Содержание к диссертации
Введение
1. Список сокращений 5
2. Введение
2.1. Актуальность работы 7
2.2. Цели и задачи работы 8
2.3. Новизна и научная значимость работы 8
2.4. Личный вклад автора 9
2.5. Методология и методы исследования 9
2.6. Положения, выносимые на защиту 10
2.7. Степень достоверности и апробация результатов 10
3. Обзор литературы 12
3.1. Клеточное старение 13
3.2. Причины активации клеточного старения 17
3.2.1. Разворачивание теломерной петли 18
3.2.3. Клеточное старение, вызванное повреждением ДНК 20
3.2.4. Клеточное старение, индуцированное ионизирующей радиацией 21
3.2.5. Клеточное старение, индуцированное ультрафиолетом 22
3.2.6. Клеточное старение и активные формы кислорода 24
3.2.7. Клеточное старение, индуцированное гипоксией 25
3.2.8. Клеточное старение, вызванное сверхэкспрессией онкогенов 26
3.2.9. Низкомолекулярные соединения, вызывающие клеточное старение
3.3. Влияние гипертермии на клеточную пролиферацию 34
3.4. Повреждающие эффекты теплового стресса
3.4.1. Изменение структуры и локализации белков 36
3.4.2. Регуляция экспрессии генов при тепловом стрессе 37
3.4.3. Нарушение целостности ДНК 39
4. Материалы и методы 41
4.1. Материалы 41
4.2. Методы 43
4.2.1. Культивирование клеток человека и синхронизация двойным тимидиновым блоком 43
4.2.2. Тепловой стресс и обработка химическими агентами 43
4.2.3. Включение аналогов нуклеотидов 44
4.2.4. РНК-интерференция 44
4.2.5. Иммуноцитохимия и микроскопия 44
4.2.6. Совместное иммунофлуоресцентное окрашивание против белка TRF2 и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с пробой к теломерным повторам 45
4.2.7. Измерение активности -галактозидазы 46
4.2.8. Выделение РНК 46
4.2.9. Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени
4.2.10. Приготовление белковых экстрактов и вестерн-блот гибридизация 47
4.2.11. Проточная цитофлуориметрия 48
4.2.12. Нейтральный гель-электрофорез одиночных клеток (метод ДНК-комет) 48
4.2.13. Определение активности ДНК-топоизомеразы I (метод релаксации плазмидной ДНК) 49
4.2.14. K+-ДСН-преципитация ковалентных ДНК-белковых комплексов 50
4.2.15. Преципитация ковалентных ДНК-белковых комплексов этанолом (RADAR)
5. Результаты и обсуждение 52
5.1. Тепловой стресс индуцирует преждевременное старение клеток человека 5.2. Преждевременное старение, индуцированное тепловым стрессом, развивается по p21-зависимому пути 54
5.3. Только клетки, находящиеся в ранней s-фазе клеточного цикла в момент теплового стресса, приобретают фенотип клеточного старения 55
5.4. Преждевременное старение, индуцированное тепловым стрессом, останавливает пролиферацию клеток в g2-фазе клеточного цикла 57
5.5. Тепловой стресс индуцирует персистирующие сигналы о повреждениях днк только в клетках, находящихся в ранней s-фазе 58
5.6. В результате теплового стресса возникают две волны фосфорилирования гистона h2ax, осуществляемого разными киназами 60 5.7. Индуцированная тепловым стрессом диссоциация trf2 не является источником сигналов о повреждении днк 63
5.8. Ингибирование днк-топоизомеразы i приводит к преждевременному старению клеток, находящихся в ранней s-фазе 65
5.9. Тепловой стресс ингибирует днк-топоизомеразу i в клетках человека 67
5.10. Днк-топоизомераза i необходима для развития индуцированного тепловым стрессом клеточного старения 69
5.11. Репликация днк необходима для индукции клеточного старения, вызванного тепловым стрессом или действием камптотецина 70
5.12. Двуцепочечные разрывы днк являются источником персистирующих сигналов о повреждениях днк 72
5.13. Формирование персистирующих сигналов о повреждениях днк, индуцированных тепловым стрессом, зависит от транскрипционной и протеосомной активностей 74
5.14. Основной причиной индукции генотоксическим стрессом клеточного старения, являются одноцепочечные разрывы 6. Заключение 79
7. Выводы 80
8. Список литературы
- Новизна и научная значимость работы
- Разворачивание теломерной петли
- Культивирование клеток человека и синхронизация двойным тимидиновым блоком
- Определение активности ДНК-топоизомеразы I (метод релаксации плазмидной ДНК)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Постоянно меняющиеся условия окружающей среды оказывают воздействие на функционирование живых систем и зачастую воспринимаются ими как стресс. Изучение молекулярных механизмов клеточного ответа на стресс является одним из важных направлений исследования современной молекулярной и клеточной биологии. Изучение механизмов, лежащих в основе клеточной адаптации, систем репарации возникающих повреждений ДНК и регуляции клеточной пролиферации в стрессовых условиях имеет как фундаментальное, так и прикладное значение. Большое внимание уделяется, в частности, изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе индуцированного стрессом клеточного старения. Раскрытие механизмов клеточного старения представляется важным для понимания причин и механизмов старения организма в целом. Кроме того, феномен клеточного старения имеет тесную взаимосвязь со злокачественным перерождением клеток.
Клеточное старение представляет собой необратимый арест пролиферации. Развитие клеточного старения может вызываться как эндогенными, так и экзогенными стимулами. Классическим примером является репликативное старение, вызываемое укорочением длины хромосом (теломер) с каждым последующим раундом деления клетки. Универсальной схемы развития клеточного старения нет. Механизм развития клеточного старения зависит от природы стрессового фактора и клеточной линии. Для некоторых стрессовых факторов механизмы индукции клеточного старения не известны. В частности, совершенно не исследованы механизмы индукции клеточного старения, индуцируемого тепловым стрессом. Настоящая диссертационная работа посвящена изучению молекулярных механизмов индуцированного тепловым стрессом клеточного старения. Хотя данная работа является фундаментальным исследованием, полученные результаты могут иметь и определенное практическое приложение. Исследование механизмов индуцированного тепловым стрессом клеточного старения позволило сформулировать обобщенную модель индукции преждевременного старения клеток, находящихся на стадии ранней S-фазы клеточного цикла. Предложенная модель индукции клеточного старения оказалась справедливой и для случаев обработки клеток рядом низкомолекулярных соединений, в частности, ингибитором ДНК-топоизомеразы I камптотецином, производные которого активно используются в химиотерапии опухолей. Интересно, что для индукции клеточного старения «ранне-Б-фазных» клеток достаточно экстремально малых доз камптотецина. Этот факт может быть важен для разработки новых и оптимизации существующих химиотерапевтических протоколов.
Цели и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение механизмов, лежащих в основе индуцированного тепловым стрессом преждевременного клеточного старения.
Для реализации поставленной цели были определены следующие экспериментальные задачи:
-
Определить, приводит ли тепловой стресс к преждевременному старению человеческих клеток нормального и ракового происхождения;
-
Выявить сигнальный путь, играющий основную роль в запуске и поддержании программы клеточного старения;
-
Установить, являются ли двуцепочечные разрывы ДНК причиной запуска клеточного старения, индуцированного тепловым стрессом;
-
Определить природу формирования двуцепочечных разрывов ДНК.
Научная новизна и практическая значимость работы. В диссертационной работе продемонстрировано, что острый тепловой стресс индуцирует клеточное старение в нормальных и раковых клетках человека по p21CIP1/WAF1-зависимому пути. Показано, что развитие клеточного старения зависит от стадии клеточного цикла и происходит только в клетках, находящихся в ранней S-фазе в момент действия теплового стресса. Раскрыт механизм активации клеточного старения тепловым стрессом. Продемонстрировано, что причиной индуцированного тепловым стрессом клеточного старения являются персистирующие сигналы о повреждении ДНК, связанные с образованием сложнорепарируемых двуцепочечных разрывов ДНК (ДЦР). При тепловом стрессе ДЦР образуются в результате столкновения вилок репликации ДНК с одноцепочечными разрывами ДНК (ОЦР), которые образуются вследствие ингибирования тепловым стрессом ДНК-топоизомеразы I.
Впервые показано, что, подобно химиотерапевтическому агенту камптотецину, тепловой стресс ингибирует ДНК-топоизомеразу I на стадии внесения одноцепочечного разрыва в ДНК. Продемонстрировано, что механизм активации клеточного старения тепловым стрессом работает и в случае повреждения ДНК химическими соединениями вызывающими ДЦР.
Методология и методы исследования. Работа выполнена с использованием
современного оборудования и методов молекулярной и клеточной биологии. В ходе
выполнения диссертационной работы был использован широкий спектр методов, включающих
методики молекулярного клонирования, флуоресцентной гибридизации,
иммуноцитохимического окрашивания, вестерн-блот анализа, ПЦР в реальном времени, РНК-интерференции и др.
Положения, выносимые на защиту.
-
Тепловой стресс индуцирует преждевременное старение нормальных и раковых клеток человека.
-
Причиной индуцированного тепловым стрессом клеточного старения являются персистирующие сигналы о повреждении ДНК, которые связаны с образованием сложнорепарируемых ДПР.
-
ДПР, индуцированные тепловым стрессом, образуются в результате столкновения вилок репликации ДНК с ОЦР, возникшими вследствие ингибирования тепловым стрессом ДНК-топоизомеразы I.
-
Для индукции преждевременного старения клеток, находящихся в ранней S-фазе клеточного цикла, достаточно возникновения небольшого количества ОЦР любого происхождения.
Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертационной работы были представлены на трех международных конференциях: «XVth Gliwice Scientific Meeting» (Гливицы, Польша, 2012), «Offspring-Meeting of the International Research Training Group GieB en/Marburg» (Москва, 2013), «Global and mechanistic approaches in nucleic acid biology» (С.-Петербург, 2013). По теме диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК {Nucleic Acids Res, Cell Мої Life Sci, Cell Biol Int).
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на 104 страницах, включает 2 таблицы и 29 рисунков. Библиография включает 412 источников.
Новизна и научная значимость работы
В диссертационной работе продемонстрировано, что острый тепловой стресс индуцирует клеточное старение в нормальных и раковых клетках человека по p21CIP1/WAF1-зависимому пути. Показано, что развитие клеточного старения зависит от стадии клеточного цикла и происходит только в клетках, находящихся в ранней S-фазе в момент действия теплового стресса. Обоснована модель, описывающая механизм активации тепловым стрессом клеточного старения. Согласно этой модели, причиной индуцированного тепловым стрессом клеточного старения являются персистирующие сигналы о повреждении ДНК, связанные с образованием сложнорепарируемых двуцепочечных разрывов ДНК (ДЦР). При тепловом стрессе ДЦР образуются в результате столкновения вилок репликации ДНК с одноцепочечными разрывами ДНК (ОЦР), которые образуются вследствие ингибирования тепловым стрессом ДНК-топоизомеразы I.
Впервые показано, что, подобно химиотерапевтическому агенту камптотецину, тепловой стресс ингибирует ДНК-топоизомеразу I на стадии внесения одноцепочечного разрыва в ДНК. Продемонстрировано, что предложенная модель активации клеточного старения тепловым стрессом справедлива не только для теплового стресса, но и для повреждающих ДНК химических соединений.
Диссертационная работа основана на собственных данных, полученных автором в период с 2012 по 2015 гг. В ходе работы автором проведены эксперименты, демонстрирующие проявление основных признаков клеточного старения в клетках после воздействия теплового стресса. Автор показал, что клеточное старение, индуцированное тепловым стрессом, развивается по p21-зависимому пути и характеризуется арестом пролиферации на стадии G2 клеточного цикла. Было установлено, что причиной индукции клеточного старения тепловым стрессом являются возникающие персистирующие сигналы о повреждении ДНК, не связанные с нарушением структуры теломер. Автор участвовал в проведении совместных экспериментов по доказательству предложенного механизма индукции клеточного старения тепловым стрессом.
Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной и клеточной биологии. За время выполнения диссертационной работы автором освоен и использован широкий спектр методов, включающих методики молекулярного клонирования, флуоресцентной гибридизации, иммуноцитохимического окрашивания, вестерн-блот анализа, ПЦР в реальном времени, РНК-интерференции и др. 2.6. Положения, выносимые на защиту 1. Тепловой стресс индуцирует преждевременное старение нормальных и раковых клеток человека. 2. Причиной индуцированного тепловым стрессом клеточного старения являются персистирующие сигналы о повреждении ДНК, которые связаны с образованием сложнорепарируемых ДЦР. 3. ДЦР, индуцированные тепловым стрессом, образуются в результате столкновения вилок репликации ДНК с ОЦР, возникшими вследствие ингибирования тепловым стрессом ДНК-топоизомеразы I. 4. Для индукции преждевременного старения клеток, находящихся в ранней S-фазе клеточного цикла, достаточно возникновения небольшого количества ОЦР любого происхождения.
Результаты работы были опубликованы в рецензируемых научных журналах (Nucleic Acids Res, Cell Mol Life Sci, Cell Biol Int) и представлены автором на международных конференциях. Публикации: 1. Velichko A.K. , Petrova N.V. , Razin S.V., Kantidze O.L. (2015) Mechanism of heat stress-induced cellular senescence elucidates the exclusive vulnerability of early S-phase cells to mild genotoxic stress. Nucleic Acids Res 43(13):6309-6320 вклад авторов в работу является равным 2. Petrova N.V., Velichko A.K., Kantidze O.L., Razin S.V. (2014) Heat shock-induced dissociation of TRF2 from telomeres does not initiate a telomere-dependent DNA damage ёresponse. Cell Biol Int 38(5):675-681 3. Velichko A.K., Markova E.N., Petrova N.V., Razin S.V., Kantidze O.L. (2013) Mechanisms of heat shock response in mammals. Cell Mol Life Sci 70(22):4229-4241 Материалы конференций: 1. Petrova N.V., Velichko A.K., Razin S.V., Kantidze O.L. Dual role of H2AX in heat shock response. XVth Gliwice Scientific Meeting, November 16-17 2012, Gliwice, Poland; 2. Petrova N.V., Velichko A.K., Razin S.V., Kantidze O.L. Dual effect of heat shock on DNA replication and genome integrity. Offspring-Meeting of the International Research Training Group GieBen/Marburg, June 26-29 2013, Moscow, Russia; 3. Petrova N.V., Velichko A.K., Kantidze O.L., Razin S.V. Heat shock-induced dissociation of TRF2 from telomeres does not initiate a telomere-dependent DNA damage. Workshop «Global and mechanistic approaches in nucleic acid biology» of the International Research Training Group GieBen/Marburg, September 17-20 2013, Saint-Petersburg, Russia.
Разворачивание теломерной петли
Остальные признаки клеточного старения являются дополнительными и, скорее, помогают определить природу стрессового фактора, индуцирующего клеточное старение.
Одной из распространённых причин активации программы клеточного старения являются сигналы о повреждении ДНК [42]. В результате нарушения целостности ДНК происходит активация систем репарации (DDR, DNA damage-response) и привлечение в сайты повреждения репарационных белков. Многие репарационные белки, такие как H2AX, 53BP1, MDC1, NBS1, MRE11 и RAD17, концентрируются в так называемых фокусах репарации, которые могут быть выявлены при иммуноокрашивании клеток соответствующими антителами [43,44]. Присутствие персистирующих репарационных фокусов в клетках может быть предпосылкой для развития фенотипа клеточного старения [42].
В ядрах состарившихся клеток наблюдается формирование областей конденсированного хроматина, получивших название фокусов гетерохроматина, ассоциированных с клеточным старением (SAHF, senescence-associated heterochromatin foci) [45-47]. Цитологически, очаги гетерохроматизации выявляются с помощью интеркалирующего красителя ДНК DAPI. Формирование SAHF сопровождается общим увеличением устойчивости к нуклеазам [45], аккумуляцией белков-маркеров транскрипционно неактивного хроматина - гистона Н3 триметилированного по лизину 9 (H3K9me3), белка гетерохроматина 1 (HP1), гистона macroH2A и некоторых других [45-47]. Недавно было показано, что структурной основой SAHF могут быть открепившиеся от ламины в ходе клеточного старения участки генома, ассоциированные с ламиной (LADs, lamina-associated domains) [48]. Известно, что основными индукторами клеточного старения, при котором происходит формирование SAHF, являются сверхэкспрессия онкогенов и ряд генотоксических ядов [45,49]. Стоит добавить, что формирование SAHF происходит далеко не во всех типах клеточных линий и зависит от природы индуцирующего клеточное старение агента [49]. Развитие клеточного старения, при котором наблюдается формирование SAHF происходит в основном по р16INK4a-зависимому пути [49].
Несмотря на пролиферативный арест «стареющие» клетки сохраняют высокую метаболическую активность. Одним из показателей такой активности является специфический секреторный фенотип (SASP, senescence-associated secretory phenotype) [50]. Считается, что секреция биоактивных молекул, таких как цитокины, хемокины и интерлейкины, обеспечивает паракринное общение клеток между собой и активирует воспалительный ответ внутри организма для ликвидации клеток, проявляющих признаки клеточного старения [51]. Особенностью SASP является его динамическое развитие с первым заметным проявлением через несколько суток после активации программы клеточного старения [52]. В активации SASP принимают участие MAPK-, mTOR- и DDR-сигнальные пути [53-55].
Сравнительный анализ экспрессии микроРНК нормальных клеток и клеток с признаками клеточного старения, выявил несколько десятков микроРНК, потенциально участвующих в регуляции клеточного старения (SA-miRNAs, senescence-associated miRNAs) [56,57]. Однако, однозначной корреляции между данными, полученными в независимых экспериментах, нет. Достоверно воспроизводятся изменение экспрессии только четырех SA-miRNAs: miR-146a, -34а, -29 и -15а [58-68]. Известно, что miR-146a подавляет индукцию SASP [66,67], сверхэкспрессия miR-34а регулируется р53 [62,69] и приводит к ингибированию E2F-сигнального пути [60], также как и сверхэкспрессия miR-15а [70]; miR-29 подавляет экспрессию транскрипционного фактора B-Myb, необходимого для нормального прохождения клеточного цикла [65]. К группе некодирующих РНК, участвующих в регуляции клеточного старения, относится недавно обнаруженная длинная некодирующая РНК PANDA [71]. В комплексе с белками Polycomb PANDA подавляет развитие клеточного старения путем репрессии транскрипционного фактора NF-YA [71].
Следует добавить, что масштабная реорганизация метаболизма «стареющих» клеток сопровождается и другими событиями. Отмечено, что изменяется протеом внеклеточного матрикса [72,73], в ряде случаев увеличивается экспрессия виментина и фибронектина [74,75], коллагеназы [76,77], нарушается структура ядерной ламины [78,79], претерпевает серьёзную перестройку архитектура ядра [80,81], увеличивается транскрипция ретротраспозонов [82,83], изменяется общий эпигенетический статус хроматина [84].
Все перечисленные признаки являются следствиями активации программы клеточного старения и развиваются в соответствии с природой индуцирующего стрессового фактора и клеточной линией. Широкий спектр необязательных (факультативных) признаков клеточного старения говорит о разнообразии биохимических каскадов, участвующих в развитии и поддержании фенотипа клеточного старения. Ниже мы попытаемся обобщить существующие сведения о возможных механизмах индукции и развития клеточного старения.
После экспериментов Л. Хайфлика и П. Мурхеда [4] возникли две точки зрения о причинах остановки пролиферации нормальных клеток [85]. Согласно первой гипотезе, существуют внутренние механизмы, определяющие предельное количество делений клеток. Согласно второй, ставившей под сомнение существование «предела Хайфлика», культивируемые клетки прекращают свое деление в результате накопления повреждений, вызванных физиологическими стрессами [86]. Две гипотезы впоследствии нашли свои подтверждения в открытии эндогенных и экзогенных факторов, активирующих программу клеточного старения
Укорочение длины теломер было первым феноменом, обратившим на себя внимание в качестве внутреннего активатора развития репликативного старения [22]. В 1984 году К. Грейдер и Э. Блэкберн, работая на инфузории Tetrahymena thermophila, обнаружили фермент теломеразу, которая достраивает одноцепочечную 3 -цепь ДНК (G-цепь) [87]. В результате действия теломеразы образуется достаточно длинный выступающий одноцепочечный 3 -конец ДНК, который используется в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепи ДНК [87]. Таким образом, происходит увеличение общей длины теломерных участков хромосом. Позднее было продемонстрировано, что в соматических клетках в норме теломераза отсутствует, в то время как ее активность присутствует в иммортализованных и большинстве раковых клеток [88,89]. Эти данные подтверждали концепцию «теломерных молекулярных часов».
Измерения длины теломер в отдельных клетках и в популяции делящихся клеток продемонстрировали, что существует большая вариабельность в их длине [90-92]. В связи с этим возникло предположение, что для индукции клеточного старения синхронное укорочение всех хромосом не является необходимым, а достаточно нарушения целостности отдельных теломер [90,93,94]. С помощью гибридизации олигонуклеотидов к 3 -выступающему участку теломер было показано, что для запуска клеточного старения важна не общая длина теломер, а средняя длина 3 -выступающего участка отдельных хромосом [94,95] и присутствие специфических белков в теломерных участках [96].
Электронно-микроскопические исследования Д. Гриффита с соавторами, продемонстрировали, что теломеры организованы в так-называемые t-петли (t-loop) [97]. Формирование t-петли зависит от наличия 3 -выступающего одноцепочечного участка ДНК длиной 50-200 нуклеотидов, который гибридизуется с вышележащим двуцепочечным повтором, вытесняя одну из цепей [97] (Рисунок 2). Укорочение одноцепочечного 3 -концевого участка может приводить к разворачиванию t-петли и служить активатором клеточного старения [95]. Важную роль в организации t-петли играют белки шелтеринового комплекса, которые защищают теломеры от нежелательного действия репаративных систем и регулируют активность теломеразы [98-100].
Культивирование клеток человека и синхронизация двойным тимидиновым блоком
Одной из основных мишеней гипертермии являются белки. Тепловой стресс является причиной денатурации белков [7,342]. Денатурация происходит в результате изменений нативной конформации белков под действием дестабилизирующих факторов таких как температура, рН, соли тяжелых металлов и некоторых других. Нарушение пространственной организации полипептидной цепи ведет к потере функций белка. Для предотвращения массовой денатурации белков в ответ на тепловой стресс в клетке значительно усиливается синтез HSPs [343]. HSPs являются молекулярными шаперонами и играют важнейшую роль в поддержании нативной структуры белков. Они обеспечивают правильную укладку белков (фолдинг) и рефолдинг агрегированных или неправильно уложенных белков [343]. Помимо шаперонных функций белки теплового шока обладают антиапоптотическим действием, блокируя действие цитохрома с, Apaf-1 и AIF [344-346]. Следовательно, повышенная экспрессия HSPs при стрессе повышает жизнеспособность клеток.
В результате действия гипертермии происходит диссоциация и релокализация белков внутри компартментов клетки. Возможно, этот эффект связан с частичной или полной денатурацией белков, ведущей к нарушению белок-белковых взаимодействий или ДНК-, РНК-белковых. Очевидно, что диссоциация и релокализация белков из естественных мест депонирования может отражаться на их функционировании. Классическим примером является образование ядерных [347] и цитоплазматических [348,349] стресс-гранул при тепловом стрессе.
В результате теплового стресса может происходить диссоциация белка НР1 из прицентромерных областей [350]. Согласно классическому представлению, НР1 участвует в организации конститутивного гетерохроматина, маркером которого является триметилированный по лизину 9 гистон H3 [351]. Ядрышко при тепловом стрессе также имеет тенденцию к деконденсации в результате релокализации нуклеолина, следствием чего предположительно является ингибирование репликации [342]. Одним из ярких примеров диссоциации комплексов цитоплазматических белков под действием теплового стресса является нарушение структуры центросом, организующих клеточный центр и веретено деления. Следствием дисфункции центросом является митотическая катастрофа [331].
Как мы видим, гипертермия имеет широкий спектр действия на белковый гомеостаз клетки. Тепловой стресс сопровождается усиленной экспрессией HSPs, направленных на восстановление нативной структуры денатурированных белков, и релокализацией некоторых белков с изменением их функциональных нагрузок. Кроме того, денатурация белков может приводить к неспецифическому ингибированию таких макромолекулярных процессах как репликация, репарация, транскрипция, трансляция и др.
Как было сказано ранее, при тепловом стрессе происходят масштабные изменения в транскриптоме клеток [7]. Наряду с общей репрессией транскрипции, трансляции и сплайсинга РНК, происходит активная экспрессия небольшого числа генов, ответственных за стабилизацию гомеостаза клетки [352-354].
Общее ингибирование транскрипции при тепловом стрессе изучено слабо. Известны несколько механизмов, при которых транскрибируемые SINE РНК связываются с РНК-полимеразой II и блокируют сборку преинициаторного комплекса, тем самым подавляя инициацию транскрипции [355,356]. Вклад в общее снижение уровня транскрипции при тепловом стрессе может вносить гипоацетилирование гистонов и сдвиг статуса хроматина к более закрытому типу [357]. Интересно, что в деацетилировании гистонов участвует транскрипционный фактор HSF1, регулирующий транскрипцию белков теплового шока [357].
На трансляционном уровне общая репрессия происходит в результате образования цитоплазматических стресс-гранул, в которых происходит «заморозка» трансляции на уровне инициации [347,358-360].
При гипертермии специфично возрастает экспрессия многих генов, в частности, кодирующих HSPs, регуляторы шаперонов, белки систем протеасомной деградации, сигнальной трансдукции, мембранного транспорта, репарации ДНК и некоторые другие [361]. Экспрессия стресс-индуцируемых белков при гипертермии зависит от специфических транскрипционных факторов: HSF1, ATFs, XBP1, NF-kB, STAT3 [362-364]. Активация этих транскрипционных факторов часто связана с регуляцией пролиферативной активности клеток. Интересно, что транскрипционный фактор HSF1 может усиливать транскрипцию р53 и p21CIP1/WAF1, а также осуществляет фосфорилирование р53 в комплексе с ATR и Chk1 при действии генотоксических ядов [365]. Данные о том, происходит ли увеличение транскрипции p21CIP1/WAF1 и р53 при тепловом стрессе, остаются противоречивыми. В культуре нормальных и раковых клеток печени тепловой стресс не вызывает увеличения количества мРНК р53 и p21CIP1/WAF1 [366]. В то же время, согласно другим экспериментальным данным, полученным на клетках глиобластомы, MDAH041 и T98G при тепловом стрессе количество мРНК p21CIP1/WAF1 значительно возрастает [333,367].
Необходимо учесть, что регуляция экспрессии генов при гипертермии может происходить на посттранскрипционном уровне. На примере культуры клеток H1299 показано, что возрастание уровня экспрессии p21CIP1/WAF1 при тепловом стрессе связано не столько с повышением уровня транскрипции, сколько со стабилизацией его мРНК [368]. Другой пример демонстрирует стабилизацию структуры и накопление белка р53 путем его прямого взаимодействия с HSPs [369]. Также на стабильности и функциональной активности белков могут сказываться посттрансляционные модификации ацетилирование, фосфорилирование, убиквитинилирование и другие. В частности, при тепловом стрессе происходит фосфорилирование р53 по серину 15 киназой ATM [369,370]. Эта модификация модулирует транскрипционную активность р53 и важна для дальнейшего развития DDR в условиях стресса [371].
На посттранскрипционном уровне экспрессия генов часто регулируется микро-РНК [372]. О роли микроРНК в регуляции экспрессии генов при гипертермии известно не так много. Недавно опубликованы данные об участии эндогенных микроРНК в массовом подавлении экспрессии генов при тепловом стрессе в клетках млекопитающих [373]. На клетках фибробластов кожи было показано, что при тепловом стрессе происходит изменение уровня экспрессии порядка сотни микроРНК. Предполагаемыми мишенями их действия являются компоненты системы клеточного ответа на стресс: TTC7A, DNAJB2, IGF1R, NOX3, HMGN3, AHSA1, HSPA4L (HSP70L), HSPA6, HOXB8 и некоторые другие [374].
Таким образом, гипертермия приводит к общей репрессии процессов транскрипции и трансляции мРНК. Но на общем фоне ингибирования этих процессов происходит избирательная экспрессии генов, участвующих в поддержании гомеостаза клетки и регуляции пролиферации.
Определение активности ДНК-топоизомеразы I (метод релаксации плазмидной ДНК)
Чтобы определить роль ДНК-топоизомеразы I в развитии индуцированного тепловым стрессом клеточного старения, мы решили проанализировать проявление признаков клеточного старения в условиях ингибирования экспрессии ДНК топоизомеразы I. Для подавления экспрессии ДНК-топоизомеразы I мы воспользовались методом РНК-интерференции. Эффективность метода оценивали по количеству мРНК топоизомеразы I, полученной из контрольных клеток HeLa и клеток, трансфецированных набором миРНК (Рисунок 22А). Подобрав оптимальные условия, клетки HeLa трансфецировали миРНК, синхронизировали по ранней S-фазе и подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) или инкубировали в среде с камптотецином (CPT, 0.1 мкМ, 60 минут). Спустя 72 часа культивирования клеток в
А. Эффективность нокдауна ДНК-топоизомеразы І в клетках линии HeLa оценивали по уровню мРНК ДНК-топоизомеразы I. РНК выделяли из контрольных и трансфецированных миРНК клеток, проводили реакцию обратной транскрипции, и полученную кДНК анализировали с помощью ПЦР в реальном времени. Уровень амплифицированной кДНК нормировали на уровень кДНК GAPDH. Б. Контрольные и трансфецированные (iTopl) клетки HeLa, синхронизировали по ранней S-фазе и подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) или камптотецина (СРТ, 0.5 мкМ, 30 минут). После 72-часового периода восстановления анализировали процент клеток с признаками клеточного старения. КТ- трансфекция контрольной миРНК. нормальных условиях анализировали процентное содержание клеток, проявляющих морфологические признаки клеточного старения и имевших высокий уровень H2АХ (Рисунок 22Б). На основе полученных данных, мы заключили, что в случае снижения количества ДНК-топоизомеразы I, эффекты теплового стресса и камптотецина были существенно снижались. Следовательно, ингибирование ДНК-топоизомеразы I является необходимым этапом в развитии индуцированного тепловым стрессом клеточного старения.
Принимая во внимание тот факт, что тепловой стресс подавляет репликацию ДНК, а также блокирует активность ДНК-топоизомеразы I (Рисунок 20А), мы решили проверить взаимосвязь этих событий друг с другом. Мы рассматривали вероятность двух ситуаций: с одной стороны, ингибирование ДНК-топоизомеразы I может привести к остановке репликации, с другой стороны, остановка репликации и ингибирование ДНК-топоизомеразы I могут происходить независимо друг от друга. Чтобы определить, какая из ситуаций реализуется, мы проанализировали развитие фенотипа клеточного старения в ранне-S-фазных клетках HeLa в условиях пролонгированного ингибирования репликации с помощью химических агентов афидиколина или гидроксимочевины. При тепловом стрессе ингибирование репликации является кратковременным, и её перезапуск происходит уже спустя 30 минут после стресса (Рисунок 23).
Клетки HeLa, синхронизированные по ранней S-фазе, инкубировали в среде с добавлением EdU (10 мкМ, 30 минут), подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) и инкубировали в среде с BrdU (100 мкМ, 30 минут) в течение 0.5, 1 или 3 часов. После фиксации EdU выявляли с помощью набора реагентов Click-iT EdU Imaging kit (красный), BrdU - с помощью специфических первичных антител (зеленый). Масштабная полоса - 3 мкм. С помощью химических ингибиторов, мы имели возможность продлить время репликативного блока на любой необходимый период. Для этого, клетки HeLa, синхронизированные по ранней S-фазе, подвергали тепловому стрессу, а затем инкубировали 2-3 часа в среде с афидиколином или гидроксимочевиной. Мы обнаружили, что пролонгирование с помощью афидиколина или гидроксимочевины ареста репликации ДНК, индуцированного тепловым стрессом, полностью предотвращает развитие фенотипа клеточного старения (Рисунок 24А). Аналогичные эксперименты показали, что клеточное старение, индуцированное камптотецином, также может быть полностью предотвращено посредством дополнительной обработки клеток ингибиторами репликации ДНК (Рисунок 24Б). Однако это происходит только тогда, когда репликация ДНК ингибируется непосредственно в момент обработки клеток камптотецином, но не после того.
Из описанных результатов следуют несколько важных выводов. Во-первых, тепловой стресс влияет на аппарат репликации ДНК и активность ДНК-топоизомеразы I независимо. Во-вторых, для развития фенотипа клеточного старения, индуцированного тепловым стрессом или камптотецином, необходимым фактором является активная репликация ДНК. Суммируя вышеизложенные выводы, а также принимая во внимание тот факт, что камптотецин и тепловой стресс оказывают схожее влияние на ДНК-топоизомеразу I, можно предполагать, что первичным индуктором клеточного старения в обоих случаях является столкновение вилок репликации с комплексами ДНК-топоизомеразы I с ДНК либо с ОЦР, возникшими в результате ингибирования ДНК 72
А. Клетки HeLa, синхронизированные по ранней S-фазе, подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут), афидиколина (АРН, 10 мкМ, 60 минут) или гидроксимочевины (HU, 10 мкМ, 60 минут) в соответствии со схемами, приведенными над микрофотографиями. После 48-часового периода восстановления клетки фиксировали и иммуноокрашивали антителами против Н2АХ (зеленый). ДНК окрашивали с помощью DAPI (синий).
Б. Клетки HeLa, синхронизированные по ранней S-фазе, подвергали действию камптотецина (СРТ, 0.1 мкМ, 60 минут) и/или афидиколина (АРН, 10 мкМ, 60 минут) в соответствии со схемами, приведенными над микрофотографиями. После 48-часового периода инкубации в свежей среде клетки фиксировали и иммуноокрашивали антителами против Н2АХ (зеленый). ДНК окрашивали с помощью DAPI (синий). Масштабная полоса - 25 мкм. топизомеразы I. Вследствие этого столкновения могут возникать сложнорепарируемые ДЦР.
Мы решили проверить наличие ДЦР и проанализировать возможную кинетику их образования в результате действия теплового стресса и камптотецина. Для решения поставленной задачи мы воспользовались методом нейтрального электрофореза одиночных клеток (метод ДНК-комет). Для оценки степени повреждения ДНК мы использовали один из измеряемых параметров - «момент хвоста» (tail moment, TM), равный произведению длины хвоста и процента ДНК в нем. Мы знали, что тепловой стресс и камптотецин индуцируют появление сигналов о повреждения ДНК только в клетках, находящихся в ранней S-фазе (Рисунки 14, 19Б). Поэтому для анализа кинетики образования ДЦР, использовали клетки HeLa, находящиеся только на стадии ранней S-фазы. После синхронизации, клетки подвергали действию теплового стресса или камптотецина, и продолжали культивировать в нормальных условиях от 0 до 6 часов. После этого клетки лизировали, заключали в легкоплавкую агарозу и проводили электрофорез (Рисунок 25А). Видно, что тепловой стресс приводит к образованию ДЦР только спустя три часа после стресса, в то время как при камптотецине ДЦР образуются сразу же после воздействия (Рисунок 25А). Поскольку кинетика образования ДЦР в случае теплового стресса идентична кинетике формирования персистирующих сингалов о повреждении ДНК в виде репарационных фокусов (H2AX, 53BP1, Rad51) (Рисунок 15), можно сделать вывод, что что возникающие персистирующие сигналы о повреждениях ДНК, вызванные гипертермией, маркируют ДЦР.