эти результаты согласуются с литературными данными о том, что ингибитор Akt1/2 киназ не усиливает цитотоксичность противоопухолевых препаратов, апоптическое действие которых реализуется через митохондрии [139].
В работе [139] было установлено, что ингибитор Akt1/2 киназ усиливает действие противолейкозного препарата, триоксида мышьяка, через снижение уровня глутатиона в клетках. В данной работе показано, что применение биназы и ингибитора Akt1/2 киназ, как вместе, так и по отдельности, приводит к снижению уровня восстановленного глутатиона в клетках (Рисунок 29). Ингибитор Akt1/2 киназ в концентрациях 15 и 25 мкМ снижает уровень глутатиона на 80 и 85%, соответственно, тогда как биназа в концентрации 8 мкМ - на 60%. Комплексное воздействие биназы и ингибитора Akt1/2 киназ схоже с индивидуальным действием ингибитора Akt1/2 киназ. / /
Влияние биназы (Bi, 8 мкМ) и ингибитора Akt1/2 киназ в концентрациях 15 мкМ (Akt15) и 25 мкМ (Akt25) на уровень восстановленного глутатиона в популяции клеток Касуми-1 через 24 ч. к – контрольные клетки без обработки биназой. 3.1.6. Механизм апоптического действия биназы на клетки Касуми-1
В данной работе показано, что биназа не обладает цитостатическим действием по отношению к клеткам Касуми-1 и индуцирует гибель этих клеток по пути апоптоза. Индуцированный биназой апоптоз имеет признаки как рецепторного, так и митохондриального сигнального пути. Свидетельствами активации митохондриального пути служат падение митохондриального потенциала (Рисунок 22), образование митохондриальных пор (Рисунок 24) и возрастание уровня Са2+ (Рисунок 25) под действием биназы. С другой стороны, активация каспазы 8 (Рисунок 26) свидетельствует об инициации рецепторного пути апоптоза. Активация каспазы 8, в свою очередь, может быть опосредована TNF, экспрессия гена которого в присутствии биназы увеличивается в 16 раз (Рисунок 18). Было также продемонстрировано возрастание экспрессии инициаторных каспаз 8 и 9, а также эффекторных каспаз 6 и 7, в то время как активация экспрессии гена каспазы 3 не была зарегистрирована (Таблица П1, Рисунок 18). Помимо активации экспрессии генов апоптических каспаз, было обнаружено увеличение экспрессии генов провоспалительных каспаз 1 и 4. Данные цитометрии свидетельствуют, что на уровне белка, в отличие от апоптоза, вызванного классическим индуктором программируемой клеточной гибели камптотецином, активация инициаторных и провоспалительных каспаз под действием биназы не сопровождается активацией эффекторных каспаз 3 и 7. Таким образом, гибель клеток под действием биназы не ограничивается рамками классических рецепторного и митохондриального сигнальных путей апоптоза.
Повышение экспрессии генов NFKB2 и RELB является характерным признаком активации неканонического сигнального пути NF-B [134]. При этом уровень экспрессии гена NFKB1, определяющего включение канонического NF-B сигнального пути, при действии биназы изменяется в меньшей степени (Таблица П1, Рисунок 18). На уровне белка было продемонстрировано возрастание уровня активных форм как NF-B1, так и NF-B2 относительно их неактивных форм в 1,3 и в 1,4 раза, соответственно (Рисунок 19). Полученные результаты говорят об активации как канонического, так и неканонического сигнального пути NF-B под действием биназы в клетках Касуми-1. Активация пути NF-B под действием биназы может быть причиной падения уровня АФК (Рисунок 23), поскольку NF-B предотвращает накопление АФК. Известно, что онконаза также подавляет окислительный стресс в различных клеточных линиях [14]. Однако, в отличие от биназы, действие онконазы опосредовано снижением экспрессии гена NF-B1 в опухолевых клетках мезотелиомы легких [99].
Под действием биназы в клетках Касуми-1 снижается уровень восстановленного глутатиона (Рисунок 29). Снижение уровня глутатиона может влиять на функционирование редокс-чувствительного NF-kВ-зависимого сигнального пути, который вовлечен в регуляцию пролиферации и жизнеспособности клеток. Белки семейства NF-kВ могут регулироваться через обратимое изменение уровня их глутатионилирования (Рисунок 30) [140, 141]. Так, известно, что деглутатионилирование ингибитора NF-kВ-киназы (IKK) приводит к деградации IkB. IkB, в свою очередь, препятствует транслокации комплекса р65/р50 в ядро и активации канонического сигнального пути NF-kВ. Таким образом, деглутатионилирование IKK приводит к активации канонического сигнального пути NF-kВ [142-144]. Однако, в работе Чанга [145] было показано, что глутатионилирование IKK не ингибировало транслокацию р65/р50 в ядро. Активация неканонического сигнального пути NF-kВ сопряжена с глутатионилированием ингибитора NF-kВ-киназы (IKK) [145, 146]. Также показано, что глутатионилирование IKK вызывает деградацию IkB и последующую транслокацию р65/р50 в ядро. На клетках линии HeLa было продемонстрировано, что глутатионилирование IkB по остатку Cys189 приводит к снижению деградации IkB [147]. В работе [148] установлено, что глутатионилирование р65 ингибирует его транслокацию в ядро независимо от деградации IkB. При этом глутатионилирование р65 в злокачественных клетках поджелудочной железы N-ацетил цистеином в гипоксических условиях не ингибировало транслокацию р65 в ядро, но препятствовало его связыванию с ДНК и последующей активации NF-kВ [149]. Глутатионилирование изолированного белка р50 (NF-kВ1) ингибировало его связывание с изолированной ДНК [150].