Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирус клещевого энцефалита (вКЭ) относится к семейству Flaviviridae, включающему около 70 классифицированных членов, многие из которых имеют важное эпидемиологическое значение (Westaway, 1985). С современных позиций, вКЭ является широко распространенным политипическим видом, которому свойственна значительная географическая и внутрипопуляционная изменчивость по ряду антигенных и биологических признаков (Львов, 1989). Начатые в 90-х годах исследования в области молекулярной эпидемиологии и генетической дифференциации штаммов вКЭ (Шаманин, 1990; Злобин, 1990, 1992, 1996; Погодина, 1992) подтверждают представление о внутривидовой гетерогенности этого вируса.
Территория Приморского края является эндемичным регионом, где ежегодно клещевым энцефалитом (КЭ) заболевает от 30 до 200 и более человек. Летальность у заболевших КЭ в разные годы составляет от 20 до 35%, что определяет характерные особенности в этиологии, эпидемиологии и клинике этой инфекции на Дальнем Востоке (Леонова, 1987-1997). В этой связи, изучение молекулярной характеристики изолятов вКЭ представляет значительный научный и практический интерес для оценки эпидемической опасности, связанной с циркуляцией разных по вирулентности штаммов на территории Приморского края.
Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с применением олигонуклеотидных зондов является высокоспецифичным, способным выявлять тонкие штаммовые различия в вирусном геноме (Wallace, 1979; Kerschner, 1986; Shamanin, 1990). Данный метод надежно зарекомендовал себя для идентификации и детекции штаммов вКЭ (Злобин, 1990, 1992; Дрокин, 1993). С помощью этого метода установлена выраженная генетическая вариабельность штаммов вКЭ, выделенных из иксодовых клещей на территории различных эпидемических районов от Приморского края (на востоке) до Западной Украины и Калининградской области (на западе) (Злобин, 1996). При этом практически не исследовались штаммы, изолированные от больных людей, а также от лиц с инаппарантной формой инфекции КЭ. Кроме того, проведенные с помощью этого метода единичные исследования (Леонова, 1992; Злобин, 1992) штаммов вКЭ, изолированных на территории Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона, не позволили получить полное представление о молекулярной структуре
региональной вирусной популяции.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось определение молекулярно-генетической характеристики штаммов вКЭ Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона при использовании синтетических дезоксиолигонуклеотидных зондов, а также сравнительное изучение репродукции некоторых штаммов и ответной реакции клетки-хозяина на вирусную инфекцию in vivo и in vitro.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
-
Получить данные по молекулярно-генетической характеристике штаммов вКЭ с помощью синтетических дезоксиолигонуклеотидных зондов.
-
Дать оценку специфичности гибридизации используемого в работе набора зондов относительно популяции вКЭ Южно-Сихотэ-Алиньского природного очага.
3. Изучить генетическую вариабельность штаммов вКЭ региональной
вирусной популяции.
4. Провести сравнительный анализ молекулярно-генетической
характеристики штаммов, изолированных от больных КЭ и от клинически
здоровых лиц с присасыванием клеща.
5. Изучить в сравнительном плане репродукцию штаммов вКЭ, имеющих
различные молекулярно-генегические характеристики, на разных моделях
культивирования in vivo и in vitro.
6. Выяснить характер механизма цитопатического действия вКЭ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Гетерогенность региональной вирусной популяции на основе
молекулярно-генетической характеристики штаммов вКЭ.
-
Генетические варианты и патогенотипы как отражение молекулярной структуры вирусной популяции КЭ.
-
Особенности репродуктивного цикла разных штаммов вКЭ и ответной реакции клетки-хозяина на вирусную инфекцию.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые получены данные о молекулярной структуре вирусной популяции Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона на основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот при использовании набора дезоксиолигонуклеотидных зондов, комплементарных геному штамма Софьин.
Показана выраженная генетическая вариабельность изученных штаммов вКЭ. Выявлено несколько уровней специфичности зондов, на основе которых получены пять генетических вариантов вКЭ. Исходя из результатов гибридизации дезоксиолигонуклеотидных зондов с РНК штаммов, выделенных от людей, установлены критерии для патогенетической дифференциации региональных штаммов вКЭ. Показано распространение выделенных нами патогенотипов вКЭ на территории Приморского края. Данные результаты служат основой для дальнейших исследований по определению нуклеотидных последовательностей, обусловливающих вирулентные свойства штаммов вКЭ. Полученные результаты по дифференциации штаммов на патогенотипы могут быть использованы для разработки новых подходов для ранней клинической диагностики разных форм проявлений инфекционного процесса КЗ.
Проведено сравнительное изучение динамики размножения региональных штаммов на разных моделях культивирования, что позволило выявить индивидуальные особенности репродукции штаммов вКЭ, имеющігх разные молекулярно-генетические характеристики. Впервые установлено, что ответной острой реакцией клетки-хозяина на вирусную инфекцию КЭ является запрограммированная гибель клетки или явление апоптоза, известное при других вирусных инфекциях. Дальнейшие целенаправленные исследования по выяснению молекулярных основ патогенносте вКЭ, а также механизма вирусиндуцированной запрограммированной гибели клеток-мишеней может стать основой для разработки новых подходов к лечению этой тяжелой нейроинфекции. Апробация полученных результатов и практической ценности. Основные положения диссертационной работы обсуждались на:
Международной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами" (г. Иркутск, 1996);
Юбилейном заседании, посвященном 60-летию открытия вируса клещевого энцефалита на Дальнем Востоке (Владивосток, 1997);
Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследование в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 1997). Апробация работы состоялась 30 апреля 1998 г. на совместном Ученом Совете НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН и Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.
Структура и объем диссертации. Текст диссертации изложен на /% страницах с 21 рисунком и 13 таблицами. Диссертационная работа состоит из введения, 8 глав (3 главы обзора литературы, 5 глав собственных исследований), заключения и выводов. Библиографический указатель содержит 30 отечественных и 158 зарубежных источников литературы.