Введение к работе
Актуальность проблемы. Осенью 1987 г. на Байкале произошла
спышка острого инфекционного заболевания у байкальских тюленей
Phoca sibirica Gmel., байкальская нерпа), которая привела к гибели более
000 животных из общего числа 80-100 тысяч (Петров и др., 1992;
Іронин, Кабанов, 1992). Ранее эпизоотии у байкальских тюленей не
іегистрировались. Заболевание сопровождалось симптомами,
характерными для морбилливирусных инфекций (Бейм, 1988). В (екабре 1987 г. во время экспедиции на Малые Ушканьи острова было амечено, что из пяти собак, имевших тесный контакт с больными іерпами, три умерли с типичными признаками чумы плотоядных. На юновании опроса местных жителей (метеорологов) B.C.Колесник, отрудник Иркутского противочумного института Сибири и Дальнего востока, высказал предположение, что эпизоотия в популяции іайкальской нерпы вызвана вирусом чумы плотоядных.
Сыворотки крови больных нерп давали слабо положительный ответ ; реакции с антителами к вирусу кори (род Morbillivirus, семейство yaramyxoviridae). При радиоиммунометрии и при иммуноферментном нализе обнаруживались антитела к вирусу чумы плотоядных (CDV) у 0-80 % животных (Grachev et al, 1989).
Эти результаты, а также предварительные данные іатоморфологических исследований были обсуждены в ноябре 1988 г. на остоявшемся в Иркутске рабочем совещании и послужили основанием (ля того, чтобы считать CDV, или родственный ему вирус, наиболее іероятной причиной болезни нерпы. Обсуждались и возможные [сточники заболевания; так, одним из вероятных считали живые вакцины іротив CDV, используемые в пушном звероводстве в окресности озера >айкал.
К 1988 г. были описаны 4 вида рода Morbillivirus: вирус кори MV), чумы крупного рогатого скота (RPV, риндсрпест), чумы мелких квачных (PPRV) и чумы плотоядных (CDV). Данных о восприимчивости : морбилливирусам не только байкальских тюленей, но и других іредставителей отряда ластоногих, не было. Поэтому гипотеза о юрбилливирусной инфекции, как причине массовой гибели байкальской іерпьі, требовала серьёзного подтверждения, как и гипотеза о іричастности живых анти-CDV вакцин к заражению популяции. Кроме т>го, через шесть месяцев после массовой гибели байкальской нерпы, в треле 1988 г., эпизоотия охватила іюленей в Северном и Балтийском лорях. Наблюдался массовый падёж серых {Halichoerus gryphus) и )быкновенных {Phoca vitulind) тюленей. Европейскими учеными было
выдвинуто предположение о вирусе герпеса, как о причине эпизоотии (Osterhaus, 1988). Но уже предварительные серологические исследование убедительно показали, что животные поражены вирусом CDV илг близкородственным ему (Osterhaus, Vedder, 1988), а в 1989 г. антитела к вирусу чумы плотоядных или близкородственному ему вирусу был^ обнаружены у тюленей на побережье Гренландии (Dietz, 1989) Естественно возник вопрос о возможной взаимосвязи этих эпизоотии v путях заражения столь отдалённых друг от друга популяций.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась молекулярно-генетическая идентификация вируса, вызвавшего массовук гибель байкальской нерпы, определение его видовой принадлежности проверка гипотез о живых анти-CDV вакцинах, как о возможны? источниках инфекции и о связи эпизоотии байкальских и европейски? тюленей. Для этого необходимо было последовательно решил следующие задачи:
-
Подобрать структуры олигонуклеотидных зондов дл> определения присутствия вирусспецифических РНК в образцах тканег павших и больных животных на основании сравнения опубликованные нуклеотидных последовательностей известных морбилливирусої (Rozenblatt etal, 1985, Barrett etal, 1985, Bellini etal, 1986).
-
Показать наличие как вирионной, так и матричны> морбилливирусных РНК в тканях павших и больных животных используя метод гибридизации.
'"3. Определить по результатам гибридизации наиболее
консервативные участки генома морбилливирусов, пригодные дш
использования в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качестве
универсальных праймеров при массовой диагностике морбилливирусны?
инфекций. Оптимизировать условия экспресс - диагностик!
морбилливирусных инфекций методом ПЦР с использованием образцої тканей, минуя этап культивирования вируса.
-
Амплифицировать фрагменты генома морбилливирус; байкальской нерпы и других штаммов вируса чумы плотоядных, включая вакцинные штаммы. Клонировать и определить их нуклеотидігук последовательность.
-
Определить видовую принадлежность морбилливирус; байкальской нерпы и степень его родства с вакцинными штаммами CD\ и вирусом обыкновенных тюленей (PDV) на основе полученных в ход работы и имеющихся в литературе данных о нуклеотидны; последовательностях морбилливирусов.
Научная новизна и практическая значимость работы. В
іредставленной работе впервые молекулярно - биологическими методами
іьіло показано, что вирус чумы плотоядных может не только поражать
іредставителей отряда ластоногих, в частности, байкальскую нерпу
Phoca sibirica), но и являться причиной массовой гибели этих животных,
впервые для идентификации природной инфекции был использован
іетод полимеразной цепной реакции (ПЦР), отработаны методы
обработки собранного материала и выделения РНК, позволяющие в
:ратчайшие сроки идентифицировать инфекционный агент. Впервые
іьша разработана и предложена для использования в ПЦР-диагностике
[риродных морбилливирусных инфекций система универсальных
юрбилливирусных праймеров. Определены нуклеотидные
юследовательности фрагмента гена белка нуклеокапсида длиной 200 [уклеотидов для изолята вируса байкальской нерпы и реизолированного акцинного штамма и участка кодирующей области гена фосфопротеина (линой 380 нуклеотидов для изолятов CDV, полученных от хорька, обаки и байкальской нерпы, а так же для двух вакцинных штаммов и 'ПК, выделенной непосредственно из мозга павшей нерпы. Установлены шлогенетические связи вируса байкальской нерпы. Показано, что живые юммерческис вакцины, используемые в звероводстве, не были причиной пизоотии байкальской нерпы. Показано отсутствие близкой связи между трусом байкальской нерпы и PDV.
Использованные в работе методы позволяют в относительно :ороткий срок показать наличие активно размножающегося вируса в рганизме животного, а потому являются перспективными для быстрой [иагностики морбилливирусной инфекции в природных популяциях и югут быть полезны при мониторинговых исследованиях ластоногих.
Основные положепня, выносимые на защиту. . Эпизоотия в популяции байкальской нерпы в 1987-1988гг. вызвана
морбилливирусом. '.. Морбилливирус, вызвавший эпизоотию у байкальской нерпы, является
вирусом чумы плотоядных. I. Коммерческие живые вакцины против вируса чумы плотоядных
непричастны к заражению популяции байкальской нерпы. \. Вирус, поразивший популяцию байкальской нерпы, не был причиной
эпизоотии у обыкновенных и серых тюленей в Северной Европе.
Внедрение в практику. Материалы исследований используются в 'чебном процессе при подготовке студентов-биологов в Иркутском
Государственном Университете в циклах "Молекулярная вирусология" ^ "Частная вирусология".
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации бьші представлены на Международном симпозиуме "Morbillivirus infections' (Hannover, 1994). По материалам диссертации опубликовано 6 статей.
Структура и объем работы. Предлагаемая диссертационная работе состоит из введения, обзора литературы (две главы), 3-х глаї собственных исследований, заключения, выводов и спиекг использованной литературы (26 отечественных и 127 зарубежны? источников). Обьем работы составляет 107 страниц машинописноп текста, включающего 5 таблиц и 13 рисунков.