Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 14
1.1 Основные этапы в исследовании вируса гриппа 14
1.2 Общие сведения о вирусе гриппа птиц
1.2.1 Таксономическая принадлежность, классификация и номенклатура. Природноочаговый характер вируса гриппа А 18
1.2.2 Строение вириона 19
1.2.3 Организация генома, изменчивость вируса 20
1.2.4 Дикие птицы как природный резервуар вируса гриппа птиц 23
1.2.5 Циркуляция вируса гриппа А среди млекопитающих 25
1.3 Вирус гриппа у водных млекопитающих 28
1.3.1 Грипп в популяциях морских млекопитающих 33
1.4 Вирус гриппа околоводных млекопитающих 45
1.5 Экологические особенности территории юга Западной Сибири и роль данного региона в циркуляции вируса гриппа А 46
1.6 Экологические особенности Каспийского региона и роль данного региона в циркуляции вируса гриппа А 48
1.7 Заключение по обзору литературы 51
2. Собственные исследования 54
2.1 Материалы и методы 54
2.2 Сбор и хранение биологических образцов 54
2.3 Выделение и размножение вирусов из биологического материала в системе РКЭ 55
2.4 Создание коллекции штаммов вируса гриппа 56
2.4.1 Наработка пулов штаммов 56
2.4.2 Лиофилизация штаммов вируса гриппа 56
2.5 Изучение молекулярно-биологических и патогенных свойств штаммов вируса гриппа А 57
2.5.1 Вирус 57
2.5.2 Экспериментальные животные 57
2.5.3 IVPI тест 58
2.5.4 Схемы экспериментов на мышах 59
2.5.5 Вирусологические методы исследования 60
2.5.5.1 Изучение способности вируса к репродукции на РКЭ 60
2.5.5.2 Изучение способности вируса к репродукции на культуре клеток 61
2.5.6 Молекулярно-биологические методы исследования 61
2.5.6.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 61
2.5.6.1.1 Выделение РНК 61
2.5.6.1.2 Реакция обратной транскрипции 62
2.5.6.1.3 ГЩР-амплификация в режиме реального времени и детекция продуктов амплификации 62 2.5.6.2 Секвенирование генома 63
2.5.6.3 Филогенетический и аминокислотный анализ 64
2.5.7 Серологические методы исследования 65
2.4.7.1 Реакция гемагглютинации и торможения гемагглютинации 65
2.5.8 Гистологические методы исследования 66
2.5.8.1 Световая микроскопия 66
2.5.8.2 Иммуногистохимический анализ 67
2.5.9 Статистический анализ 67
3 Результаты собственных исследований 68
3.1 Исследование вируса гриппа в популяции ондатр на Чановской озерной системы, Новосибирская область 69
3.1.1 Выделение вируса гриппа птиц А от ондатры в системе РКЭ 69
3.1.2 Изучение молекулярно-биологических свойств ВГП, выделенного от ондатры 71
3.1.2.1 Филогенетический анализ штамма A/muskrat/Russia/63/2014 (H2N2) 71
3.1.2.2. Оценка способности штамма A/muskrat/Russia/63/2014 (H2N2) к репродукции 75
3.1.2.3 Оценка патогенности штамма A/muskrat/Russia/63/2014 (H2N2) на модельных животных 75
3.2 Исследование вируса гриппа в популяции Каспийских тюленей, о. Малый Жемчужный, Каспийский регион 76
3.2.1 Выделение штамма вируса гриппа птиц от каспийских тюленей в системе РКЭ 76
3.2.2 Изучение молекулярно-биологических свойств ВГП, выделенных от каспийских тюленей в 2002 и 2012 гг. 77
3.2.2.1 Филогенетический анализ штаммов A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) и A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 78
3.2.2.2 Аминокислотный анализ штаммов A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) и A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 82
3.2.3 Оценка способности штамма A/Caspian seai ussia7i884/2002 4N6) к репродукции in vitro, in vivo 84
3.2.4 Анализ морфологических изменений в тканях экспериментальных животных при инфицировании штаммом вируса гриппа A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 86
3.2.4.1 Изменения ткани легкого в результате экспериментального инфицирования мышей 86
3.2.4.2Изменения структуры почки в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 92
3.2.4.3 Изменения ткани печени в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 95
3.2.4.4Изменения структур сердца в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 99
3.2.4.5 Изменения структур селезенки в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 100
3.2.4.6Изменения структур головного мозга в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/1884/2002(H4N6) 103
3.2.5 Оценка способности штамма A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6) к репродукции in vitro и in vivo 104
3.2.6 Анализ морфологических изменений в тканях экспериментальных животных при инфицировании штаммом вируса гриппа A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 106
3.2.6.1 Изменения ткани легкого в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 106
3.2.6.2 Изменения структур почки в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 112
3.2.6.3 Изменения структур печени в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 115
3.2.6.4Изменения структур сердца в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 117
3.2.6.5 Изменения структур селезенки в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6) 118
3.2.6.6 Изменения структур головного мозга в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/Tl/2012(H4N6) 120
4. Заключение 122
4.1 Выводы 133
Список литературы 135
Приложения 154
- Вирус гриппа у водных млекопитающих
- Выделение вируса гриппа птиц А от ондатры в системе РКЭ
- Изменения ткани легкого в результате экспериментального инфицирования мышей
- Изменения ткани легкого в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6)
Вирус гриппа у водных млекопитающих
Морские млекопитающие - это уникальная группа животных, частично или полностью перешедших к водному образу жизни. Традиционно к морским млекопитающим относят китообразных (Cetacea), сиреновых (Sirenia) и некоторых представителей отряда хищных (Carnivora) - настоящих и ушастых тюленей, моржа, калана и белого медведя [3]. Представители экологической группировки водных млекопитающих демонстрируют большую или меньшую связь с водными экосистемами и различной степени приспособленность к обитанию в водной среде.
Можно выделить несколько "уровней", характеризующихся различной степенью перехода от полностью наземных к полностью водным обитателям. На первом уровне находятся млекопитающие, ведущие, по сути, наземный образ жизни, но от типично наземных обитателей отличаются проживанием вблизи водоемов и наличием в их рационе достаточно большой доли водных животных или растений. Примером может послужить норка - этот хищник семейства куньих строит норы по берегам рек и озер, а питается околоводными грызунами, амфибиями и рыбой. Никаких видимых приспособлений к водной среде в строении или особенностях физиологии млекопитающие этой группы не выказывают.
Второй уровень характеризуется: наличием в рационе как наземных, так и водных животных или растений; обитанием как на суше, так и в водной среде; наличием морфологических адаптации к подобному образу жизни. Выдра из того же семейства куньих питается, в основном, рыбой, иногда амфибиями, на наземных обитателей практически не обращает внимания, от воды удаляется не более чем на 100-200 метров. Живет этот хищник в норах, которые, в отличие от нор норки, выход имеют под водой. Выдра имеет внешние признаки адаптации к водной среде: конечности у нее короткие, с соединенными перепонкой пальцами, шерсть густая, с редким остевым волосом и плотным подшерстком, уши укорочены. Подобным внешним обликом и образом жизни обладают и полуводные грызуны - бобры, ондатры, нутрии, которые питаются как наземной, так и водной растительностью, обитают в околоводных норах или хатках, часто используют водоемы как убежище от хищников, а также имеют сильно развитые сальные железы, своим секретом предохраняющие шерсть от намокания. Другой представитель куньих - калан - окончательно порывает с наземной средой и выход его на сушу связан с процессом размножения, сна или при сильном шторме. Большую часть жизни этот хищник проводит на поверхности воды, отплывая на несколько километров от берега; кормом калану служит рыба, моллюски, но преимущественно морские ежи; конечности имеет вроде ластов, с соединенными сплошной перепонкой пальцами, ушных же раковин не имеет вовсе.
К третьему уровню относятся хищные млекопитающие семейств тюленевых, ушастых тюленей и моржей, филогенетически связанных с медвежьими и куньими, что, в некотором роде, является отражением их ухода в море. Это полностью водные звери, на сушу (или на лед) выходящие для спаривания, размножения и линьки. Внешний облик этих хищников характеризуется вытянутой веретенообразной формой тела и конечностями в виде ласт, в которых пальцы соединяются сплошной перепонкой и внешне часто неразличимы. Ушастые тюлени (морские львы, котики) принадлежат к ветви, менее порвавшей с сухопутным образом жизни - обладают более или менее развитым шерстным покровом, ушными раковинами, а их задние конечности, хоть и сдвинуты к задней части туловища, все же могут использоваться для неуклюжего перемещения по суше. Настоящие же тюлени практически лишены волосяного покрова, в связи с чем функция теплоизоляции у них переходит к толстому слою подкожного жира; ушных раковин эти звери не имеют, а задние конечности служат им исключительно локомоторным органом при плавании; передвижение по суше возможно лишь при участии передних ласт, ползком и извиваясь, подобно змеям. Помимо морфологических особенностей, все вышеперечисленные водные звери обладают и физиологическими приспособлениями к водной среде, выраженными, в частности, в способности долгое время находиться под водой, задерживая дыхание. Такая способность обеспечивается рядом факторов: во-первых, повышенной кислородной емкостью крови, во-вторых, серьезным замедлением кровотока при нахождении в воде.У тюленя, к примеру, при нахождении на суше сердце сокращается 150 раз в минуту, тогда как при нырянии и плавании - всего 30. Благодаря такой особенности, а также зо отключению во время ныряния от кровообращения многих органов (за исключением мозга и сердца) достигается гораздо более низкое, чем на суше, потребление кислорода.
Последний, четвертый уровень характеризуется полным отрывом от наземной среды и возвращением в воду. Эти млекопитающие (киты, дельфины, кашалоты) всю жизнь проводя в море. Передвигаться по суше они, соответственно, не способны; тело их приобретает обтекаемую форму, подобно телу рыб, передние конечности становятся похожими на рыбьи плавники, задние - исчезают вовсе, оставшись у некоторых лишь в виде пары сильно редуцированных косточек тазового пояса. Хвост у этих млекопитающих приобретает горизонтально расположенные лопасти, чем напоминает хвостовой плавник рыб, а шерстный покров и ушные раковины полностью исчезают. У этих животных увеличивается кислородная емкость крови и уменьшается чувствительность различных органов к кислородному голоданию, легкие получают способность к быстрому сжатию и расширению для быстрой и полной замены в них воздуха во время короткого вдоха-выдоха, а ноздри перемещаются на верхнюю сторону головы, что позволяет дышать без изгибания шеи. При нахождении в воде ноздри плотно закрываются клапанами, а устройство гортани полностью изолирует воздухоносные пути от пищевых, поэтому, нахождение во рту воды или пищи никак не препятствует процессу дыхания.
Интерес к морским млекопитающим постоянно растет, и не только как к объектам научных исследований. Меняется отношение к ним в обществе, и все больше людей начинают понимать, что морские млекопитающие - это не просто необычные животные, которых можно использовать для развлечений Контакт морских млекопитающих с дикими птицами на лежбищах или во время приема пищи из общего источника, например, рыба или криль, может способствовать межвидовой передачи вирусов гриппа птиц (ВГП) из естественного резервуара новому хозяину (Рисунок 2). Морские млекопитающие являются важнейшими звеньями экосистем озер, морей и океанов.
Выделение вируса гриппа птиц А от ондатры в системе РКЭ
Выделение ВГП из собранного от ондатр материала проводили на куриных эмбрионах (КЭ) путем проведения трех последовательных пассажей, согласно рекомендованной методике [150].
/ пассаж. Во время проведения первого пассажа, КЭ, зараженные образцами, оставались живыми в продолжение всего периода инкубации. При вскрытии КЭ ни в одном случае не наблюдалось бактериального заражения.
Тестирование образцов аллантоисной жидкости (а.ж.) первого пассажа в реакции гемагглютинации (РГА) показало наличие гемагглютинирующих агентов в образце а.ж. пробы №17 (полевой номер - 63). Образец а.ж. с выявленной гемагглютининрующей активностью был взят для тестирования на наличие в нем вируса гриппа А молекулярно-биологическими методами; остальные образцы а.ж. были взяты для второго пассажа.
II пассаж. Во время проведения второго пассажа не было КЭ, погибших в течение первых 12 часов после заражения. Это свидетельствовало, что заражение КЭ прошло без травм, приводящих к их гибели [12]. Все КЭ оставались живыми и течение всего последующего периода инкубации.
Тестирование образцов а.ж. второго пассажа в РГА показало отсутствие гемагглютинирующих агентов во всех образцах. Поэтому все образцы а.ж. второго пассажа были взяты для проведения третьего пассажа.
/// пассаж. Во время проведения третьего пассажа не было КЭ, погибших в течение первых 12 часов после заражения. Это свидетельствовало, что заражение КЭ прошло без травм, приводящих к их гибели [12]. Все КЭ оставались живыми и течение всего последующего периода инкубации.
Тестирование образцов а.ж. третьего пассажа в РГА показало отсутствие гемагглютинирующих агентов во всех тестируемых пробах. На этом основании был сделан вывод об отсутствии ВГП в данных образцах а.ж. и, следовательно, в соответствующих мазках от ондатр.
Детектирование наличия вируса гриппа А в образце а.ж. с выявленной гемагглютининрующей активностью проходило путем постановки реал-тайм ПЦР по описанной методике.
При изучении биологического материала, собранного от ондатр в 2015 году, ни одного изолята ВГП выделено не было.
После подтверждения наличия вируса гриппа А в выделенном от ондатры назальном мазке, концентрированный лиофильно высушенный материал был отправлен в Государственное учреждение «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д. И. Ивановского Российской академии медицинских наук» (НИИВ), г. Москва, для секвенирования и определения серотипа (см. гл. «Материалы и методы» п. 2.5.2). В результате секвенирования, для проведения генетического и филогенетического анализа штамма A/muscrat/Russia/63/2014 (H2N2) были получены все восемь сегментов генома вируса. Нуклеотидные последовательности были депонированы в международную базу данных GenBank под номерами: KR052701.1, KR052702.1, KR052703.1, KR052704.1, KR052705.1, KR052706.1, KR052707.1, KR052708.1.
Изменения ткани легкого в результате экспериментального инфицирования мышей
На третьи сутки инфекции в респираторном отделе легкого наблюдалась ярко выраженная сосудистая реакция. Крупные кровеносные сосуды выглядели запустевшими. Четко визуализировалось плазматическое пропитывание стенки кровеносных сосудов, периваскулярные отеки, отмечалась обширная инфильтрация лимфоцитарно-моноцитарного генеза в интерстицию. Регистрировалось разрастание соединительной ткани периваскулярно и периброхниально. Вмелких и средних бронхахнаблюдалась десквамация эпителия. В эпителиальной выстилке бронхов отмечалась дискомпозиция эпителиоцитов. В отдельных альвеолах скапливался жидкий экссудат с белками плазмы, в просветах часто встречались макрофагии геморрагии (Рисунок 6).
Таким образом, в сравнении с интактными животными (Рисунок 7), на третьи сутки после инфицирования развивались дистрофические изменения эпителиальной выстилки бронхиального дерева и легочных структур. Инфекционное заболевание, вызванное вирусом гриппа, распространялось, в нижние отделы респираторного тракта экспериментальных мышей.
К пятым суткам в тканях респираторного отдела легкогопроисходят диффузные измененияусиливая воспалительный процесс: выявлялись большие скопления макрофаговв интерстиции и просветах альвеолярных мешков, наблюдалсягемолиз эритроцитов в крупных кровеносных сосудах. Отчетливо были видны множественные очаги лейкоцитарной инфильтрации моноцитарно-лимфоцитарного генеза. Присутствовали точечные кровоизлияния в интерстиции, плазморрагии; отчетливо прослеживались участки ателиктаза легкого. В бронхах наблюдались значительные скопления детрита. Регистрировался стромальный отек органа.
Таким образом, на пятые сутки после инфицирования сохранялся воспалительный процесс в эпителиальной ткани легочного ацинуса и всего бронхиального дерева, который постепенно переходил в интерстициальную тканьлегкого с последующим развитием интерстициальной пневмонии. (Рисунок 8).
На седьмые сутки визуально воспалительный процесс усугублялся. Крупные легочные сосуды выглядели запустевшими; в бронхах визуально увеличивалось количество клеточного детрита, выявлялись обширные скопления клеток крови. В ткани легкого отчетливо определялись крупные очаги лимфоцитарно-моноцитарного инфильтрата. В интерстициальной ткани, окружающей воздухоносные пути и альвеолы, обнаруживались отёки и сливные некрозы. Наблюдалась гиперплазия пневмоцитов второго типа. Плазматическое пропитывание отмечали не только в стенках кровеносных сосудов, но также и в интерстиции легочного ацинуса, отмечались множественные геморрагии (Рисунок 9).
На десятые сутки сохранялись признаки интерстициальной пневмонии, однако, зоны ателектаза визуально уменьшались, а просветы респираторной части легкого выглядели очищенными от детрита и клеток крови (Рисунок 10). Наблюдалось уменьшение альвеолоцитов в состоянии гиперплазии, в сравнении с более ранними сроками.
Таким образом, через десять суток после заражения состояние ткани легкого в исследуемой группе свидетельствует об интерстициальной пневмонии у животных, однако площадь поражения сокращалась по сравнению с предыдущим сроком и появлялись признаки репарации, что в свою очередь может свидетельствовать о процессе выздоровления.
В тканях легкого мышей наличие вирусного антигена детектировалось методом иммунногистохимического анализа (Рисунок 11). В динамике заболевания маркер определяли в клетках различного генеза, включая макрофаги, альвеолоциты и клетки эпителия бронхиол. Визуально определяемое количество клеток с положительной окраской было максимальным на 5 сутки после инфицирования. При этом, интересным является тот факт, что на 10 сутки, по-прежнему, антиген визуализировался в отдельных эпителиоцитах бронхиол.
Изменения ткани легкого в результате экспериментального инфицирования мышей вирусом гриппа птиц А штаммом A/Caspian seal/Russia/T 1/2012(H4N6)
При инфицировании вирусом A(H4N6)T1 мышей линии BALB/c в тканях легкого наблюдались морфологические изменения уже на 3-й сутки. Так, была отмечена сосудистая реакция; визуализировались инфильтраты, преимущественно лейкоцитарно-моноцитарного генеза в периваскулярное и перибронхиальное пространство. В бронхиолах определялась незначительная десквамация эпителия слизистой оболочки (Рисунок 28).
На 5-е сутки течения инфекции количество инфильтрата визуально увеличивалось. Был отмечен сладж эритроцитов в мелких сосудах, который, в свою очередь, был причинойих окклюзии и повреждения сосудистой стенки с последующим кровоизлиянием в интерстицию. Вследствиегемолиза эритроцитов происходило накопление фибриновых масс. Отмечались эпителиоциты, находившиеся в состоянии сливных некрозов. В просветах воздухоносных путей и в интерстиции регистрировали большое количество макрофаговв активированном состоянии. В интерстициальной ткани, окружающей воздухоносные пути и альвеолы, были обнаружены отёки и сливные некрозы. Плазматическое пропитывание отмечали не только в стенках кровеносных сосудов, но также и в интерстиции. Периваскулярная строма и альвеолярные перегородки выглядели отёчными (Рисунок 29).
Седьмые сутки после инфицирования характеризовались развитием воспалительного процесса (Рисунок 30). В крупных и средних бронхах со стороны просвета регистрировали клеточный детрит и небольшое количество эритроцитов. Эпителиальный слой частично отслаивался от базальной мембраны. Ткань вокруг мелких бронхов и бронхиол была уплотнена за счет инфильтратов. В отдельных альвеолах скапливался жидкий экссудат с белками плазмы. Кроме того, в них обнаруживалось небольшое количество эритроцитов и единичные лимфоциты. По-прежнему, наблюдался значительный периваскулярный отек. В ткани легкого наряду с процессами деструкции наблюдали картины, свидетельствующие о текущих репаративных процессах, что подтверждалось наличием коллагеновых волокон в периваскулярном и перибронхиальном пространствах.
На десятые сутки после заражения в ткани лёгких экспериментально инфицированныхмышей картина воспалительных изменений былаярко выражена (Рисунок 31). На некоторых участках происходило резкое снижение воздушности альвеолярной ткани. В респираторной ткани легкого регистрировали периваскулярные геморрагии. В просвете альвеол наблюдались альвеолярные макрофаги и лимфоциты. В альвеолярной ткани, наряду с процессами деструкции, наблюдали картины, свидетельствующие о начале репаративных процессов, что подтверждалось наличием фибробластов и коллагеновых волокон. Регистрировалось уменьшение отёчности подслизистой основы. Просветы бронхов и некоторые участки альвеолярной ткани были свободными от детрита.
Таким образом, через десять суток после заражения состояние лёгочной ткани свидетельствует о развитии интерстициальнои пневмонии с течением инфекции. Воспаление, начавшееся в эпителиальной стенке бронхиального дерева, постепенно переходило в более глубокие отделы респираторной ткани.
Наличие вирусного антигена и его топологию детектировали методом иммуногистохимического анализа. В динамике заболевания маркер определяли, преимущественно в альвеолоцитахвторого порядка и эпителии бронхиол. Количество клеток с позитивной окраской было максимальным на 5 сутки (Рисунок 32). При этом, интересен тот факт, что даже на 10 сутки визуализировались инфицированные альвеолоциты и эпителиоциты (Рисунок 32d).