Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
ВИЧ-инфекция, наряду с туберкулезом, холерой, чумой, вирусным гепатитами и сибирской язвой, принадлежит к группе наиболее опасных социально значимых инфекций, то есть «заболеваний, обусловленных преимущественно социально-экономическими условиями, приносящих ущерб обществу и требующих социальной защиты человека»…" [Постановление Правительства РФ N 715, 2004].
Глобальный масштаб эпидемии ВИЧ-инфекции очевиден для всего мирового сообщества. Только в странах СНГ, по данным UNAIDS (), в 2016 году было зарегистрировано 1 502 400 ВИЧ-инфицированных.
Одним из серьезных препятствий, ограничивающих потенциальный успех терапии ВИЧ-инфекции, является феномен лекарственной устойчивости, при котором вирус приобретает мутации в составе генома, которые влияют на его чувствительность к лекарствам. Слежение за лекарственно-устойчивыми вирусами и связанный с ним молекулярный мониторинг ВИЧ-инфекции становятся первоочередной задачей ученых всего мира.
Начало масштабной эпидемии в большинстве стран СНГ, таких как
Россия, Украина, Казахстан, Белоруссия, Киргизия, датируется 1995-1998
годами, когда ВИЧ-1 проник в среду наркоманов, употребляющих
психоактивные препараты внутривенно. Уже в первые годы эпидемии в России
были начаты работы по молекулярному мониторингу ВИЧ, при этом быстро
было установлено, что эпидемия носит уникальный характер, поскольку
вызвана практически единственным случаем заражения вирусом подтипа A
(IDU-A), распространившимся в очень короткие сроки по всем регионам
страны и практически не испытавшим при этом генетических преобразований
[Бобков, 2003; Бобков, 2002; Бобков, 1999; Bobkov, 1997; Бобков, 1997; Бобков,
2003; Bobkov, 2004; Bobkova, 2013]. Генетическая однородность эпидемии
ВИЧ-инфекции сохранялась в течение по крайней мере первых десяти лет, и лишь после этого постепенно картина стала меняться в направлении повышения разнообразия вируса [Kazennova, 2014; Kazennova, 2017; Bobkova, 2013; Gashnikova, 2017].
В большинстве стран СНГ, за исключением Беларуси, исследования по молекулярному мониторингу эпидемии ВИЧ-инфекции либо проводились нерегулярно (Казахстан, Узбекистан), либо вообще никогда не проводились (Киргизия, Армения, Таджикистан, Туркменистан). На момент начала данной работы во всех странах СНГ, где проводились эпизодические молекулярно-генетические исследования, обнаружено широкое распространение варианта IDU-A [Bobkov, 2004; Lazouskaya, 2005; Lukashov, 1998]. Помимо этого, в Узбекистане была распространена циркулирующая рекомбинантная форма CRF02_AG [Carr, 2005]. Последние исследования по генотипированию в Казахстане, проведенные в 2007 году, показали также продемонстрировали циркуляцию варианта CRF02_AG [Eyzaguirre, 2007].
Между странами СНГ сохраняются тесные культурные и экономические
связи, что позволяет предположить наличие широких возможностей для
перемещения генетических вариантов вируса между ними. Повышение доступности терапии во всех странах СНГ с очевидностью требует расширения работы по слежению за распространением вариантов ВИЧ, в том числе лекарственно-устойчивых.
В связи со всем вышеизложенным актуальность проведения настоящей работы не вызывала сомнений. Для изучения были выбраны три страны СНГ -Казахстан, где последние исследования вариантов ВИЧ проводились в 2007 году, а также Киргизия и Армения, в которых подобные исследования вообще ранее не проводились.
Цель исследования - охарактеризовать генетические подтипы и рекомбинантные формы ВИЧ-1, циркулирующие на территории Армении, Казахстана и Киргизии, включая лекарственно-устойчивые варианты.
Задачи исследования:
-
Собрать коллекции образцов, сопровождающиеся клинико-эпидемиологическими данными, от ВИЧ-инфицированных пациентов из Армении, Казахстана и Киргизии.
-
Выполнить анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов областей генов ВИЧ-1 gag, pol и env в коллекциях образцов вируса.
-
Провести молекулярно-эпидемиологический анализ вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Армении, Казахстане и Киргизии.
-
Провести анализ частоты встречаемости и характера передающихся мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ в Казахстане, Киргизии и Армении.
-
Охарактеризовать естественный генетический полиморфизм всех изученных вариантов ВИЧ-1.
Научная новизна
Впервые проведены исследования генетических вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Армении и Киргизии.
Продемонстрирована неоднородность географического распределения генетических вариантов ВИЧ-1 в Казахстане с преобладанием варианта IDU-A на севере и в центральной части страны и CRF02_AG - на юго-востоке.
Впервые показано, что в Киргизии циркулируют варианты IDU-A (40,4%) и CRF02_AG (43,8%), а также уникальные рекомбинантные формы (14%), образованные в результате рекомбинации указанных двух вариантов ВИЧ-1.
Впервые показано, что в Армении доминирует вариант IDU-A (92,3), а также высока доля X4-тропных вариантов ВИЧ-1 (51,9%).
Обнаружен низкий уровень распространенности передающихся мутаций лекарственной устойчивости к антиретровирусным препаратам среди ВИЧ-инфицированных пациентов в Казахстане (3%), Киргизии (7%) и Армении
(1,2%).
Теоретическая и практическая значимость работы
Международному сообществу ученых представлен генетический профиль вариантов ВИЧ в Армении и Киргизии, ранее никогда не описанный в литературе. Внесены значительные уточнения в информацию о циркуляции генетических вариантов ВИЧ-1 в Казахстане.
Все последовательности депонированы в международную базу генотипов GenBank.
Выявлены характеристические несинонимические мутации центрально-азиатского варианта CRF02AG (обратная транскриптаза, Р14К/Е) и его производного CRF6302A1 (протеаза, I64M).
Показано, что уровень распространенности мутаций лекарственной устойчивости среди «наивных» пациентов в исследованных странах не превышает 7%, что означает, что применяемые схемы терапии не нуждаются в коррекции, однако слежение за показателями лекарственной устойчивости требуется внедрить безотлагательно.
Методология и методы исследования
Методологическая основа диссертационной работы спланирована согласно поставленной цели исследования. Для решения поставленных задач на всех этапах исследования применяли современные молекулярные методы:
Метод «гнездового» ПЦР для получения нуклеотидных последовательностей генов gag, pol и env ВИЧ-1;
Метод популяционного секвенирования для определения нуклеотидных последовательностей;
Биоинформационные методы для генотипирования (определения
субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1), филогенетического анализа, анализа
рекомбинантных форм ВИЧ и поиска точек рекомбинации, для выявления
мутаций лекарственной устойчивости и анализа частоты их встречаемости в
популяции.
Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и
проведении экспериментов с использованием молекулярных и
биоинформационных методов. Отдельные этапы экспериментов и
биоинформационный анализ проводились совместно с д.б.н. Казенновой Е.В.,
к.б.н. Лаповком И.А., науч. сотр. Васильевым А.В., науч. сотр. Лебедевым А. В.
Диссертантом были подготовлены публикации, в том числе в англоязычной
литературе. Проведены обобщение и анализ полученных данных,
сформулированы научные положения работы и выводы.
Внедрение результатов исследования
Все исследования соответствовали плановым научным тематикам лаборатории вирусов лейкозов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ по теме Государственного задания «Изучение генетического разнообразия циркулирующих на территории России штаммов ВИЧ-1, изучение особенностей патогенеза ВИЧ-инфекции и разработка методов диагностики, лечения и профилактики ВИЧ-инфекции», а также выполнялись в рамках гранта МНТЦ «Генетический полиморфизм ВИЧ-1 в бывших республиках СССР» 2008-2010 гг. Результаты исследований вошли в отчеты по указанным темам.
Полученные нуклеотидные последовательности депонированы в
международную базу данных GenBank, а также в лабораторную базу данных генотипов ВИЧ-1. Специалисты в центрах СПИД в Казахстане, Киргизии и Армении информированы о частоте и характере встречаемости мутаций лекарственной устойчивости и циркулирующих вариантах ВИЧ-1 в их регионах.
Апробация работы
Результаты работы были доложены на российских и международных
конференциях, симпозиумах и съездах: «Молекулярная диагностика-2010», 24-7
26 ноября 2010 г., Москва, Россия (публикация); 13th European AIDS conference/EACS, Belgrad, Serbia, Oсtober 12-15, 2011 (постерный доклад); 17th International Bioinformatics Workshop on Virus Evolution and Molecular Epidemiology, Belgrad, Serbia, 27-31 August, 2012 (постерный доклад); 20th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, March 3-6, 2013, Atlanta, USA (постерный доклад); 11th European Meeting on HIV & Hepatit–s - Treatment Strategies & Antiviral Drug Resistance 20-22 March, 2013, Rome, Italy (постерный доклад); 14th European AIDS conference/EACS, October 16-19, 2013, Brussels, Belgium (постерный доклад); 4-ая Конференция по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, 2014 (публикация); 5-ая Конференция по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, 23-25 марта 2016 (публикация); 15th European meeting on HIV & Hepatitis – treatment strategies & antiviral drug resistanse, 6-9 June, 2017, Rome, Italy (постерный доклад).
В завершенном виде работа была апробирована и рекомендована к защите на заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по проблеме «Общая вирусология и молекулярная биология» 21 сентября 2017 года.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 19 статей, в том числе 14 статей в российских журналах, рекомендованных ВАК, и 5 статей в зарубежной печати.
Структура и объем диссертации