Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Систематика льна 8
1.2. Происхождение льна 8
1.3. Лен в текстильной промышленности 9
1.4. Лен как источник масла 10
1.5. Растениеводство льна 12
1.6. Молекулярно-генетические исследования льна
1.6.1. Структура генома L. usitatissimum 12
1.6.2. Генетические маркеры L. usitatissimum 13
1.6.3. Устойчивость L. usitatissimum к фитопатогенам 14
1.6.4. Молекулярно-генетический контроль промышленных свойств L. usitatissimum
1.6.5. Ответ L. usitatissimum на абиотический стресс 16
1.6.6. Генотрофы 17
1.6.7. Роль 5S рРНК в формировании генотрофов 18
1.7. Роль миРНК в ответе на абиотический стресс у растений 19 24
1.7.1. Биогенез микроРНК 19
1.7.2. Методы идентификации миРНК 21
1.7.3. МиРНК, участвующие в ответе на недостаточное или несбалансированное питание
1.7.4. МиРНК, участвующие в ответе на засуху, засоление и другие абиотические стрессы
2. Материалы и методы 30
2.1. Растительный материал 30
2.2. Выделение ДНК 33
2.3. Выделение РНК 34
2.4. ПЦР на LIS-1 35
2.5. SSAP анализ 35
2.6. Подготовка библиотек миРНК для секвенирования 36
2.7. Подготовка библиотек мРНК для секвенирования 39
2.8. Секвенирование на библиотек кДНК на приборе Illumina Genome Analyzer IIx
2.9. Биоинформатическая обработка данных секвенирования 45
2.10. Обработка данных секвенирования миРНК 46
2.11. Идентификация миРНК, кодируемых LIS-1 47
2.12. Анализ экспрессии миРНК 47
2.13. Обработка данных секвенирования мРНК 47
2.14. Обратная транскрипция миРНК 48
2.15. Обратная транскрипция мРНК 48
2.16. Количественная ПЦР миРНК и мРНК 49
2.17. Выбор контрольных генов и обработка данных количественной ПЦР 52
3. Результаты и обсуждение 53
3.1. Генотрофы льна 53
3.2. SSAP анализ 54
3.3. МиРНК 56
3.3.1. Консервативные миРНК
3.3.2. Потенциальные уникальные миРНК 60
3.3.3. МиРНК, кодируемые LIS-1 и фланкирующими ее участками 62
3.3.4. Анализ экспрессии миРНК на основе данных высокопроизводительного секвенирования 72
3.4. Выбор контрольных генов для количественной ПЦР 64
3.5. Анализ экспрессии миРНК методом количественной ПЦР 66
3.6. Потенциальные целевые гены исследованных миРНК 70
3.7. Секвенирование мРНК растений льна, выращенных в N, P и NPK условиях .
3.8. Анализ уровня мРНК на основе данных высокопроизводительного секвенирования
3.9. Анализ экспрессии мРНК методом количественной ПЦР 74
3.10. Поиск мРНК, потенциально экспрессирующихся с инсерции LIS-1 и фланкирующих ее последовательностей
Заключение 81
Выводы 82
Список литературы
- Молекулярно-генетические исследования льна
- Роль миРНК в ответе на абиотический стресс у растений
- Секвенирование на библиотек кДНК на приборе Illumina Genome Analyzer IIx
- Секвенирование мРНК растений льна, выращенных в N, P и NPK условиях
Молекулярно-генетические исследования льна
Лен обыкновенный – однолетнее травянистое растение. Linum (существительное среднего рода) – в латинском языке имеет несколько значений: лен, нить, рыболовная леска или сеть, ткань или одежда из льна, парус, вкревка, фитиль светитильника или сам светильник [8]. Слово происходит от праиндоевропейского (общий предок индоевропейских языков, включая кельтский) ln - «лен» [www.dic.academic.ru]. Так, что не вполне понятно, что от чего происходит: лен от нити, или нить от льна. Usitatissimum – превосходная степень прилагательного среднего рода: usitatum – общеупотребительный, общепринятый, обычный [8]. Таким образом, Linum usitatissimum переводится как: Лен наиболее общеупотребительный, или наиболее общепринятый, или самый обычный, или наиболее часто используемый.
Помимо волокон, лен выращивают для получения льняного масла. Растениеводами культивируются две формы льна обыкновенного: масличный лен, выращиваемый для получения масла – это относительно короткие растения, образующие большое количество вторичных ветвей; и лен-долгунец, культивируемый с целью получения волокна, эта форма льна более длинная, с меньшим количеством ветвей [9].
Лен – отличный пример полифункциональной сельскохозяйственной культуры, он считается одной из восьми «культур-основателей» растениеводства наряду с зерновыми и бобовыми. С доисторических времен и по сегодняшний день признана экономическая значимость льна [10].
Согласно археологам, первые упоминания о льне, как о доместицированном растении относятся к Ближнему Востоку и датируются более 8 000 лет назад [11]. Происхождение доместицированной формы L. usitatissimum точно не установлено. Предполагается, что он мог произойти от дикого узколистного вида – L. angustifolium Huds., кот орый до сих пор встречается в Средиземноморье. Допускается, что могли возникнуть 2 географические группы: льны-долгунцы в Турции, Египте, Алжире, Тунисе, Испании, Италии и Греции; масличные льны – в Юго-Западной Азии, Афганистане и Индии [12].
Наиболее ценные свойства льняной ткани – высокая прочность и способность впитывать влагу при сравнительно большой воздухо- и теплопроницаемости, а также стойкость против гниения. Льняные ткани весьма носки и дают сравнительно небольшую усадку при увлажнении, масса 1 м2 льняной ткани колеблется от 100 г (батист) до более 1000 г (брезент). Получение длинных прочных волокон из льна - самый ранний успех человечества в области создания тканей [13]. В древнем Египте большинство тканей изготавливалось изо льна, и, хотя не сохранилось информации о том, как люди научились выделять волокна изо льна, до наших дней дошло множество документов, описывающих процессы его выращивания и обработки в древнем Египте [14]. На европейской территории самые древние льняные волокна были обнаружены в станинных жилищах вокруг швейцарских озер, возраст найденных волокон – около 10 000 лет. Производство и использование льняных тканей распространялось через средиземноморские страны в центральную и северную Европу, и достигло Великобритании 2 000 лет назад [13]. Льняная ткань была широко распространена в Европе на протяжении средневековья и эпохи возрождения. В России производство льняной ткани играло важную экономическую роль [15]. В России лен всегда был любимым растением и разводится с незапамятных времен, что подтверждается летописями. В древнерусском земледелии лен был не только прядильным, но и масличным растением. Преподобный Нестор в жизнеописании св. Феодосия Печерского рассказывает, что, когда не хватало у печерских монахов деревянного масла для лампад, они наливали в них масло льняное. Та же летопись подтверждает употребление льняного волокна на ткани. Печерские монахи обрабатывали лен на пряжу, ткали холсты и шили из них рубахи. В начале лен на Руси разводился исключительно для домашнего употребления, но скоро он стал предметом торговли, сначала внутренней, потом и внешней [16]. Начиная с 19 века до 20 века лен стал основным экспортным продуктом для России. В то время Россия производила около 80% льна и до 1936 года была самым крупным экспортером в мире [17].
Диетологи рекомендуют включать в диету льняные семена или полученное из них льняное масло. Причина в том, что в масле льняных семян высоко содержание полиненасыщенных жирных кислот, лигнанов [18], фенолокислот и флавоноидов (Таблица 1). Льняное масло особенно ценно благодаря содержанию необходимых человеку полиненасыщенных жирных кислот, в особенности -линоленовой кислоты, полезной не только для питания, но и полимер которой используется при производстве линолеума, красок и других продуктов [19]. Значение -линоленовой кислоты для здоровья человека сложно переоценить, показано, что ее потребление снижает риск развития рака [20] и сердечнососудистых заболеваний [21]. Помимо -линоленовой кислоты в состав льняного масла входят, лигнаны, например дигликозид секоизоларициресинола – антиоксидант и предшественник прогестеронов [19]. Комплексное воздействие компонентов льняного масла на организм снижает риск развития диабета [22], имеет противовоспалительное действие [23], а также улучшает состояние пациента при различных заболеваниях почек [24].
Роль миРНК в ответе на абиотический стресс у растений
Интересно, что АВА может регулировать экспрессию генов, кодирующих миРНК. Для ряда генов миРНК показано наличие регуляторных последовательностей – мишеней АВА [130]. Вероятно, это еще один механизм тонкой настройки ответа на стресс и поддержания баланса элементов в растении. Еще один пример регуляции адаптивного ответа – наличие схожих последовательностей в регуляторной области генов, кодирующих miR166k, miR393 и miR397b. Все эти миРНК принимают участие в ответе на засуху у растений, а общие регуляторные элементы свидетельствуют об их совместной регуляции [130].
Другой возможный путь адаптации к засухе – снижение потребления воды. Показано, что целевым для miR393 является ген TIR1, который кодирует рецептор ауксина – гормона, играющего ключевую роль в росте растения. Замедление роста растения в условиях стресса является адаптивным механизмом, позволяющим растению снизить потребление воды, а также перенаправить энергию на синтез защитных молекул и противостоять стрессу [132]. Еще один адаптивный механизм – удержание и перераспределение воды в растении. Так, целевым геном для miR835 предположительно является ген, кодирующий белок аквапорин, который способствует удержанию воды в клетках растения в условиях засухи [118]. А целевым геном для miR814 предположительно является гликопротеин, богатый гидроксипролином. Белки этого семейства способствуют накоплению пролина, который участвует в нормализации осмотического давления в клетке и помогает растению адаптироваться к засухе и другим видам абиотического стресса [125]. Других примеров участия миРНК в регуляции экспрессии белков данного семейства в литературе не обнаружено. Однако установлено участие miR474 в подавлении экспрессии гена, кодирующего пролин дегидрогиназу в условиях засухи [66].
Засоление – еще один из основных абиотических стрессов для растений, приводящий к изменению метаболической активности, геномной нестабильности, повреждению клеточной стенки и цитоплазмотическому лизису. Адаптивный ответ растений на засоление включает изменения в различных молекулярных механизмах клетки, в том числе в фотосинтезе, передаче сигналов, транскрипции, мембранном транспорте, биосинтезе белков и их распаде [130]. Зачастую, формирование адаптивного ответа на засоление схоже с формированием ответа растения на засуху – вовлекает одни и те же транскрипционные факторы или осуществляется по одному молекулярному механизму. Так, в ответе на засоление показано участие вышеописанных miR393, miR160, miR167 и miR169 [133]. Однако в некоторых случаях механизм адаптивного ответа на засоление и на засуху – диаметрально противоположны. Примером может служить исследование у A. thaliana семейства miR394. МиРНК miR394a/b консервативны, целевым геном для них является LCR (LEAF CURLING RESPONSIVENESS), кодирующий белок с мотивом F-box. При обработке растения ABA уровень экспрессии miR394a/b повышается, при этом уровень экспрессии белка LCR, напротив, снижается. Мутантное растение со повышенной экспрессией mir394a/b и нокаут мутант по гену LCR гиперчувствительны к солевому стрессу и устойчивы к засухе по сравнению с диким типом. Мутант с повышенной экспрессией гена LCR имеет устойчивый к солевому стрессу фенотип, однако чувствителен к недостатку воды. На основе полученных данных был сделан вывод, что подавление экспрессии гена LCR с помощью mir394a/b существенно для достижения необходимого фенотипа растением в условиях абиотического стресса. При этом противоположные фенотипы при солевом стрессе и засухе достигаются за счет изменения функционального баланса между miR394 и белком LCR [134]. Интересно, что впервые функциональная пара miR394a/b-LCR была описана в связи с морфологией листа A. thaliana. Было показано, что мутантное растение с копией гена LCR, устойчивого к действию miR394a/b приводит к дефекту в морфологии, а именно лист закручивается вниз, в противоположном случае, при повышенной экспрессии miR394a/b в растении дикого типа лист закручивается вверх, а нормальный фенотип достигается лишь при оптимальном балансе [135]. Также получены косвенные данные, свидетельствующие об участии miR394 в ответе на холодовой стресс у A. thaliana [107]. При этом тепловой шок у A. thaliana индуцирует экспрессию уже упомянутой miR398, в данном случае ее мишень – ген, кодирующий шаперон CSD2 [136].
Как видно из описанных примеров, адаптивный ответ растения на абиотический стресс, это сложная, многокомпонентная система, в которой невозможно отделить одни молекулярные пути от других. Функции и миРНК, и транскрипционных факторов, и других компонентов системы направлены на достижение физиологического баланса в растении. МиРНК – ключевой компонент растительной клетки, участвующий в развитии растения, адаптации к различным стрессам, способный обуславливать взаимодействия растения с другими живыми компонентами окружающей среды, при этом способный к саморегуляции. Информация о молекулярных механизмах действия миРНК при абиотическом стрессе может стать эффективным инструментов в руках селекционеров, в особенности в условиях климатических и антропогенных изменений окружающей среды. В свою очередь исследование функции миРНК при формировании адаптивного ответа на стресс в растениях льна важно для понимания формирования фенотипа растений-генотрофов.
Секвенирование на библиотек кДНК на приборе Illumina Genome Analyzer IIx
У некоторых линий и сортов льна при выращивании в условиях избытка или недостатка питания происходят наследуемые изменения генома. Такие линии названы пластичными, а генотипы, в которых данные изменения произошли -генотрофами. Наиболее известным генетическим изменением льна является возникновение у генотрофов в определенной области генома инсерции последовательности LIS-1 длиной 5,7 т.п.о. Локус инсерции LIS-1 расположен между генами ING1 (INHIBITOR OF GROWTH 1) и KRP2 (KIP-RELATED CYCLINE-DEPENDENT KINASE INHIBITOR 2). Постепенно под действием стрессовых условий участок генома, несущий LIS-1 становится гомозиготным и стабильно наследуется. Последовательность LIS-1 секвенирована, в ней содержатся короткие участки, совпадающие с отдельными участками генома льна, а также биоинформатически предсказанные поcледовательности, предположительно кодирующие миРНК. При этом в последовательности LIS-1 не обнаружено протяженных открытых рамок считывания или участков, гомологичных транспозонам или другим мобильными генетическими элементами [59]. В данной работе для идентификации последовательности LIS-1 использовался метод ПЦР с последующей визуализацией методом электрофореза в агарозном геле (Рисунок 2). Были проанализированы растения 50 сортов и линий льна (Таблица 3, Материалы и методы). В 16 из них была выявлена вставка LIS-1: Liral Prince, Stormont cirrus, TMP 1919, А-29, Антей, Г-1071/4, Глазовский кряж, Дипломат, Лада, Ленок, Мерилин, Могилевский 2, Прибой, Синичка, Смолич, Тост. Cорта и линии льна, несущие инсерцию LIS-1, являются генотрофами и заслуживают особого внимания при изучении ответных реакций растений льна на стрессовые факторы внешней среды.
Одной из отличительных особенностей генома линий генотрофов является значительное изменение в количестве копий генов 5S ДНК [60]. Показано, что набор длин рестрикционных фрагментов, полученных при рестрикции по сайту, характерному последовательности 5S ДНК для линий-генотрофов отличается от аналогичного набора исходных линий льна. [61]. Изменение количества копий гена 5S ДНК может происходить за счет активности мобильного генетического элемента – траспозона Cassandra. Данный ретротранспозон несет консервативную последовательность гена 5S ДНК, окруженную длинными концевыми повторами. Ретротранспозон Cassandra широко распространен среди различных видов растений. У L. usitatissimum длина Cassandra составляет 276 п.о. (номер последовательности GenBank DQ767972) [155]. В представленной работе для поиска сайтов интеграции ретротранспозона Cassandra у L. usitatissimum SSAP подход использован впервые, поэтому на первом этапе работы были подобраны оптимальные условия рестрикции, лигирования и амплификации. Для проверки воспроизводимости SSAP метода на сорте Stormont сirrus в двукратной повторности были проведены рестрикция, лигирование и амплификация, после чего полученные ПЦР продукты визуализировались в акриламидном и агарозном геле. Были получены идентичные электрофоретические спектры ПЦР продуктов и показана возможность использования SSAP метода для выявления сайтов интеграции ретротранспозона Cassandra у растений льна.
Далее было проведено SSAP маркирование сайтов интеграции ретротранспозона Cassandra у 16 сортов и линий льна как со вставкой LIS-1, так и без нее (Рисунок 3).
Электрофоретические спектры у различных образцов практически не отличались, также не было найдено специфических для генотрофов или непластичных сортов фрагментов ДНК. Таким образом, не было выявлено связи между SSAP маркерами ретротранспозона Cassandra и генетической пластичностью льна. Можно предположить, что процесс формирования генотрофов не связан с активацией LTR-ретротранспозона Cassandra.
3.3. МиРНК
Для идентификации миРНК, экспрессирующихся у льна при его выращивании в различных условиях питания и оценки экспрессии миРНК в различных условиях было впервые проведено высокопроизводительное секвенирование малых РНК льна. Для этого была выделена тотальная РНК из растений льна линии Stormont cirrus, выращенных в трех различных условиях (N, NPK и Р). В геномах растений, выращенных в условиях N и условиях NPK, отсутствовала последовательность LIS-1, в геноме растения, выращенного в условиях Р, последовательность LIS-1 присутствовала.
Из выделенной тотальной РНК были подготовлены и секвенированы на высокопроизводительном секвенаторе Illumina GAIIx три библиотеки малых РНК (Рисунок 4). А Б В N . WHPUHtf .- -sL ,!_.. I 4 1 « « И It II 1« Рис. 4. Визуализация библиотек малых РНК льна на Agilent. Библиотеки миРНК растений Stormont cirrus, выращенных в условиях NPK (А), N (Б), P (В). В результате секвенирования было получено 7,2, 11,6 и 7,6 миллиона прочтений для библиотек малых РНК растений, выращенных в условиях N, P, NPK, соответственно. Все секвенированные последовательности размещены в базе данных European Nucleotide Archive (ENA) под номером PRJEB9528. Наиболее многочисленными среди секвенированных малых РНК были малые РНК длинной 21 нуклеотид (23-26% от общего числа прочтений) и 24 нуклеотида (21-28% от общего числа прочтений) (Рисунок 5).
Прочтения, которые встречались в данных секвенирования более 6 раз, были картированны на последовательность генома L. usitatissimum [19]. Большинство картированных прочтений имели не менее одного совпадения с геномом льна (77% для библиотеки NPK, 77% для библиотеки N и 78% для библиотеки P).
В прочтениях, полученных в результате секвенирования библиотеки РНК, выделенной из растений, выращенных в условиях NPK, доля малых РНК длиной 24 нуклеотиды была больше, чем в двух других образцах, в которых преобладали прочтения длиной 21 нуклеотид. Согласно литературным данным миРНК длиной 21 нуклеотид, а также транс-активные малые интерферирующие РНК длиной 21 нуклеотид принимают участие в пост транскрипционной репрессии генов путем деградации мРНК или репрессии процесса трансляции мРНК [156].
Секвенирование мРНК растений льна, выращенных в N, P и NPK условиях
На основе данных высокопроизводительного секвенирования были отобраны 13 генов с потенциально дифференциальной экспрессией у растений льна в условиях несбалансированного питания, а также 2 гена (ING1 и KRP2), расположенных рядом со всавкой LIS-1 для дальнейшего анализа на расширенной выборке из 31 образца методом количественной ПЦР. Выбранные гены кодируют: ДНК-связывающие белки семейства WRKY (WRKY DNA-binding protein 70 (WRKY70), WRKY DNA-binding protein 33 (WRKY33), WRKY DNA-binding protein 40 (WRKY40)); белки семейства JAZ (JAZ8/TIFY5A jasmonate-zim-domain protein 8 (JAZ8); JAS1, JAZ10, TIFY9 jasmonate-zim-domain protein 10 (JAZ10)); нуклеазу HARBI1 (HARBI1); метилтрансферазу S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase (SAM MTase); инвертазу Neutral invertase (A/N-Invs); фактор CCR4-associated factor 1 homolog 11 (CAF1-11); белок BTB and TAZ domain protein 4 (BT4); белок MLP-like protein 423 (MLP423); транскрипционный фактор Ethylene-responsive transcription factor ERF (ERF); белок Myb domain protein 41 (MYB41).
Изменение экспрессии генов, кодирующих ДНК-связывающие белки семейства WRKY и белки семейства JAZ, выявлено в большинстве растений линии Stormont cirrus (вне зависимости от наличия инсерции последовательности LIS-1) и сорта Bethune (Рисунок 12).
Изменение экспрессии генов, кодирующих белки семейства JAZ, было с х ож и м д ля л ин ии S t orm on t cirrus с инс ер ци ей L I S -1 и б ез нее, а также сорта Bethune – экспрессия генов повышалась в условиях P по сравнению с условиями NPK (Таблица 9). Таблица 9. Уровень экспрессии генов, кодирующих белки семейства JAZ.
Белки семейства JAZ играют роль репрессоров жасмоновой кислоты, которая участвует в регуляции роста и развития растения, а также ответа на стрессы [180]. Также, в литературе описано взаимодействие процесса убиквитинирования и сигнального пути жасмонатов [181]. Участие белков семейства JAZ в ответе на дефицит питательных веществ описано для растений риса и нута, экспрессия большинства генов, кодирующих белки семейства JAZ в этих растениях, индуцируется через 7 дней дефицита фосфата и репрессируется через 15 дней в тех же условиях [182].
Согласно полученным данным, белки семейства JAZ могут принимать участие в формирование адаптивного ответа на несбалансированное питание у льна.
Снижение экспрессии генов семейства WRKY в NPK условиях по сравнению с P условиями показано только для генотипов без LIS-1 (Bethune и Stormont cirrus без LIS-1), в то время как для Stormont cirrus с LIS-1 отмечена обратная тенденция (Таблица 10).
Медиана P и NPK(Stormont cirrus с LIS-1) Медиана P и NPK(Stormont cirrus без LIS-1) Медиана P и NPK (Bethune) WRKY70 -3,6 и -2,8 -0,4 и -2,3 -1,9 и -4,3 WRKY33 -2,0 и -1,4 -0,7 и -2,9 -1,5 и -2,7 WRKY40 -2,0 и -1,3 -0,5 и -2,9 -1,0 и -3,4 Белки семейства WRKY играют роль транскрипционных факторов и вовлечены во множество процессов жизнедеятельности растений, включая ответ на стресс [183]. В литературе описан целый ряд исследований роли белков семейства WRKY в различных видах растений [184][185]. В частности, на растениях риса показано участие белков семейства WRKY в формировании устойчивости растений к дефициту фосфата [186]. А у Arabidopsis белок WRKY42 участвует в регуляции гомеостаза фосфата [187]. У льна ранее описано только участие белков семейства WRKY в ответе на щелочной стресс [188][189]
На основе полученных данных можно предположить, что белки семейства WRKY принимают участие в ответе растений льна на дисбаланс элементов питания. При этом различия в изменении экспрессии генов семейства WRKY при недостаточном и избыточном питании ассоциированы с присутствием инсерции LIS-1.
Для остальных отобранных и проанализированных генов изменение экспрессии наблюдалось для отдельных групп образцов. Для линии Stormont cirrus с LIS-1 статистически значимы (p 0,05) были изменения экспрессия генов, кодирующих HARBI1 (медиана : -5,2 в P, -3,8 в NPK и -2,8 в N условиях), BT4 (-4,2 в P и -3,0 в NPK), A/N-Invs (-1,5 в P и 0,2 в NPK), MLP423 (-4,2 в P, -2,9 в NPK и -4,8 в N). Для линии Stormont cirrus без LIS-1 значимо (p 0,05) изменялась экспрессия генов, кодирующих BT4 (-4,6 в P и -3,1 в N) и ERF (-3,4 в P, -7,2 в NPK, и -5,7 в N). У сорта Bethune показано статистически значимое (p 0,05) изменение экспрессии гена, кодирующего MYB41: -1,8 в P, -3,7 в NPK, и -2,6 в N условиях. Не выявлено значимых изменений экспрессии у одной и той же линии или сорта при выращивании в N, Р или NPK условиях для генов, кодирующих CAF1-11 и SAM MTase. Таким образом, при выращивании растений льна в P или NPK условиях для линии Stormont cirrus отмечено изменение экспрессии значительного числа генов, а для сорта Bethune – лишь одного, что может свидетельствовать о большей способности линии Stormont cirrus реагировать на стресс от дисбаланса элементов питания. Рис. 13. Уровень экспрессии генов HARBI1, MLP423, ING1, A/N-INVS, BT4, KRP2, ERF, MYB41, SAM MTase, CAF1-11 в условиях P, NPK и N. Данные количественной ПЦР. 3.10. Поиск мРНК, потенциально экспрессирующихся с инсерции LIS-1 и фланкирующих ее последовательностей
В данных секвенирования транскриптомов растений льна проведен поиск нуклеотидных последовательностей, совпадающих с LIS-1 (номер GenBank AF104351.1), а также с фланкирующими эту инсерцию последовательностями (номера GenBank AF300797.1 и AF300798.1) с использованием BLAST анализа. Результаты представлены на рисунке 14. Для LIS-1 5 и 3 фланкирующих последовательностей обнаружено совпадение с участками, являющимися экзонам генов ING1 и KRP2. Непосредственно с инсерцией LIS-1 совпали лишь отдельные k-меры прочтений, большинство из которых локализованы на 3 конце. Кроме того, совпадения найдены как в образце с LIS-1, так и в образцах без нее, что свидетельствует о том, что выявленные k-меры относятся не к LIS-1, а к другим участкам генома льна. Таким образом, полученные данные секвенирования транскриптома не содержат мРНК, потенциально кодируемых LIS-1.
Покрытие последовательности LIS-1 и LIS-1 5 и 3 фланкирующих последовательностей. Данные высокопроизводительного секвенирования. Референсные последовательности GenBank accessions: LIS-1 – AF104351.1, LIS-1 5 flank – AF300797.1, LIS-1 3 flank – AF300798.1.
Так как инсерция LIS-1 появляется в геноме льна в определенном участке между генами ING1 и KRP2 [59], мы предположили, что наличие LIS-1 может оказывать влияние на экспрессию этих генов. Поэтому провели оценку уровня мРНК генов ING1 и KRP2 в условиях P, к которым адаптивны генотрофы с LIS-1, и N как с использованием высокопроизводительного секвенирования, так и количественной ПЦР. По данным секвенирования экспрессия этих генов изменялась незначительно у линий с инсерцией LIS-1 и без нее. По данным количественной ПЦР экспрессия ING1 снижалась в P условиях во всех группах образцов : Stormont cirrus с LIS-1 – медиана : -3,4 в P и -2,8 в N; Stormont cirrus без LIS-1 – медиана : -4,2 в P и -3,2 в N; Bethune медиана : -3,8 в P и -2,9 в N. Уровень мРНК гена KRP2 практически не изменялся. Таким образом, экспрессии генов ING1 и KRP2 изменялась сходным образов вне зависимости от наличия инсерции LIS-1, и можно предположить, что данные гены не играют ключевой роли в адаптации генотрофов к стрессовым воздействиям.