Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы на территории России стремительно увеличивается аболеваемость населения, обусловленная РНК-содержащими вирусами. 'НК-содержащие вирусы обладают высокой скоростью изменчивости, что атрудняет использование для их диагностики и идентификации обычных іетодов иммуноанализа. Отсутствие знаний о штаммовых различиях виру-а не позволяет на научной основе разрабатывать необходимые вакцинные лекарственные препараты для борьбы с этими эпидемиологически опас-ыми инфекциями.
РНК-содержащий вирус был причиной вспышки острого инфекционно-о заболевания у байкальских тюленей в 1987-88 годах, которая привела к ибели более 6500 животных из общего числа 80-100 тысяч. Молекулярно-иологическое изучение новых морбилливирусов представляет особый интерес, поскольку это не только расширяет существующие знания относительно азнообразия циркулирующих в природе вирусов, но и раскрывает нското->ые возможные молекулярные механизмы неожиданной смены хозяина, об-аруженной практически одновременно в нескольких местах (Балтийском, Средиземном и Северном морях). Относительно низкий риск заражения ис-ледователя этим вирусом делает его хорошей моделью для отработки мето-ов исследования морбилливирусов, один из представителей которых, вирус ори, является патогенным для человека.
Вирус клещевого энцефалита, в отличие от морбилливируса байкальс-ой нерпы, известен давно. Вызываемый этим вирусом клещевой энцефалит вляется наиболее тяжелой и распространенной природно-очаговой инфек-;ией на территории России. Несмотря на 60-летний опыт изучения и борьбы с тим заболеванием, разработкой и практическим применением нескольких околений профилактических вакцин, заболеваемость КЭ в стране неуклон-:о растет. Особенно неблагоприятно ситуация складывается в азиатской час-и России. В то же время существует проблема эффективности препаратов для акцинации и экстренной профилактики, которая обусловлена высокой из-іеичнвостью вируса и отсутствием знаний о штаммовом составе вируса, цир-улирующего в настоящее время.
Учитывая высокую точность и информативность методов молекуляр-ой биологии для понимания генетической структуры региональных при-одных популяций вируса КЭ и для анализа фундаментальных вопросов го эволюции, мы посчитали актуальным изучить молскулярно-эпидемио-огические особенности КЭ на территории бывшего Советского Союза. Ірименение современных методов молекулярной вирусологии, таких как юлекулярная гибридизация нуклеиновых кислот с различными высоко-
специфичными зондами и определение структуры генома вируса важно также для решения практических задач, направленных на совершенствование прогноза эпидситуации, диагностики, профилактики и лечения различных инфекций.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилась разработка методических подходов для решения вопросов идентификации и молекулярно-эпидемиологической характеристики на примере двух РНК-содержащих вирусов: морбилливиру-са байкальской нерпы и вируса клещевого энцефалита.
Для этого необходимо было последовательно решить следующие задачи:
-
Подобрать структуры олигонуклеотидных зондов для определения наличия вирусоспецифических РНК в образцах тканей павших и больных животных на основании сравнения опубликованных нуклеотидных последовательностей известных морбилливирусов кори и CDV.
-
Показать наличие как вирионной, так и матричных морбилливирус-ных РНК в тканях павших и больных животных, используя метод гибридизации.
-
Определить по результатам гибридизации наиболее консервативные участки генома морбилливирусов, пригодные для использования в качестве универсальных праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) при массовой диагностике морбилливирусных инфекций. Оптимизировать условия экспресс-диагностики морбилливирусных инфекций методом ПЦР, с использованием образцов тканей, минуя этап культивирования вируса.
-
Определить нуклеотидные последовательности генов Р и Н изолята вируса байкальской нерпы и сравнить полученные последовательности с аналогичными структурами других морбилливирусов.
-
Определить таксономическое положение вируса байкальской нерпы среди других морбилливирусов.
-
Исследовать популяцию байкальской нерпы на наличие в ней морбилливирусов через 10 лет после вспышки 1987/88 гг.
-
Определить структуру фрагмента гена Е вируса КЭ и определить таксономическое положение и генетическую принадлежность вариантов вируса, циркулирующих на территории России.
-
Изучить на основе гибридизационного анализа гетерогенность и географическое распространение генетических вариантов вируса КЭ.
-
Адаптировать методы кластерного анализа для характеристики генетических различий штаммов вируса КЭ на базе данных гибридизационных тестов и выявить гетерогенность региональных вирусных популяций.
10. Оценить возможность корреляции вирулентности вируса КЭ и его
спектра гибридизации с олигонуклеотидными зондами.
I Научная новизна работы
Впервые методами молекулярной биологии, включающими гибриди-іацию с олигонуклеотидными зондами, амплификацию с использованием по-тимеразной цепной реакции выбранных участков генома вирусов, клонирование и последующее определение нуклеотидной последовательности Полуниных фрагментов был обнаружен новый, ранее неизвестный вирус, вызвав-лий эпизоотию байкальской нерпы.
В результате анализа нуклеотидных последовательностей однозначно /становлено, что вспышка болезни на Байкале была вызвана вариантом вируса чумы плотоядных, который отличается от других, циркулирующих в лрироде штаммов CDV.
Показано существенное отличие вируса байкальской нерпы от мор-эилливирусов других морских млекопитающих, как ластоногих, так и китообразных.
Продемонстрировано, что морбилливирус байкальской нерпы продолжает циркулировать в популяции, причем циркулирует как минимум два варианта вируса различной вирулентности.
Впервые на репрезентативном материале получены детальные сведе-іия об основных генотипах вируса клещевого энцефалита, их генетическом разнообразии и географическом распространении в различных физико-географических регионах России.
Впервые показано, что на территории России в основном циркулирует ?ирус клещевого энцефалита третьего генотипа, в то время как вирусы первого и второго генотипов встречаются мозаично.
Так, вирус дальневосточного (первого) генотипа имеется во всех, кроле трех, исследуемых регионах от Сахалина до Калининграда. Вирус цент-зально-европейского (второго) генотипа циркулирует на западе России и его іреал распространяется до Урала и Алтая.
Впервые высказано предположение, что высокой вирулентностью об-іадают не только штаммы вируса клещевого энцефалита дальневосточного "енотипа, но и ряд штаммов вируса второго и третьего генотипов. Высокая шрулентность вариантов вируса связана, по-видимому, со структурой белка 4S2b.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные в результате работы нуклеотидные последовательности двух енов вируса байкальских тюленей и ряда других изолятов CDV значительно расширяют существующие представления о разнообразии вирусов чумы плотоядных, циркулирующих в природе. В распоряжении исследователей оказался юполнительный материал для изучения различий между вирусами на генети-іеском уровне, для анализа вирусных белков и определения значения измене-іий в структуре генов и белков.
В ходе изучения вируса байкальской нерпы разработан и синтезирован ряд морбилливирусных праимеров для выявления и тонкого анализа любой морбилливирусной инфекции с помощью метода полимеразной цепной реакции. Отработанные методики позволяют быстро, без применения трудоёмкой стадии культивирования вируса подтвердить или опровергнуть наличие морбилливирусной инфекции, а в сочетании с методами секвенирования определить принадлежность выявленного вируса к тому или иному виду мор-билливируса и показать его отличие от других близких ему вирусов. Полученные результаты показывают, что данный подход оказался достаточно эффективным для этих целей. Разработанная методика с набором "универсальных морбилливирусных праимеров" может без изменений применяться при анализе вируса кори и других морбилливирусов.
Достоверное доказательство о превалировании на территории России вируса КЭ третьего генотипа не только расширяет наши представления о путях эволюции вируса, но и ставит вопросы о необходимости разработки новых коммерческих препаратов для диагностики, профилактики и лечения клещевого энцефалита.
Показанные выраженные отличия в частоте встречаемости основных генотипов вируса КЭ на различных территориях требуют от эпидемиологических служб разработать региональные схемы диагностики и профилактики КЭ.
Разработанный патогенетический подход к анализу вирусной популяции применим для оценки эпидситуации в регионах с целью профилактики и диагностики заболевания. Предложенный метод графического отображения спектра гибридизации вирусной РНК совместно с патогенетическим подходом целесообразно использовать при генотипировании вируса гепатита С с целью выявления путей его распространения.
Предположение о связи вирулентности вируса клещевого энцефалита со структурой гена белка NS2b ставит перед исследователями новые задачи изучения структуры функции и механизма действия белка, кодируемого этим геном.
На защиту выносятся следующие положения:
-
Эпизоотия в популяции байкальской нерпы в 1987-1988гг. вызвана морбилливирусом, который наиболее близок к вирусу чумы плотоядных и является его новым вариантом.
-
Вирус, поразивший популяцию байкальской нерпы, не являлся причиной эпизоотии обыкновенных и серых тюленей в Северной Европе.
-
Переход морбилливирусов к морским и пресноводным млекопитающим произошёл независимо в нескольких эволюционных линиях.
-
Коммерческие живые вакцины против вируса чумы плотоядных непричастны к заражению популяции байкальской нерпы.
-
На территории России выявлен высокий уровень генетической гете-югенности циркулирующих штаммов вируса клещевого энцефалита.
-
На территории России доминируют штаммы вируса КЭ третьего ге-ютипа.
-
Штаммы вируса КЭ дальневосточного (первого) генотипа в основном істречаются па Дальнем Востоке, но в тоже время имеются в большинстве ісследованньїх регионах от Калининграда до Сахалина.
-
Штаммы вируса КЭ центрально-европейского (второго) генотипа істречаются в западных областях России, а ареал их распространения дости--ает Урала и Алтая.
-
Среди вариантов вируса КЭ второго и третьего генотипа могут встре-тться высоковирулентные штаммы.
Внедрение в практику
Полученные нуклеотидные последовательности генов М, N, Р и Н изу-іенньїх штаммов CDV, а также структуры фрагмента гена Е депонированы в международный компьютерный банк данных Genbank, а именно: AF2 59552, \F25955±, AF259550, AF259549, AF224667, AF224666, AF224665, , AF224663, AF241774, AF241773, AF241772, AF236055, , AF231806, AF229364, AF229363, AF229362, AF181446, , AF139490, AF139489, Х84998, Х84999, Х85000.
Получены следующие свидетельства на изобретения:
Беликов СИ., Горбунов Ю.А., Попов С.Г. Способ удаления тритиль-шх защитных групп с производных нуклеозидов, нуклеотидов и олигонукле->тидов //Авторское свидетельство № 828671. - 1981. - 5 с;
Беликов СИ., Рыбак В.К. Способ получения 4-1Ч-бензоил-2-дезокси-гитидина // Авторское свидетельство № 1266164. - 1986а. - 3 с;
Беликов СИ., Рыбак В.К., Озолс A.M., Стопникова М.Н., Зиемелис СМ. 5'-0-Тритолилметильные производные 2'-дезоксинуклеозидов в качестве входных веществ в синтезе олигонуклеотидов // Авторское свидетельство № 270153.-19866.-7 с;
Абрамова Л.М., Беликов СИ., Белова Н.В., Чекавая Н.И. Способ по-гучения олиготимидилатного производного целлюлозы // Авторское свиде--ельство №1438189.-1988.-4 с;
Кумарев В.П., Беликов СИ., Кобзев В.Ф., Кузнеделов К.Д., Баранова I.B., Средин Ю.Г. Способ синтеза олиго(поли)нуклеотидов и устройство для го осуществления//Авторское свидетельство № 1773916.- 1992. - 11 с.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертации были представлены на Международном симпо-иуме "Morbillivirus infections", Hannover, 1994; на второй Верещагинской іайкальской международной конференции, Иркутск, 1995; на юбилейной на-
учной конференции "Природно-очаговые болезни человека", Омск, 1996; на международной научной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами", Иркутск, 1996; на научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 1998; на первой международной конференции "Biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia", Новосибирск, 2000.
По материалам диссертации имеется 18 публикаций, включая 1 монографию и 5 авторских свидетельств.
Структура и объем работы
Предлагаемая диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы (219 отечественных и зарубежных источников). Объем работы составляет 234 страницы машинописного текста, включающего 13 таблиц и 37 рисунков.