Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. История открытия бокавирусов 10
1.2. Таксономия семейства Parvoviridae 11
1.3. Организация генома HBoV 13
1.4. Свойства и функции белков парвовирусов 15
1.5. Структура вириона бокавирусов человека 19
1.6. Репликация HBoV 23
1.7. Транскриптом парвовирусов 28
1.8. Жизненный цикл HBoV 30
1.9. Генетическая дивергенция бокавирусов человека
1.10. Патогенез бокавирусной инфекции 33
1.11. Персистенция бокавирусов в организме человека 34
1.12. Пути передачи бокавирусов человека 35
1.13. Лечение и профилактика HBoV инфекции 35
1.14. Диагностика бокавирусной инфекции 37
1.15. Эпидемиология бокавирусной инфекции 38
1.16. Заключение 43
ГЛАВА 2. Пациенты, материалы и методы 45
2.1. Основная характеристика обследованных больных 45
2.2. Материалы 46
2.3. Основные методы
2.3.1. Сбор образцов 47
2.3.2. Осветление экстракта фекалий 47
2.3.3. Выделение вирусной ДНК 47
2.3.4. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 48
2.3.5. Электрофоретический анализ образцов 49
2.3.6. Проведение полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «по конечной точке» 49
2.3.7. Очистка продуктов ПЦР 50
2.3.8. Постановка реакции Сэнгера 50
2.3.9. Очистка продуктов реакции Сэнгера
2.3.10. Филогенетический анализ 51
2.3.11. Статистический анализ 51
2.3.12. Анализ нуклеотидных последовательностей 52
2.3.13. Определение скорости молекулярой эволюции 53
ГЛАВА 3. Результаты 54
3.1. Исследование эпидемических особенностей бокавирусной инфекции человека в Новосибирске 54
3.2. Генотипирование изолятов бокавирусов, выявленных в Новосибирске 57
3.3. Секвенирование геномов изолятов бокавирусов, выявленных в Новосибирске 62
3.4. Анализ рекомбинационных событий в геномах HBoV 71
3.5. Оценка скорости молекулярной эволюции HBoV 74
3.6. Исследование особенностей репликации HBoV 80
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 92
Выводы 105
Список использованной литературы
- Организация генома HBoV
- Пути передачи бокавирусов человека
- Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
- Генотипирование изолятов бокавирусов, выявленных в Новосибирске
Организация генома HBoV
Неструктурный белок NS1, играет важнейшую роль в репликации ДНК парвовирусов [Christensen et al., 1995; Cotmore et al., 1995; Hsu et al., 2004; Nakashima et al, 2004; Morita et al., 2003]. Белок NS1 принадлежит к III суперсемейству геликаз, которые перемещаются по ДНК в направлении от 3 -к 5 -концу. Для геликаз этого суперсемейства характерно наличие четырех консервативных мотивов - А, В, В и С, которые образуют полость связывания нуклеозидтрифосфата, координационный сайт иона металла, ДНК-связывагощий сайт и сенсорный элемент. Эти мотивы расположены на участке протяженностью около 100 аминокислотных остатков в середине NS1. У парвовируса В19 этот белок участвует в активации промотора рб [Brown et al., 1994] и имеет положительный эффект обратной связи на активность промотора рб [Doerig et al., 1990]. Raab с коллегами [Raab et al., 2002] показали, что белок NS1 вируса В19 взаимодействует с промотором рб с помощью прямого ДНК-связывания с клеточными транскрипционными факторами Spl и Sp3. Неструктурный белок NS1 автономного парвовируса мельчайшего вируса мышей (MVMp), который взаимодействует с клеточными факторами транскрипции SP1, TFIIA (а/р) и TBP in vitro сильно транс-активирует промотор Р38 [Doerig et al., 1988; Gavin et al., 1990; Lorson et al., 1996; Lorson et al., 1998; Krady and Ward, 1995].
У HBoV белок NS1 связывается с левым и правым ориджинами репликации. Справа комплекс образуется хромосомальными белками человека (HMG), которые участвуют в процессах транскрипции, репликации, рекомбинации и репарации, и вирусным NS1; слева - белками, связывающими модулирующие элементы глюкокортикостероидных гормонов, и вирусным NS1. Распознавание ориджина репликации приводит к образованию цепь- и сайт-специфичных разрывов вирусной ДНК. Данный процесс требует затраты энергии - молекулы АТФ, для обеспечения прочного связывания и внесения разрыва. После внесения разрыва, NS1 остается ковалентно связанным с 5 -концом никированной ДНК, З -гидроксильная группа которой используется для синтеза дочерней цепи. Предполагают, что репликацию генома HBoV осуществляет ДНК-полимераза 5, которая обычно участвует в процессах эксцизионной репарации. Для репликации помимо вирусного белка NS1 также необходимы белки клетки-хозяина -PCNA (фактор процессивности ДНК-полимеразы 5) и RPA (репликативньтй белок А), связывающий одноцепочечную ДНК в эукариотических клетках. В процессе репликации белок NS1 действует как АТФ-зависимая геликаза, которая расплетает концевые шпилечные структуры вирусного генома. В дополнение к важной роли в репликации NS1 способен усиливать транскрипцию с вирусного промотора, может участвовать в упаковке ДНК в сформированные капсиды, а также отвечает за цитопатический эффект парвовирусов [Li et al., 2013].
Белок NP1 является антагонистом продукции интерферона-р\ модулируя путь сигнальной трансдукции, опосредуемый действием интерферон-регулирующего фактора -IRF-3. Интересно, что NP1 не ингибирует активацию IRF-3 и не запускает его деградацию, что, как правило, характерно для других вирусных антагонистов IRF-3. NP1 супрессирует продукцию интерферона по уникальному механизму: он взаимодействует с ДНК-связывающим доменом IRF-3 после его активации, что приводит к блокированию связывания IRF-3 с промотором гена, кодирующего интерферона-р. Это потенциальный механизм, с помощью которого HBoV противодействует врожденному иммунитету человека [Zhang etal.,2012]. Способность ингибировать продукцию интерферона-р показана для белков NP1 HBoVl, HBoV2 и HBoV3. В настоящее время выясняется, обладают ли такой способностью белки NP1 HBoV4 и бокавирусов животных. Несмотря на то, что NP1 блокирует продукцию интерферона-р, делеция гена, кодирующего этот белок, не приводит к потере этой способности репликативно-компетентным клоном HBoV, содержащим геном без концевых повторов, что означает, что другие белки HBoV могут ингибировать продукцию интерферона-р. В подтверждение этого, не так давно было показано, что неструктурный белок NS1, который высококонсервативен в семействе парвовирусов, также способен ингибировать продукцию интерферона-р, однако механизмы, которые лежат в основе этого процесса, до сих пор не выяснены [Zhang et al., 2012].
Помимо способности ингибировать продукцию интерферона-Р, белок NP1 ингибирует RLR-трансдукцию (передачу сигнала от внутриклеточного рецептора, отвечающего за распознавание вирусов системой врожденного иммунитета) и влияет на экспрессию VP2 [Zhang et al., 2012].
Два структурных белка VP1 и VP2, кодируемые ОРТЗ, расположенной на З -конце генома, имеют общий С-конец, но белок VP1 длиннее на 129 аминокислотных остатков [Allander et al., 2005; Chieochansm et al., 2007]. N-конец белка VP1 получил название VP1U (от англ. unique -уникальный). Домен VP1U белка VP1 HBoV обладает кальций-зависимой фосфолипазной (РЬАг) активностью, чувствительной к специфическим ингибиторам [Lupescu et al., 2006; Canaan et al., 2004; Suikkanen et al., 2003; Dorsch et al., 2002; Zadori et al., 2001; Girod et al., 2002]. Аминокислотные остатки 21 Pro, 41 His, 42Asp и 63Asp критичны для фосфолипазной активности VP1U HBoV (рисунок 3) [Zadori et al., 2001; Qu et al., 2008].
Пути передачи бокавирусов человека
Фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 0,6% GTG агарозе. ДНК наносили в модифицированном трис-ацетатном буфере (40 мМ трис, 0,1 мМ ЭДТА, 0,0014% уксусная кислота), содержащем 0,05% кристаллического фиолетового и 30% глицерина. Фрагмент геля, содержащий ДНК, вырезали, переносили на колонку, центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин.
Концентрацию очищенных продуктов ПЦР измеряли с использованием спектрофотометра SmartSpec Plus (Bio-Rad, СІЛА).
Постановка реакции Сэнгера Для постановки реакции Сэнгера в стерильную пробирку вносили 50 нг ампликона и 3,3 пмоль праймера, затем полученную смесь высушивали в вакуумном концентраторе Concentrator 5301 (Eppendorf, Германия) при 60С. В пробирку с сухим остатком вносили 1 мкл смеси "BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit" (Applied Biosystems, США), 6 мкл "BigDye Terminator 5X Sequencing Buffer" (Applied Biosystems, США) и 23 мкл бидистиллированной воды. Температурный профиль реакции имел следующий вид: 98С - 10 сек, 50С - 5 сек, 60С - 4 мин в течение 25 циклов, затем финальный прогрев при 98С в течение 3 мин и хранение при 20С.
Очистку продуктов реакции Сэнгера от невключившейся метки проводили с помощью гель-фильтрации через колонки с сорбентом Sephadex G50 superfine (GE Healthcare, Швеция). Для этого сорбент предварительно оставляли набухать в воде в течение 3 часов, из расчета 50 мг сорбента на одну реакцию в 1 мл бидистиллированной воды. Затем набухший сорбент в количестве 1 мл вносили в чистый корпус колонки и центрифугировали в течение 5 мин при угловом ускорении 900 g. После этого сорбент промывали 150 мкл бидистиллированой воды и центрифугировали в течение 5 мин при угловом ускорении 900 g. В центр столбика сформированного геля наносили всю реакционную смесь, помещали колонку в стерильную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировали в течение 5 мин при угловом ускорении 900 g. Очищенные продукты реакции Сэнгера высушивали в вакуумном концентраторе Concentrator 5301 (Eppendorf, Германия) при 60С. Высушенные продукты реакции Сэнгера на анализ передавали в Межинститутский Центр Секвенирования ДНК, откуда приходили результаты в виде секвенограмм, а также в ЛММБ ИХБФМ СО РАН м.н.с. к.б.н. Тикунову А. Ю.
Филогенетический анализ Филогенетический анализ проводили с использованием программных продуктов MEGA версия 5.03 [Tamura et al., 2013]. Филогенетические деревья строили методом объединения ближайших соседей с использованием перестановочного анализа статистической значимости сконструированного дерева по 500 репликам. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с ранее опубликованными выполняли с использованием сервера Национального центра биотехнологической информации (NCBI, США), включающего базы данных GenBank (США), EMBL (Европа) и DDBJ (Япония), с помощью алгоритма BLAST 2.2.24.
Для статистической обработки полученных данных использовались стандартные методы вариационной статистики программы Microsoft Excel. Статистическое оценивание данных эпидемиологического исследования проводилось согласно опубликованным рекомендациям [Armitage et al., 2002].
Сравнение частоты встречаемости HBoV инфекции среди опытной и контрольной групп проводили с использованием теста Хи-квадрат для таблиц 2x2 с поправкой Иеитса или, при необходимости, с использованием точного теста Фишера. Сравнение возрастного распределения HBoV инфекции среди детей с ОКИ проводили с использованием t-recra Стыодента. Значения р 0,05 считались значимыми.
Расчет отношения числа несинонимичных к числу синонимичных замещений (со) выполняли установлением попарного числа несинонимичных и синонимичных замещений, нормализованного к числу потенциальных участков. Затем определяли их отношения с помощью метода максимального правдоподобия в пакете программ Paml.
Анализ рекомбинации проводили с помощью программы GARD (Genetic Algorithms for Recombination Detection) [Pond and Frost, 2005], используя малый информационный критерий Акаики (c-AIC) [Sugiura, 1978] и тест Кишино-Хасегава (КН) [Kishino and Hasegawa, 1989]. Модель эволюции рассчитывали автоматически до поиска сайтов рекомбинации. Предсказанные точки картировали на стопке выровненных нуклеотидных последовательностей и для них установливали значения вероятностей. Полученные районы, свободные от рекомбинационных событий, дополнительно исследовали на наличие единичных точек рекомбинации методом SBP [Kosakovsky Pond and Frost, 2005]. Для каждого набора выровненных последовательностей была проведена проверка гипотезы молекулярных часов с помощью теста отношения правдоподобий [Huelsenbeck and Rarmala, 1997]. Вычисление генетической дивергенции (я) геномов проводили, используя программу DNAsp версия 4.10.9 [Librado and Rozas, 2009] в окне длиной 50 нуклеотидов, с шагом 10 нуклеотидов.
Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Ранее при изучении особенностей репликации HBoV были обнаружены структуры интермедиатов типа «голова к хвосту» у HBoVl, HBoV2 и HBoV3, porcine bocaviruses и canine bocavirus, при этом структуры типа «голова к голове» или «хвост к хвосту» у этих вирусов обнаружены не были, что могло свидетельствовать о механизме репликации бокавирусов, отличающимся от других парвовирусов [Cheung et al., 2010; Cheng et al., 2010; Kapoor et al., 2011; Liisebrink et al., 2011; Zhao et al., 2012; Huang et al., 2012]. Для изучения возможных механизмов репликации бокавирусов, включая HBoV4, репликационные интермедиаты которого не исследовались, мы попытались получить репликативные интермедиаты HBoV4 и других HBoV.
Для секвенирования концевых районов новосибирских изолятов HBoV4 и обнаружения возможных конкатомерных и эписомальных форм геномов вирусов мы использовали набор праймеров, рассчитанный на основе последовательностей новосибирских изолятов HBoV4 (таблица 6) и консервативный для всех генотипов HBoV. Прямые праймеры были рассчитаны на основе З -конца HBoV4, а обратные - 5 -концевой последовательности генома. Цифры в названии праймера соответствуют шагам гнездового ПЦР. Таблица 6. Праймеры, используемые для обнаружения предполагаемых промежуточных структур Праймеры Послсдователыюсти (5 —3 ) Первый раунд гнездовой ПЦР F1+ GGGTGACTGTAATCCCGAGCTCAT F1- ACGAATATTCAAGGAGAGGTTACCTGTT R1 + AGTCTGACGAGATGCGGAAGTGC R1- GGTCTCTACAAGTGAGCGGCCTCT Второй раунд гнездовой ПЦР F2+ GTGTTGCCGTCTCGAACCTAGC F2- TCCGATGTCAGGCTACCGTCAC R2+ TACGTCACTTCCTGGGCGTGTT R2- ATATATCCGATATACGAGTTACGACTAACC «+» - прямой праіімер; «-» - обратный праймер; «F» - последовательность праймера, соответствующая ориентации «голова»; «R» - последовательность праймера, соответствующая ориентации «хвост» Праймеры были проверены во всех возможных сочетаниях «голова»/«хвост» методом гнездовой ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК изолятов HBoV4 RUS-NSC11-N2655 и RUS-NSC11-N2657. В результате было показано, что ПЦР-продукт нарабатывается только при использовании праймеров F+/R+ на матрице RUS-NSC11-N2657, что соответствует кольцевой последовательности отрицательной полярности в ориентации «голова к хвосту» (рисунок 24). Все минорные фрагменты, полученные в ходе ПЦР, также были секвенированы. Обнаружено, что они образуются вследствие ошибочного праймирования и не содержат концевых последовательностей генома HBoV.
Дополнительно аналогично были проанализированы новосибирские изоляты других генотипов HBoV - HBoVl (RUS-NSC10-N1117), HBoV3 Рисунок 24. Пример продуктов гнездовойПЦРсо всеми возможными комбинациями пар праймерами. Стрелка указывает на фрагмент, который содержал последовательность HBoV4 «голова к хвосту» (RUS-NSC11-N2512) и два изолята HBoV2 (RUS-NSC10-N386 и RUS-NSC10-N751 с использованием вышеописанных праймеров (таблица 6). ПЦР-фрагменты, соотетствующие формам вирусного генома в ориентации «голова к голове» или «хвост к хвосту»для всех проанализированных изолятов выявлены не были. При использовании в ПЦР ДНК изолята HBoV2 RUS-NSC10-N386 и праймеров Б+Л1+(«голова»/«хвост») были обнаружены структуры, соответствующие форме с ориентацией «голова-к-хвосту» (данные не приводятся).
На следующем этапе ампликон, полученный на ДНК матрице изолята HBoV4 RUS-NSC11-N2657 и содержащий последовательность «голова к хвосту» (рисунок 24), был клонирован в pGEM вектор. Затем было проведено определение нуклеотиднои последовательности полученных клонов (рисунок 25). Полученные последовательности некодирующих районов вирусных геномов, включающие структуры «голова к хвосту» и имеющие длину 542 н., демонстрируют высокий уровень гомологии - 99, 2% (были обнаружены б нуклеотидных замен).
Аналогичным способом были получены рекомбинантные клоны, содержащие последовательности некодирующих районов эписомальной формы изолята HBoV2 RUS_NSC_10-N386. Нуклеотидные последовательности шести клонов №13, 21, 22, 23, 24 и 25 были секвенированьт. Протяженность полученных фрагментов составила 579 н. (рисунок 26). В случае клонов №13, 22 и 25 не было обнаружено различий в нуклеотидных последовательностях, в трех других клонах были выявлены единичные нуклеотидные замены (SNP), и уровень идентичности между ними варьировал от 99,1% до 99,6%.
При сравнении последовательностей некодирующих районов изолята HBoV2 RUSNSC10-N386 и ранее описанного для изолята HBoV2 BJQ435 [Zhao et al., 2012] можно отметить их значительные отличия. Уровень идентичности составил от 83,6 % до 83,9% (рисунок 26).
Для сравнительного изучения свойств концевых последовательностей HBoV было построено выравнивание некодирующих районов вирусных геномов двух изучаемых последовательностей клонов 10 и 13 изолята HBoV4 RUS-NSC11-N2657, а также последовательностей HBoVl, HBoV2, и HBoV3. (Последовательности концевых участков геномов других изолятов HBoV4, кроме определенных в данной работе, отсутствуют.) При филогентическом анализе можно заключить, что концевые некодируїощие районы генома исследуемого изолята HBoV4 RUS-NSC11-N2657, с высокой надежностью группируются с таковыми HBoV2 (рисунок 27).
Генотипирование изолятов бокавирусов, выявленных в Новосибирске
Бокавирусы, включая HBoV, являются мало изученными на сегодняшний день. Так, остается также открытым вопрос о механизме репликации как HBoV, так и других бокавирусов. Репликация представителей других родов, входящих в семейства Pm-voviridae (Erythrovirus, Parvovirus и Dependovirus) происходит по механизму катящейся шпильки (rolling hairpin mechanism) с образованием соединенных интермедиатов, имеющих структуру «голова к голове» или «хвост к хвосту». Однако в случае AAV (Dependovirus), для репликации которого требуется вирус-помощник, было также показано образование эписомальных кольцевых форм ДНК вируса [Musatov et al., 2002а; Musatov et al., 2002b; Chen et al., 2005]. В случае бокавирусов существует много свидетельств обнаружения эписомальных «голова к хвосту» форм вирусного генома. Впервые это было показано в работе Lusebrink с соавторами [Lusebrink et al., 2011], авторы которой обнаружили кольцевые формы для штаммов Bonn и Helsinki, принадлежащих к HBoVl, вскоре эписомальные структуры были найдены у штамма HBoV3 (JN086998) [Kapoor et al., 2011], штамма BJQ435 HBoV2 [Zhao et al., 2012], и у штамма HBoVl Salvador [Huang et al., 2012]. Кроме того, кольцевые формы геномной ДНК были найдены у других членов рода Bocaparvovirus: PBoV [Cheung et al., 2010; Yang et al., 2012] и CnBoV3 [Li et al., 2013]. В связи с этим возник вопрос - являются ли эти данные свидетельством отличного от других парвовирусов механизма репликации бокавирусов, или эписомальные формы возникают по иному пути, наряду с репликацией по модели катящейся шпильки, и обеспечивают персистенцию вируса в тканях хозяина. Единственная попытка обнаружить интермедиаты голова к голове» или «хвост к хвосту» была предпринята в работе Lusebrink и соавторов [Lusebrink et al., 2011], в ней были тестированы штаммы HBoVl Bonn и HBoVl Helsinki с использованием всех возможных сочетаний праймеров и показано отсутствие таких структур. В других работах искали только формы «голова к хвосту».
Следует отметить, что репликация по механизму катящейся шпильки предполагает образование (+)ДНК- и (-)ДНК-геномов в равном соотношении. Факт о преимущественном обнаружении (-)ДНК-геномов у бокавирусов является свидетельством в пользу отличного от данного механизма репликации. Впервые превалирование геномов отрицательной полярности было показано в работе Chen и соавторов и затем подтверждено в ряде исследований [Chen et al., 1986; Bohmer et al, 2009], впоследствии во всех исследованиях по поиску эписомальных форм ковалентно замкнутых ДНК бокавирусов были открыты структуры, соответствующие именно (-)ДНК-геномам. Известно, что геномы вирусов, относящихся к родам Amdovirus, Dependoviras, Erythrovirus и Pavtetravirus представлены в равной степени цепями обеих полярностей [Berns et al., 2007; Fryer et al., 2007; Ozawa et al., 1986; Bonvicini et al., 2006]. Однако, геномы MVM и Aleutian disease virus, относящихся к роду Pwvovirus, в основном обнаруживаются в виде (-)ДНК [Cotmore et al., 2003; Li et al., 2013]. Этот факт объясняется специфической укладкой (-)ДНК молекул в вирионы [Corsini et al., 2001; Willwand et al., 1991; Willwand et al., 1990]. В статье Chen и соавторов было предложено пересмотреть модель репликации катящейся шпильки бокавирусов на основе наблюдаемой ориентации концевых шпилечных структур парвовируса быков. При этом постулировалось, что данный феномен не является результатом селективной укладки, а скорее специфическим распределением репликативных форм [Chen et al., 1988].
В нашей работе впервые была предпринята попытка обнаружить репликативные формы генома редкого генотипа HBoV4, продемонстрировавшего значительные геномные отличия от ранее изученного HBoVl, и определить структуру концевых районов генома этого вируса. Уровень идентичности нуклеотидных последовательностей геномов HBoV4 и HBoVl составляет 75%, а таковой для аминокислотных последовательностей варьирует от 68% до 80%. Ранее концевые структуры были определены также для HBoV2 [Zhao et al., 2012] и HBoV3 [Kapoor et al., 2011], но эти генотипы, по-видимому, произошли в результате рекомбинации HBoVl и HBoV4 [Fu et al., 2011; Kapoor et al., 2009; Kapoor et al., 2010; Cheng et al., 2011; Babkin et al., 2013]. По нашим данным HBoVl дивергировал от бокавируса шимпанзе около 60-80 лет назад, а HBoV4 независимо отделился от бокавируса высших обезьян около 200-300 лет назад. В связи с этим представляет интерес изучение нерекомбинантных геномных последовательностей HBoV4, включающих концевые шпилечные структуры, и сравнение их с известными последовательностями других генотипов HBoV.
В ходе работы были впервые определены полные геномы двух новосибирских изолятов HBoV4. Протяженность их геномов составила 5095 н. Для поиска потенциальных репликативных интермедиатов бокавирусов мы разработали набор праймеров, позволяющий их выявить. С использованием этого набора были тестированы оба изолята HBoV4, а также изоляты, принадлежащие к другим генотипам HBoV. Этот подход не выявил ни в одном случае структур «голова к голове» или «хвост к хвосту», характерных для репликации по механизму катящейся шпильки. При этом, в случае изолятов HBoV4 RUS_NSC_11-N2657 и изолята HBoV2 RUS_NSC_10-N386 были детектированы структуры «голова к хвосту», соответствующие кольцевой форме вирусной ДНК.