Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Протеинопатии 7
1.1.1. Протеинопатии 7
1.1.2. Неправильный фолдинг белков и агрегация 9
1.1.3. Амилоидные фибриллы 12
1.1.4. Защитные внутриклеточные механизмы, активируемые при протеинопатиях 13
1.2. Болезнь Альцгеймера 15
1.2.1. Болезнь Альцгеймера 15
1.2.2. Р-амилоид, протеолитический процессинг белка АРР, мутации, ассоциированные с болезнью Альцгеймера 17
1.2.3. Агрегация Р-амилоид а, образование нейротоксических агентов
1.3. Роль ионов цинка в развитии болезни Альцгеймера 23
1.4. Металлсвязывающий домен Ар 24
1.4.1. Роль мутаций и посттрансляционных модификаций металлсвязывающего домена Ар
в патогенезе болезни Альцгеймера 26
1.4.1.1. Мутации металлсвязывающего домена Ар 26
1.4.1.2. Посттрансляционные модификации металлсвязывающего домена Ар 27
1.4.1.3. Металлсвязывающий домен Ар крыс и мышей 28
2. Материалы и методы исследований 29
2.1. Объекты и материалы 29
2.1.1. Использованные реактивы 29
2.1.2. Ар, его фрагменты и модифицированные формы 29
2.1.3. Клеточная культура 31
2.2. Методы исследований 31
2.2.1. Определение концентраций 31
2.2.2. Изотермическая калориметрия титрования з
2.2.2. Оптический биосенсор, работающий на эффекте поверхностного плазмонного резонанса 34
2.2.3. Масс-спектрометрия с ионизацией распылением в электрическом поле 36
2.2.4. Гибридный квантово-механический/молекулярно-механический метод 38
2.2.5. Спектроскопия ЯМР 41
2.2.6. Проточная цитофлуорометрия 44
3. Результаты и их обсуждение 45
3.1. Определение минимального цинк-связывающего сайта в металлсвязывающем домене Ар человека 45
3.2. Определение сайта димеризации металлсвязывающего домена Ар 52
3.3. Влияние модификаций в металлсвязывающем домене Ар на его взаимодействие с ионами цинка 56
3.3.1 Механизм цинк-зависимой димеризации металлсвязывающего домена Ар крысы 56
3.3.2. Влияние фосфорилирования остатка серина в положении восемь металлсвязывающего домена Ар человека на его взаимодействие с ионами цинка 63
3.3.3. Влияние мутации остатка гистидина в положении шесть металлсвязывающего домена Ар человека на его взаимодействие с ионами цинка 72
3.3.4. Влияние изомеризации остатка аспарагиновой кислоты в положении семь Ар человека на его нейротоксические свойства 77
3.4. Молекулярный механизм цинк-зависимой димеризации металлсвязывающего домена Ар
человека и его патогенных модификаций 81
Выводы 83
Список сокращений и условных обозначений 84
Приложение 86
Благодарности 92
Список литературы
- Защитные внутриклеточные механизмы, активируемые при протеинопатиях
- Агрегация Р-амилоид а, образование нейротоксических агентов
- Оптический биосенсор, работающий на эффекте поверхностного плазмонного резонанса
- Влияние мутации остатка гистидина в положении шесть металлсвязывающего домена Ар человека на его взаимодействие с ионами цинка
Защитные внутриклеточные механизмы, активируемые при протеинопатиях
Информация, необходимая для правильного сворачивания пептидной цепи в третичную (нативную) структуру, обеспечивающую биологическую функцию белка, закодирована в его первичной аминокислотной последовательности [15, 16]. Аминокислотная последовательность белка определяет термодинамически стабильную нативную конформацию при физиологических значениях давления, температуры и рН. Белки с простой структурой сворачиваются по принципу «все или ничего», в соответствии с которым переход из развернутой в нативную форму белка является одностадийным [17, 18]. Сворачивание склонных к агрегации белков, однако, не может быть описано в соответствии с этим принципом. В соответствии с современными представлениями, нативная конформация склонных к агрегации белков формируется через образование одной или нескольких частично свернутых промежуточных форм (рисунок 1) [19]. Энергия активации, необходимая для перехода из промежуточного состояния в склонную к агрегации форму, ненамного превышает энергию, необходимую для перехода в нативную форму. При этом агрегированная форма энергетически более выгодна, т.е. соответствует наименьшему значению свободной энергии. Согласно альтернативной модели, развернутая полипептидная цепь может укладываться в две различные, обладающие сходными термодинамическими характеристиками, промежуточные формы. Из одной формируется нативный белок в нормальной конформации, из второй -склонная к агрегации форма. Предполагается, что белки с участками, которые могут формировать альтернативные структуры со сходной термодинамической стабильностью, с большей вероятностью образовывают агрегаты [19]. Кроме того, целый ряд факторов влияет на агрегационные свойства белков, дестабилизируя их нативную конформацию и смещая равновесие в сторону образования агрегатов [2]. Среди этих факторов можно выделить изменения в первичной аминокислотной последовательности [20, 21] и химические модификации белков [22, 23], колебания температуры [23] и рН [24, 25], окислительный стресс [26], увеличение концентрации белков, нарушение работы систем «контроля качества» белков [27, 28]. і
Энергетическая диаграмма переходов между развернутой, промежуточной, нативной и агрегированной формами белка. Белок из промежуточной формы может перейти в нативную конформацию (синяя линия) - путь с более низкой энергией активации (2). Другой путь, обозначенный зеленой линией, имеет более высокую энергию активации (1), однако в результате образуется устойчивая агрегированная форма, которая обладает более низкой свободной энергией.
Каскадный процесс образования гистопатологических включений протекает по сходному для разных протеинопатий механизму [3]. Основные этапы этого процесса показаны на рисунке 2. Первым этапом запуска агрегации является изменение конформации ключевого белка под влиянием ряда факторов, что приводит к его неправильному сворачиванию в патогенную форму (рисунок 2А). Вторым этапом агрегации белков является образование низкомолекулярных олигомеров, из которых затем формируются упорядоченные протофибриллы (неразветвленные структуры шириной 10 нм) либо аморфные агрегаты (рисунок 2Б). Олигомеры и протофибриллы растворимы и находятся в функционально активном пространстве клетки, будучи в большинстве случаев токсичными для нее [29]. Нейротоксический эффект этих продуктов вносит наибольший вклад в развитие нейродегенеративных процессов, а повышение их внутриклеточной концентрации до критического уровня ведет к гибели нейронов [30]. В связи с этим, преобразование протофибрилл в нерастворимые высокомолекулярные фибриллы, из которых формируются плотно упакованные фибриллярные структуры (рисунок 2В), сегодня рассматривается как элемент защитного механизма, способствующего удалению и инактивации растворимых низкомолекулярных агрегатов [3, 30]. На заключительном этапе агрегации в пораженных клетках либо в межклеточном пространстве формируются различные гистопатологические включения, такие как бляшки, тельца, клубки и т.п. (рисунок 2В, таблица 1).
Основные этапы образования гистопатологических включений при протеинопатиях. А - под влиянием различных факторов (перечислены в оранжевом блоке) склонные к агрегации белки претерпевают конформационные изменения, что приводит к их разворачиванию и неправильному сворачиванию в патогенную форму, содержащую Р-складчатые слои. Б - неправильно свернутые белки образуют олигомеры, из которых впоследствии формируются упорядоченные протофибриллы либо аморфные агрегаты. Эти образования, в особенности низкомолекулярные олигомерные формы, оказывают цитотоксическое действие на нейроны. В - на заключительном этапе агрегации из протофибрилл образуются зрелые фибриллы, которые, в свою очередь, формируют гистопатологические включения в нервной ткани. Эти включения могут локализоваться как внутри клеток (внутриядерные, цитоплазматические), так и за их пределами. 1.1.3. Амилоидные фибриллы
При протеинопатиях чаще всего формируются и депонируются гистопатологические включения амилоидного типа. Амилоиды - фибриллярные полипептидные агрегаты, содержащие кросс-Р-листовую структуру (рисунок ЗА) [31]. Последняя редакция списка белков человека, формирующих амилоидные фибриллы, включает 31 белок [32]. Амилоидные фибриллы - сложный объект для детальной структурной характеристики, поскольку они нерастворимы в водных растворах. Для определения структур амилоидных фибрилл используют методы трансмиссионной электронной микроскопии, спектроскопии ЯМР твердого тела и рентгеноструктурного анализа [33-42]. Наличие кросс-Р-листовой структуры, в которой плоскости Р-листов и водородные связи ориентированы параллельно оси фибрилл, а плоскости Р-тяжей - перпендикулярно, обуславливает окрашивание амилоидных фибрилл красителями конго красный, тиофлавин S или Т [33]. Стопки Р-слоев образуют протофиламенты (рисунок ЗБ). Расположенные друг напротив друга протофиламенты связываются друг с другом, как зубцы в молнии, за счет гидрофобных контактов между боковыми короткими участками пептидов (рисунок ЗБ). Такие «стерические молнии» соединяют протофиламенты в фибриллы и являются структурной основой амилоидных фибрилл (рисунок ЗВ, Г) [34, 35].
Структурная организация амилоидных фибрилл (адаптированный рисунок из работ [31] и [34]). А - организация кросс-Р-листовой структуры [PDB Ш 20NV]. В верхней части приведена стержневая модель трех основных цепей пептида, водородные связи между которыми отмечены черной пунктирной линией, в нижней части приведена ленточная диаграмма этих цепей. Б - кросс-Р-листовая структура является основой протофиламента. В -«стерическая молния» (Г), образованная короткими участками боковых цепей пептидов, соединяет протофиламенты, в результате чего формируется зрелая фибрилла. Амилоидные фибриллы, состоящие из полипептидов с одинаковой аминокислотной последовательностью, часто формируют полиморфные структуры. В большинстве случаев амилоидные фибриллы формируются из параллельных Р-листов (рисунок 3, 4А), как, например, фибриллы АР(1-42) [36], фибриллы амилина [37], прионов дрожжей [38], белка РгР [39]. Фибриллы, составленные из антипараллельных Р-листов (рисунок 4Б), встречаются редко и, как правило, формируются из коротких пептидов, которые содержат только один гидрофобный сегмент в одном Р-тяже [40, 41]. Еще реже встречаются фибриллы, образованные Р-спиралями (рисунок 4В). Такая организация характерна для фибрилл белка пертактина [42] и белка CsgA [36]. Как отмечалось выше, амилоидные фибриллы сегодня не рассматриваются как основные нейротоксические агенты при развитии протеинопатий. Однако существует гипотеза, что БА может развиваться в результате нейротоксического действия (прямого либо опосредованного) конкретных структур фибрилл Ар, в то время как другие структуры относительно безопасны [43, 44]. Например, in vitro фибриллы АР(1-40), несущего «айовскую» мутацию, - замену Asp23 на Asn, ассоциированную с развитием ранней формы БА, состоят из антипараллельных Р-листов [45]. Другие мутации в регионе 21-23 Ар также приводят к сходному патологическому структурному эффекту [46]. Изучение структуры и свойств продуктов патогенной агрегации (олигомеров, протофибрилл и фибрилл) и взаимосвязи между этими продуктами является важнейшим звеном в стратегии разработки методов воздействия на процессы формирования и стабильности белковых агрегатов при протеинопатиях.
Агрегация Р-амилоид а, образование нейротоксических агентов
В работе были использованы реактивы аналитической степени чистоты, полученные от Sigma-Aldrich (США). Эксперименты были проведены в деионизированной воде (установка milli-Q, EDM Millipore, Биллерика, США). Реагенты для проведения экспериментов с применением биосенсора Biacore-ЗООО и оптического чипа СМ5: буфер HBS (150 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, 3 мМ ЭДТА, 0,005% Tween, рН 7,4); ацетатный и боратный буферные растворы; 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (EDC); N-гидроксисукцинимид (NHS); 2-(2-пиридинилдитио)этиламин гидрохлорид (PDEA), цистеин (сухой препарат) и солевой раствор (1 М NaCl, 0,1 М ацетат натрия, рН 4,0) были получены от GE Healthcare Life Sciences (США). В экспериментах по масс-спектрометрии были использованы вода и метанол, полученные от Fluka (США).
Синтетические пептиды Ар (таблица 1) чистотой более 98% (проверено с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии) были получены от Biopeptide Co., LLC (США). Аминокислотные последовательности пептидов были подтверждены на масс-спектрометре ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье 93 Bruker Apex Qe 7Т Вшкег (Вшкег Daltonics, США) с использованием фрагментации, индуцированной столкновением ионов с нейтральными частицами. Фрагменты Ар были ацетилированы с N-конца и амидированы с С-конца. Эти модификации предохраняют пептиды от спонтанной агрегации в присутствии ионов цинка в миллимолярных концентрациях [157, 164, 207], в то время как пептиды с открытыми концевыми группами агрегируют при добавлении солей цинка в высоких концентрациях [152, 157]. Для контроля возможности участия N-концевой аминогруппы Asp 1 в хелатировании Zn были использованы фрагменты, не несущие защиту на N-конце. Стоит отметить, что амидирование С-конца фрагментов Ар является имитацией продолжения пептидной цепи. Для ориентированной иммобилизации по -SH группе на поверхности оптического чипа СМ5 был использован модифицированный АР(1-16), включающий линкер, тетраглицилцистеин, на N-конце.
Лиофильно сухие пептиды перед экспериментом растворяли в рабочем буфере, подобранном в соответствии с используемой методикой. Все буферные растворы были профильтрованы через целлюлозные фильтры с диаметром пор 0,22 или 0,45 мкм (EDM Millipore, США) и при необходимости дегазированы (прибор ThermoVac, GE Healthcare Life Sciences, США).
Растворы пептидов АР(1-42) и isoAP(l-42) в мономерной форме готовились как описано ранее [208]. Для этого холодный гексафтороизопропанол добавлялся к сухим пептидам до концентрации 1 мМ и инкубировался 60 мин при комнатной температуре. Затем полученный раствор помещался в лед на 10 мин и переносился в микроцентрифужные пробирки (0,56 мг пептида на пробирку). Пептиды в пробирках высушивались под вакуумом с помощью Eppendorf Concentrator 5301 (Германия). Полученные сухие пептиды хранились при -80 С. Свежий 5 мМ раствор АР(1-42) и isoAP(l-42) готовился добавлением 25 мкл ДМСО к 0,56 мг пептида и инкубировался в течение 1 ч при 25 С. Для обработки клеток непосредственно перед экспериментом пептиды растворялись в ростовой среде клеток, не содержащей сыворотки.
В работе использовались нейрональные стволовые клетки человека NSC-hTERT, иммортализованные введением гена каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) в клетки первичной культуры [209]. Клетки культивировались в среде ДМЕМ/Е12, в которую были добавлены 10 нг/мл человеческих рекомбинантных факторов EGF и bFGF (Invitrogene, США), 2% заменителя сыворотки FetalClonelll (GE Healthcare HyClone, США), 2мМ глутамина, N2 Supplement (Invitrogene, США), 0,11 мг/мл пирувата натрия и 40 ед./мл гентамицина. Клетки культивировались при 37 С в атмосфере с 5% СОг и 4% Ог. Перед обработкой пептидами проводилась дифференцировка клеточной культуры. Клетки высевались по 250 тыс/мл в лунки 24-луночных планшетов. После образования монослоя, факторы EGF и bFGF удалялись из среды. После формирования клетками развитой нейронной сети, ростовая среда менялась на среду без сыворотки, содержащую пептиды. Инкубация клеток с пептидами проводилась в течение 48 ч.
Метод изотермической калориметрии титрования (ИКТ) широко применяют для характеристики взаимодействий биомолекул [212]. Анализ данных, полученных с помощью ИКТ, позволяет определить термодинамические параметры взаимодействия: стехиометрию (N), константу ассоциации (Ка), изменение энтальпии (АН) и энтропии (AS) системы при реакции [212]. Полученный набор термодинамических параметров позволяет охарактеризовать конформационные изменения биомолекул, гидрофобные и катион-анионные взаимодействия, детектировать присоединение ионов водорода. ИКТ - прямой метод измерения, не требующий введения меток, ограничений по молекулярной массе и составу буфера; может быть использован для окрашенных или мутных растворов. ИКТ позволяет измерять Ка в диапозоне от 10 М" до 10 М" , что соответствует диапазону констант диссоциации (Kd) от 1 мМ до 1 нМ [213].
Важнейшие элементы изотермического калориметра - это две ячейки, окруженные адиабатической оболочкой (рисунок ПА). Состав раствора в ячейке сравнения не изменяется, во вторую ячейку, содержащую раствор биомолекулы, постепенно добавляется раствор лиганда [214]. В результате взаимодействия в ячейке с образцом тепло либо выделяется, либо поглощается. Первый термоэлектрический прибор измеряет разницу температур между ячейкой с образцом и ячейкой сравнения, второй - разницу температур между ячейками и адиабатической оболочкой. Разница температур между ячейкой с образцом и ячейкой сравнения (AT) поддерживается на постоянном уровне посредством подогрева либо охлаждения ячейки с образцом за счёт системы обратной связи. Калориметр измеряет мощность, необходимую для поддержания постоянной А Г на протяжении определённого временного отрезка.
Каждый пик на кривой титрования отображает изменение температуры раствора после инъекции малого объёма образца в реакционную ячейку (рисунок 11Б). По мере насыщения раствора лигандом сигнал убывает. При построении изотермы связывания интегральный тепловой эффект (АН) в каждой точке инъекции записывается в виде функции от молярного соотношения концентраций лиганда и биомолекулы. Ка рассчитывается из формы кривой изотермы связывания. Затем, с использованием стандартного термодинамического уравнения (1), где R - универсальная газовая постоянная, а Г- абсолютная температура, рассчитывается свободная энергия Гиббса (AG). Из значений AG и АН вычисляется энтропийный фактор TAS
Связывание фрагментов и мутантов Ар с ионами цинка было проанализировано с помощью ИКТ с использованием прибора MicroCal ІТС200 (GE Healthcare Life Sciences, США) как описано в [215]. Эксперименты проводились при 25С в 50 мМ Трис буфере, рН 7,3. Для фрагментов и мутантов рАР(1-16) измерения также проводились в 20мМ PIPES буфере в присутствии 160 мМ NaCl, рН 7,3. Аликвоты раствора ZnCb (2 мкл) добавлялись в ячейку объемом 0,2 мл, содержащую раствор пептида, до насыщения. Концентрация пептидов в ячейке варьировалась от 0,25 до 0,75 мМ, а концентрация ионов цинка в шприце составляла от 5 до 15 мМ. Теплота разбавления измерялась с помощью титрования буфера раствором ZnCb. Полученная величина вычиталась из теплоты реакции для получения эффективной энтальпии связывания. Измерения для каждого пептида были повторены не менее трех раз с использованием разных концентраций пептида для наиболее точного расчета термодинамических параметров. Анализ полученных изотерм связывания и расчет термодинамических параметров был проведен с помощью программы MicroCal Origin software с использованием модели с одним сайтом связывания (для анализа изотермы связывания рАР(1-16) с ZnCb была использована модель двух независимых сайтов связывания). Аппроксимация теоретической кривой к экспериментальной изотерме связывания осуществлялась по методу наименьших квадратов. В результате определялись параметры взаимодействия ионов цинка и фрагментов АР: Ка, N, АН и TAS.
Оптический биосенсор, работающий на эффекте поверхностного плазмонного резонанса
В отсутствии ионов цинка не было зарегистрировано сигналов ГШР. Также не было зарегистрировано взаимодействия между пептидами в присутствии 10-400 мМ ионов меди. В противоположность этому, добавление ионов цинка в буфер приводило к формированию комплексов между AP(1-16)-G4-C и следующими пептидами: АР(1-16) (рисунок 19А), АР(11-14) (рисунок 19Б), АР(6-14) и АР(7-14). Кинетические и термодинамические параметры этих взаимодействий представлены в таблице 7. Установлено, что в присутствии ионов цинка АР(1-16) образует гомодимеры с Ка=2 10 М" . Поскольку АР(1-5) не взаимодействует с Zn + (таблица 7), можно заключить, что первые пять аминокислотных остатков АР(1-16) не принимают участия в процессе его димеризации. Сокращение АР(1-16) на пять остатков с N-конца и на два с С-конца (АР(1-16) — АР(6-14)) лишь незначительно изменяет сродство пептида к иону цинка. Дальнейшее удаление остатка His6 с N-конца пептида АР(6-14) приводит к пятикратному возрастанию значения Ка от 1x10 М"1 до 5,2x10 М" , это может объясняться тем, что остаток His6 участвует в связывании Zn в мономерном комплексе с АР(6-14) и, таким образом, затрудняет процесс димеризации. Удаление остатка Hisl4 с С-конца АР(6-14) приводит к тому, что пептид не связывается с Zn , следовательно, этот остаток необходим для димеризации АР(1-16). В экспериментах ИКТ было установлено, что аминокислотные остатки
АР(11-14)) приводит к незначительному уменьшению Ка (от 5,2x10 М" до 3x10 М" ), т.е. они не задействованы в цинк-индуцированной димеризации Ар. Полученные результаты свидетельствуют о том, что все пептиды с высоким сродством к Zn содержат аминокислотную последовательность EVHH - фрагмент АР(11-14). Следовательно, этот регион является не только первичным сайтом узнавания цинка АР(1-16), но и фрагментом, необходимым для образования цинк-зависимых комплексов Ар. присутствии Zn в масс-спектре смеси АР(1-16)/АР(11-14) был зарегистрирован изотопный паттерн трехзарядного нековалентного комплекса AP(l-16)-Zn-AP(ll-14) со стехиометрией 1:1:1 (рисунок 20А, m/z 873,7). Другие олигомеры в эксперименте ЭС-МС не наблюдались. В тех же экспериментальных условиях был зарегистрирован гомодимерный комплекс Zn-(AP(11-14))г со стехиометрией 1:2, что коррелирует с данными ИКТ (рисунок 20Б). Полученные фрагмент масс-спектра изотопного паттерна трехзарядного нековалентного комплекса AP(l-16)-Zn-AP(ll-14) полученный для смеси 10 мМ АР(1-16):100 мМ АР(11-14). Б -фрагмент масс-спектра в диапазоне 550-640 m/z, полученный для 10 мМ АР(11-14). Сигналы, соответствующие m/z 562,27, 593,23 и 642,19, относятся к однозарядному иону АР(11-14), EVHH , его двухзарядному димерному комплексу с ионом цинка и однозарядному аддукту того же пептида, соответственно. Измерения проводились в 50% метаноле, в присутствии 300 мкМ Zn(CH3COO)2, рН 6,3. данные позволяют заключить, что фрагмент АР(11-14) играет ключевую роль в процессе цинк-зависимой димеризации АР(1-16), а две взаимодействующие субъединицы АР(1-16) соединяются через посредство иона цинка.
Фрагмент АР(11-14) содержит три потенциальных хелатора иона цинка - остатки Glull, Hisl3, Hisl4, т.е. при формировании димера в координации иона цинка могут принимать участие шесть аминокислотных остатков. Поскольку в биологических системах координационное число цинка равно четырем, некоторые из этих остатков не будут связывать ион цинка. Как было показано выше в экспериментах БППР, остаток His 14 необходим для образования комплекса AP(l-16)-Zn-AP(6-14). Кроме того, данные ЯМР свидетельствуют о том, что хелатирование иона цинка двумя пептидами АР(11-14) приводит к образованию симметричного комплекса (рисунок 17). На основании этих данных с помощью КМ/ММ метода были построены модели димера Zn-(AP(11-14))2. В первой модели ион цинка координировался остатками Glull и Hisl4 двух молекул, во второй - Hisl3 и Hisl4. Рассчитанная энергия образования димера для второй модели была на 0,42 пр.е. меньше, чем для первой модели (таблица 4). Это значимое различие позволяет заключить, что ион цинка предпочтительно хелатируется остатками Glull и His 14 двух молекул (рисунок 21). Эти данные были подтверждены экспериментально с помощью ИКТ. Показано, что пептид АР(11-14)H13R
Рисунок 21. Модель димера Zn-(AP(11-14))2, в которой ион цинка (обозначен оранжевым) координируется Glull и His 14 двух субъединиц (обозначены зеленым и желтым), полученная с помощью метода КМ/ММ с использованием программного пакета GROMACS/CPMD. связывает ион цинка с такими же стехиометрией и сродством, как и пептид АР(11-14) (рисунок П4, см. приложение). Эти результаты свидетельствует о том, что остаток Hisl3 не принимает участия в хелатировании Zn в димере.
Ранее было показано, что ионы цинка обеспечивают межмолекулярное взаимодействие полноразмерных молекул Ар и их последующую олигомеризацию через домен 1-16, а не через С-концевой фрагмент, содержащий потенциальные хелаторы цинка [154, 156]. В рамках диссертационной работы был выявлен участок АР(11-14), EVHH , который играет ключевую роль в процессе цинк-зависимой димеризации АР(1-16) и, следовательно, в димеризации полноразмерной молекулы Ар. Этот участок представляет собой потенциальную лекарственную мишень, направленное блокирование которой будет предотвращать патогенную олигомеризацию Ар [216].
Наличие модификаций в металлсвязывающем домене А3(1-16) оказывает существенное влияние на агрегационные и токсические свойства полноразмерной молекулы Ар. Мутации в АР(1-16) приводят к развитию ранних форм Б А, а посттрансляционные модификации (ПТМ) АР(1-16) играют важную роль в развитии наиболее распространенных поздних форм заболевания. В противоположность этому, природный полиморфизм Ар приводит к тому, что у крыс и мышей, содержащих замены в последовательности АР(1-16), при старении не образуются амилоидные бляшки. В диссертационной работе было проанализировано влияние полиморфизма АР(1-16) на его взаимодействие с ионами цинка для установления молекулярного механизма цинк-индуцированной димеризации Ар при БА.
Влияние мутации остатка гистидина в положении шесть металлсвязывающего домена Ар человека на его взаимодействие с ионами цинка
В растворе в присутствии ионов цинка устанавливается равновесие между мономерным и димерным комплексами металлсвязывающего домена Ар с Zn , смещенное в сторону мономерной формы. В диссертационной работе было показано, что при образовании мономерного комплекса с АР(1-16) ион цинка распознается и захватывается участком 11-14 Ар, а затем боковая цепь остатка His6 приближается к координационной сфере цинка и замыкает ее, что приводит к завершению формирования комплекса (рисунки 18 и 40А) [215]. Далее, было установлено, что этот же участок 11-14, включающий остатки EVHH , формирует интерфейс димеризации АР(1-16), в котором ион цинка координируется остатками Glull и Hisl4 двух субъединиц [216]. Таким образом, можно было предположить, что «выключение» остатка His6 из хелатирования иона цинка в мономерном комплексе будет приводить к смещению равновесия в сторону образования димеров АР(1-16). Действительно, в случае «английской» наследственной мутации Ар такое «выключение» происходит в результате замены остатка His6 на Arg, который, согласно полученным данным ЯМР, не участвует в связывании Zn . В фосфорилированном по остатку Ser8 АР(1-16) остаток His6 задействован в формировании нового цинк-связывающего центра вместе с pSer8 и теряет возможность замкнуть координационную сферу иона цинка после его посадки на сайт узнавания EVHH . Это приводит к тому, что сферу замыкает участок EVHH другой молекулы АР(1-16), в результате чего образуются димеры (рисунок 40Б) [222, 245]. В диссертационной работе установлено, что изомеризация остатка Asp7 приводит к значительному усилению токсического действия полноразмерного АР(1-42) на нейрональные клетки. Склонность к димеризации этой нейротоксичной формы Ар [196, 247] также может быть связана с удалением остатка His6 от координационной сферы цинка в результате удлинения основной белковой цепи на СНг-группу вследствие изомеризации Asp7.
Согласно теории нуклеационной полимеризации, начальный этап формирования амилоидных фибрилл из полноразмерных молекул Ар включает процесс взаимодействия их металлсвязывающих доменов, за которым следует сближение и агрегация гидрофобных участков АР(17-42) [154, 156]. Следовательно, описанный механизм цинк-зависимой димеризации АР(1-16) и его патогенных форм справедлив и для полноразмерных молекул Ар. Схема образования мономерного комплекса Zn с АР(1-16) (А) и цинк-индуцируемой димеризации АР(1-16) (Б) в результате «выключения» His6. Пептиды обозначены синим, ионы цинка - оранжевым, аминокислотные остатки, связанные с ионом цинка - зеленым, «выключение» His6 обозначено красным. А - сначала ион цинка связывается с первичным сайтом его распознавания EVHH АР(1-16), а затем His6 замыкает координационную сферу цинка. Б - в результате мутации либо других структурных перестроек His6 теряет возможность замкнуть координационную сферу цинка, что приводит к димеризации APQ-16).
Таким образом, в результате анализа взаимодействия Zn с АР(1-16) человека и с его модифицированными формами был установлен молекулярный механизм цинк-зависимой димеризации Ар - начального этапа его олигомеризации. [222, 264]. Полученные данные подчеркивают важное значение взаимодействия ионов цинка с металлсвязывающим доменом Ар как молекулярного процесса, лежащего в основе развития БА. Выявленный минимальный сайт димеризации EVHH Ар представляет собой потенциальную лекарственную мишень, направленное блокирование которой будет препятствовать образованию нейротоксичных димеров и последующему процессу патогенной агрегации Ар, приводящей к развитию БА. ВЫВОДЫ
Установлено, что в мономерном комплексе металлсвязывающего домена 1-16 Р 9+ амилоида человека (АР(1-16)) с Zn фрагмент 6-14 формирует минимальный цинк-связывающий центр, в котором ион цинка координируется остатками His6, Glull, Hisl3 и Hi si 4, а участок 11-14 представляет собой первичный сайт узнавания Zn . Этот же участок является сайтом цинк-зависимой димеризации АР(1-16).
Обнаружено, что АР(1-16) крысы образует цинк-индуцированные димеры, структурная организация которых отличается от димеров АР(1-16) человека. В димерах АР(1-16) крысы Zn координируется остатками His6 и His 14 двух субъединиц, взаимное расположение которых препятствует формированию амилоидных фибрилл.
Показано, что исключение остатка His6 из координационной среды Zn вследствие патогенных модификаций в АР(1-16) человека, таких как фосфорилирование остатка Ser8 и «английская» наследственная His6Arg мутация, усиливает его цинк-зависимую димеризацию.
Обнаружено, что изомеризация Asp7 приводит к значительному усилению токсического действия полноразмерного АР(1-42) на нейрональные стволовые клетки человека NSC-hTERT. Нейротоксический эффект этой модификации обусловлен индукцией апоптоза.
Установлен молекулярный механизм цинк-зависимой димеризации металлсвязывающего домена Ар человека и его модифицированных патогенных форм. Показано, что димеризация всех исследованных форм АР(1-16) человека осуществляется через фрагмент 11-14. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фрагмент 11-14 Р-амилоида представляет потенциальную лекарственную мишень, блокирование которой будет препятствовать его патогенной димеризации и развитию