Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Характеристика вируса ИЛТ .13
1.1.1. Классификация .13
1.1.2. Состав и морфология .13
1.1.3. Устойчивость к физико-химическим факторам 14
1.1.4. Структура генома .15
1.1.5. Репликация вируса .17
1.1.6. Биологические свойства вируса .28
1.1.7. Вакцинопрофилактика 29
1.1.8. Молекулярная эпидемиология 36
1.1.8.1. Диагностика и дифференциация 36
1.1.8.2. Полногеномное секвенирование .41
1.2. Заключение по обзору литературы 45
2. Собственные исследования 46
2.1. Материалы 46
2.1.1. Вирусы ИЛТ птиц .46
2.1.2. Нуклеотидные последовательности полных геномов изолятов и штаммов вируса ИЛТ опубликованные в базе данных GenBank .46
2.1.3. Наборы реактивов 47
2.1.4. Растворы, буферные смеси, реактивы и ферменты 48
2.1.5. Праймеры 49
2.1.6. Оборудование .51
2.1.7. Куриные эмбрионы 51
2.1.8. Естественно восприимчивые животные .52
2.2. Методы 52
2.2.1. Дизайн праймеров для ПЦР 52
2.2.2. Выделение суммарной нуклеиновой кислоты 52
2.2.3. ПЦР в режиме реального времени .52
2.2.4. Классическая ПЦР .54
2.2.5. Очистка продуктов ПЦР .57
2.2.6. Секвенирование амплифицированных фрагментов .57
2.2.7. Очистка и концентрирование вируса ИЛТ 59
2.2.8. Секвенирование последовательности генома .60
2.2.9. Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот 61
2.2.10. Выделение и культивирование вируса ИЛТ .61
2.2.11. Определение титра инфекционной активности вируса .62
2.2.12. Экспериментальное заражение естественно восприимчивых животных .63
2.2.13. Серологические исследования 64
2.2.14. Статистическая обработка результатов .64
3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 65
3.1. Анализ нуклеотидных последовательностей областей генома изолятов и штаммов вируса ИЛТ, представленных в GenBank 66
3.1.1. Анализ области гена ICP4 и полученных нуклеотидных последовательностей участка гена тимидинкиназы (ТК) и участка нетранслируемой области гена ICP4 (UTRICP4) штаммов и изолятов вируса ИЛТ, циркулирующих на территории РФ и представленных в GenBank .67
3.2. Определение и анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов изолятов Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643, Rus/Ck/Penza/2013/2701 и вакцинного штамма «О» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») вируса ИЛТ 73
3.2.1. Сравнительный анализ полученных последовательностей полных геномов и представленных в GenBank .74
3.2.2. Обнаружение и анализ наиболее вариабельного участка в полученных последовательностях полных геномов изолятов и штаммов вируса ИЛТ 80
3.2.3. Разработка метода идентификации сайта инициации репликации генома вируса ИЛТ с помощью ПЦР .84
3.2.4. Разработка метода дифференциации полевых изолятов и штаммов вируса ИЛТ с использованием ПЦР и нуклеотидного секвенирования 87
3.3. Изучение вирулентных свойств выделенных изолятов Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 и Rus/Ck/Penza/2013/2701 вируса ИЛТ, при экспериментальном заражении цыплят 4-недельного возраста 103
4. Заключение .115
4.1. Выводы 121
5. Практические предложения .122
6. Список использованной литературы .123
7. Приложения 141
- Репликация вируса
- Классическая ПЦР
- Сравнительный анализ полученных последовательностей полных геномов и представленных в GenBank
- Изучение вирулентных свойств выделенных изолятов Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 и Rus/Ck/Penza/2013/2701 вируса ИЛТ, при экспериментальном заражении цыплят 4-недельного возраста
Введение к работе
1.1 Актуальность темы. Инфекционный ларинготрахеит (ИЛТ) - это экономически
значимое респираторное заболевание сельскохозяйственных птиц, наносящее ущерб
птицеводству во всём мире. Возбудителем является ДНК-содержащий вирус семейства
Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesvirinae, таксономически идентифицируется как
Gallid herpesvirus 1 (GaHV-1) [3, 8].
ИЛТ характеризуется поражением слизистой верхних дыхательных путей и глаз у молодняка и взрослых кур, индеек, фазанов и павлинов. Болезнь протекает остро, подостро, хронически и не имеет выраженной сезонности. Источником инфекции служит больная и переболевшая ИЛТ птица. Основной путь распространения вируса - аэрогенный. Клинически выздоровевшая птица остаётся вирусоносителем в течение всей жизни. Реактивацию латентного вируса могут вызывать различные стрессовые факторы, приводя к развитию острой формы инфекции [3, 8, 9].
Заболеваемость и смертность варьируют в зависимости от вирулентности циркулирующего штамма и присутствия других возбудителей респираторных инфекций домашней птицы. Острые формы инфекции приводят к высокой заболеваемости, уровень смертности может превышать 50% [3, 8, 9]. Большие экономические потери, как правило, наблюдаются в районах с высокой плотностью птицеводческих хозяйств [8]. Профилактика ИЛТ осуществляется путем применения живых аттенуированных вакцин, также разработан ряд рекомбинантных векторных вакцин [2, 3, 8].
Для дифференциации полевых изолятов и вакцинных штаммов широко используются полимеразная цепная реакция (ПЦР) областей генома с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), полученных после обработки ампликонов специфическими рестриктазами, и последующим секвенированием продуктов ПЦР [8]. Однако, технологии полногеномного секвенирования, позволяющие провести полный анализ вакцинных штаммов и полевых изолятов, постепенно становятся основным инструментом исследований [5, 8]. Анализ геномов штаммов вируса ИЛТ стал отправной точкой для определения детерминантов вирулентности и аттенуации, а также сайтов рекомбинации, что может помочь в разработке более эффективных и безопасных живых аттенуированных вакцин [8]. Системы дифференциации полевых изолятов и вакцинных штаммов варьируют, в связи с тем, что набор участков-мишеней зависит от циркулирующих на данной территории штаммов и программ вакцинации [8].
Применение вакцин является эффективным способом профилактики ИЛТ, однако в мировой практике и на территории РФ данное заболевание продолжает наносить ущерб промышленному птицеводству. В связи с этим, актуальными задачами являются разработка и совершенствование методов диагностики и дифференциации полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса ИЛТ, изучение их биологических свойств, а также определение и анализ нуклеотидных последовательностей их полных геномов.
1.2 Степень разработанности проблемы. На сегодняшний день с помощью ПЦР-
ПДРФ анализа дифференцированы изоляты вируса ИЛТ в США, Южной Америке, Тайване,
Корее и Израиле (район Среднего Востока). Выбор участков-мишеней дифференциации изолятов зависит от географического района мира. Секвенирование гена ТК или гена ICP4 с прилегающими нетранслируемыми областями часто использовали при дифференциации изолятов вируса ИЛТ в Российской Федерации и ряде других стран [1, 7, 8], любой из этих двух генов был основополагающим в разработке быстрых и экономичных методов идентификации и дифференциации изолятов. Совместное использование полил оку сного ПЦР-ПДРФ анализа и секвенирования более двух генов давало высокую избирательную способность, необходимую для дифференциации изолятов [8].
На настоящий момент в базе данных GenBank опубликовано 26 нуклеотидных последовательностей полных геномов различных изолятов и штаммов вируса ИЛТ, при их сравнении с полными геномами отечественных изолятов и вакцинных штаммов открывается возможность проведения филогенетического анализа и выявления их генетических особенностей для определения оптимального набора участков-мишеней с целью разработки системы дифференциации полевых изолятов и штаммов вируса ИЛТ, циркулирующих не только в мире, но и на территории Российской Федерации.
1.3 Цель и задачи исследований. Основная цель данных исследований заключалась в изучении молекулярно-биологических свойств изолятов вируса ИЛТ, выявленных на территории Российской Федерации в период с 2012 по 2017 гг. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
а) провести исследования на наличие генома вируса ИЛТ методом полимеразной цепной
реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) полевых образцов биоматериала,
поступивших из птицефабрик Российской Федерации, и отбор выявленных полевых изолятов
для дальнейших исследований;
б) провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей областей генома
выявленных изолятов и штаммов вируса ИЛТ с представленными в базе данных GenBank;
в) оптимизировать метод очистки и концентрирования для получения препаратов вируса
ИЛТ, пригодных для определения нуклеотидной последовательности полного генома
методом высокопроизводительного секвенирования;
г) определить нуклеотидные последовательности полных геномов выделенных изолятов
вируса ИЛТ и изучить их филогенетические отношения с вакцинными штаммами, которые
применяются на территории Российской Федерации и с последовательностями штаммов,
представленных в GenBank;
д) разработать метод дифференциации полевых изолятов и штаммов вируса ИЛТ,
циркулирующих на территории Российской Федерации и в мире, на основе ПЦР и
нуклеотидного секвенирования;
е) провести апробацию разработанного метода дифференциации при диагностических
исследованиях вакцинных штаммов и изолятов вируса ИЛТ, выявленные в полевых образцах,
собранных на территории Российской Федерации в 2009 г. и в период с 2012 по 2017 гг.;
ж) изучить вирулентные свойства генетически охарактеризованных изолятов вируса
ИЛТ с использованием постановки биопробы на цыплятах.
1.4 Научная новизна исследований.
Впервые получены нуклеотидные последовательности полных геномов изолятов Rus/Ck/Tatarstan/2009/l 643, Rus/Ck/Penza/2013/2701, циркулирующих на территории Российской Федерации, и вакцинного штамма «О» вируса ИЛТ. Проведено их полное картирование и депонирование в GenBank (MF405079, MF405080, KU128407), а также генетический анализ. Изучены их филогенетические отношения с другими штаммами, последовательности которых представлены в GenBank. Впервые разработан метод, позволяющий провести идентификацию сайта инициации репликации (oriS сайт) генома вируса ИЛТ с помощью ПЦР. Впервые разработан метод, позволяющий провести дифференциацию полевых изолятов и штаммов вируса ИЛТ с использованием ПЦР и нуклеотидного секвенирования. Оптимизирован метод очистки и концентрирования, позволяющий получить препараты вируса ИЛТ для секвенирования нуклеотидной последовательности полного генома. Изучены биологические свойства выделенных изолятов Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 и Rus/Ck/Penza/2013/2701 вируса ИЛТ. Получены данные об их вирулентности, а также особенностям течения инфекционного процесса при заражении цыплят указанными изолятами.
1.5 Теоретическая и практическая значимость исследования.
Определены нуклеотидные последовательности полных геномов Российских изолятов Rus/Ck/Tatarstan/2009/l 643, Rus/Ck/Penza/2013/2701 и вакцинного штамма «О». Последовательности картированы и депонированы в базу данных GenBank (MF405079, MF405080, KU128407) и могут быть использованы для изучения молекулярно-биологических свойств вируса ИЛТ. Одобрены учёным советом и утверждены директором Федерального центра охраны здоровья животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие документы: «Методические рекомендации по очистке и концентрированию вируса ИЛТ», «Методические рекомендации по идентификации сайта инициации репликации генома вируса ИЛТ с помощью ПЦР», «Методические рекомендации по дифференциации полевых изолятов и штаммов вируса ИЛТ с использованием ПЦР и нуклеотидного секвенирования».
Штаммы ILTV/Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 и ILTV/Rus/Ck/Penza/2013/2701 вируса ИЛТ детально охарактеризованы и депонированы в Коллекцию ФГБУ «ВНИИЗЖ».
-
Методология и методы исследований. Методология проведенных исследований включает стандартные процедуры с использованием различных материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали молекулярно-биологические (ПЦР, секвенирование, пиросеквенирование, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, филогенетический анализ), вирусологические (виру совы деление, культивирование вируса, титрование вируса, постановка биопроб) методы исследований, а также очистку и концентрирование вируса.
-
Положения, выносимые на защиту:
а) результаты анализа полученных нуклеотидных последовательностей полных геномов изолятов Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643, Rus/Ck/Penza/2013/2701 и вакцинного штамма «О» вируса ИЛТ;
б) результаты апробации разработанного метода дифференциации при диагностических
исследованиях выявленных полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса ИЛТ;
в) вирулентные свойства изолятов Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 и Rus/Ck/Penza/2013/2701
вируса ИЛТ.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 2012-2017 гг. в референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ».
1.8 Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором
самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность коллективу референтной
лаборатории вирусных болезней птиц, научному руководителю - доктору биологических
наук Мудрак Наталье Станиславовне, канд. вет. наук Чвала И.А, канд. биол. наук Зинякову
Н.Г., канд. биол. наук Колосову С.Н., канд. биол. наук Андриясову А.В., канд. биол. наук
Андрейчуку Д.Б., Зинковскому Ю.В. и канд. вет. наук Кулакову В.Ю.
1.9 Степень достоверности и апробации результатов. Материалы диссертационной
работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и методической комиссии
ФГБУ «ВНИИЗЖ». Результаты исследований были опубликованы в материалах П-й
Международной научно-практической конференции молодых учёных «Инновационное
развитие науки в обеспечении биологической безопасности» (Казахстан, 2014 г.),
Международной научной конференции «Распространение и меры борьбы с особо опасными
болезнями животных и птиц» (Узбекистан, 2016 г.), IX Всероссийской научно-практической
конференции с международным участием «Молекулярная диагностика» (Москва, 2017 г.),
XX Всемирного конгресса ветеринарной птицеводческой ассоциации (Edinburgh, 2017 г.),
Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Наука и инновации в
АПК XXI века» (Казань, 2018 г.). Достоверность результатов исследований подтверждена
комиссионными испытаниями.
1.10 Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 научных
работ, в том числе 2 статьи в изданиях, включенных в Перечень ВАК Министерства
образования и науки Российской Федерации для докторских и кандидатских диссертаций.
1.11 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах
компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы,
результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, приложения;
иллюстрирована 19 таблицами и 34 рисунками. Список использованной литературы
включает 161 источников, из них 147 иностранный. В приложении представлены копии
титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее
научную новизну и практическую значимость.
Репликация вируса
Вирус ИЛТ обладает похожим механизмом репликации что и у других представителей рода Alphaherpesvirus [5, 14, 131] (рис. 4).
Цикл репликации начинается с прикрепления вируса к рецепторам клеток-мишеней. Вслед за этим происходит слияние вирусной оболочки с плазматической или эндосомной мембраной, а не фагоцитоз. Это согласуется с обнаружением на клеточной поверхности Fc-рецепторов оболочки вириона, в том числе и в тех случаях, когда проникновение вируса не приводит к экспрессии вирусных генов [112, 131]. Основываясь на данных полученных по HSV-1, белки, участвующие в прикреплении и слиянии включают структурные гликопротеины gC, gB, gD, gH, и gL. Процесс, начинается с взаимодействия gB и gC с гепарансульфат протеогликанами поверхности клеточной мембраны, с последующим взаимодействием gD, gB и gH-gL гетеродимерного комплекса для запуска слияние вирусной и клеточной мембран и высвобождения тегумента и нуклеокапсида в цитоплазму клетки-хозяина [17, 45, 97, 132, 148].
Нуклеокапсид проникая в цитоплазму клетки переносится к порам ядерной мембраны при участии цитоскилета, затем под контролем вирусных факторов вирусная ДНК выходит в нуклеоплазму. После того, как вирусная ДНК проникает в ядро клеток, транскрипция и репликация вирусной ДНК, формирование капсидов и их выход будут происходить в ядре инфицированной клетки-хозяина (рис. 5). Ремоделирование процессов клеточного ядра обеспечивает структурную основу для эффективной репликации вирусной ДНК и транскрипции его генов. [5, 22, 48, 77, 131].
Вирусная ДНК транскрибируется в ходе репродуктивного цикла клеточной РНК-полимеразой II, при участии на всех стадиях цикла ряда вирусных факторов. Синтез продуктов вирусных генов строго регулируется. Экспрессия вирусных генов строго координирована и представляет собой последовательно развернутый по времени каскад реакций [89]. Эксперименты по трансфекции плазмидами, экспрессирующими белки ICP4 и UL48 вируса ИЛТ показали, что эти два белка функционально гомологичные белку тегумента VP16 – активатор транскрипции -генов ДНК HSV-1 (рис. 4) [87, 144]. В настоящее время изучены по меньшей мере пять роста и репликации вируса в ходе его культивирования в клетках куриных групп генных продуктов, отличающихся друг от друга по характеру регуляции синтеза на транскрипционном и посттранскрипционном уровне. Указанные группы белков синтезируются последовательно одна за другой [83, 84, 95, 123]. Первыми экспрессируются -гены. Синтез -полипептидов достигает максимальной скорости приблизительно через 2-4 ч после инфицирования, затем скорость синтеза уменьшается [84]. Функционирование альфа-белков служит необходимым условием для синтеза последующих полипептидов. Продукты экспрессии -генов – полипептиды 1 и 2, достигают максимальной скорости синтеза примерно через 4-6 ч после инфицирования (рис. 6) [84, 89]. К Бета-полипептидам относятся ферменты, в том числе и ДНК-полимераза, и ДНК-связывающие белки, участвующие в репликации вирусной ДНК, а также -полипептиды участвуют в отключении синтеза -полипептидов, клеточных белков и в индукции -генов [5, 84, 85]. -Полипептиды также подразделяются на две группы – 1 и 2, различающиеся по условиям синтеза: если полипептиды-1 могут образовываться в отсутствие синтеза вирусной ДНК, то для образования полипептидов-2 необходима амплификация вирусной ДНК (рис. 6) [84, 106, 156]. Большинство идентифицированных к настоящему времени -белков являются компонентами вириона и в значительной степени участвуют в сборке вирионов, а также участвуют в процессе отключения синтеза клеточных белков сразу после заражения и индуцируют экспрессию -генов (рис. 6) [21, 66, 89].
С 4 часа после инфицирования (ч.п.и.), начинают экспрессироваться и 1 гены, при этом экспрессия гена 2 начинается с 8 ч.п.и. Увеличение титра вируса между 11 и 24 ч.п.и., с пиком вирусной репликации в течение этого периода [89]
В результате экспрессия генов по принципу каскада сводиться к тому, что продукты -генов вызывают индукцию -генов, продукты -генов выключают экспрессию -генов и индуцируют экспрессию -генов, а продукты -генов в свою очередь выключают экспрессию -генов и сразу же вслед за началом нового раунда инфицирования индуцируют экспрессию -генов [21, 84, 85, 89].
Отличительной особенностью герпесвирусов, является необычно большое число кодируемых ими ферментов, вовлеченных в синтез молекулы ДНК. Хотя последовательность событий при репликации вирусной ДНК в общих чертах известна, многие детали этого процесса еще предстоит изучить [5]. Было показано, что в клетках, заражённых HSV-1, репликации подвергается лишь небольшая часть всей ДНК вируса. Импульсно-меченая ДНК не содержит свободных концов, так как образует либо кольцевую, либо конкатемерную («голова к хвосту») форму [5, 91]. Имеющиеся данные показывают, что ДНК герпесвирусов в ходе репродуктивного цикла реплицируется по механизму катящегося кольца, одновременно могут происходить изомеризация и упаковка ДНК [24]. ДНК вируса содержит три начальные точки репликации (рис. 3). Две из них - oriS находятся в инвертированных повторах фланкирующих US область генома, а третья в UL области (рис. 3) [44, 67, 148, 160]. Сайты инициации репликации ДНК - oriS и oriL (рис. 3) обладают палиндромной структурой и образуют конфигурацию шпилька-петля (stem-loop). В центре палиндромов находятся АТ-богатые регионы и сайты связывания полипептида UL9 (origin-binding protein), инициирующего репликацию ДНК вируса (рис. 7 и 8) [26, 39, 91, 96, 98, 103, 153].
Классическая ПЦР
Классическую ПЦР проводили в одну стадию в программируемом амплификаторе с использованием набора термостабильной Taq ДНК-полимеразы GoTaq Flexi DNA Polymerase (Promega), двух олигонуклеотидных праймеров и Dream Taq ДНК-полимеразы (Fermentas). Перед началом сбора смеси размораживали все необходимые компоненты реакции, встряхивали на шейкере, затем центрифугировали несколько секунд на низкоскоростной центрифуге. Реакционная смесь для проведения ПЦР в расчете на одну реакцию (V=20 мкл) готовили следующим образом:
бидистилированная вода 8,75 мкл
буфер 5x для ПЦР 5,0 мкл
раствор MgCl2 (25 мМ) 3,0 мкл
раствор дНТФ (10 мМ) 1,0 мкл
раствор прямого праймера (10 пмоль/мкл) 1,0 мкл
раствор обратного праймера (10 пмоль/мкл) 1,0 мкл
Dream Taq ДНК-полимераза 0,25 мкл
Для амплификации фрагментов генома вируса ИЛТ методом классической ПЦР использовали пары праймеров, указанные в таблице 12.
Приготовленную реакционную смесь перемешивали, центрифугировали и вносили по 20 мкл в соответствующее количество пробирок объемом 0,2 см3. В пробирки с реакционной смесью добавляли 5 мкл выделенной суммарной нуклеиновой кислоты. Общий объем реакции составлял 25 мкл. На данном этапе исследований использовали положительный контрольный образец (проба, содержащая геном вируса ИЛТ). В соответствующие пробирки вносили выделенные образцы отрицательного и положительного контролей.
Поверх смеси наслаивали 15 мкл минерального масла, чтобы исключить возможность ее испарения, даже в случае использования амплификатора с подогреваемой крышкой. Пробирки центрифугировали.
Приготовленные пробирки устанавливали в амплификатор и запускали необходимую программу. Температурно-временной режим классической ПЦР представлен в таблице 13.
Для проведения второго этапа амплификации - «nested»-ПЦР с внутренними праймерами (ICP3 (nested), ICP4 (nested)) увеличивающими чувствительность реакции использовали аналогичный температурно-временной режим (табл. 13), но с меньшим количеством циклов амплификации – 25.
Результаты ПЦР учитывали путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в 1% агарозном геле. Для приготовления агарозного геля взвешивали 1 г агарозы, помещали в колбу, заливали до 100 см3 ТВЕ-буфера, ставили в микроволновую печь и доводили до кипения и до полного растворения агарозы. Охлаждали раствор до 45-50оС и добавляли 10 мкл 0,01% раствора бромистого этидия. Бромистый этидий – сильный канцероген. Все манипуляции с гелями и растворами, содержащими краситель, проводили в перчатках и избегали попадания на открытые участки кожи.
В ванночку для электрофореза вставляли специальные гребенки, заливали полученным раствором агарозы и ждали пока затвердеет (около 30 мин.). После полного затвердевания геля гребенки осторожно вынимали и ванночку с агарозным гелем переносили в камеру для горизонтального электрофореза. В камеру заливали 1-кратный ТВЕ-буфер так, чтобы он покрывал гель.
Из пробирок с исследуемыми образцами после завершения амплификации отбирали по 25 мкл реакционной смеси и вносили в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребенки. Постановка электрофореза осуществлялась с маркером молекулярного веса (Gene RulerTM 100bp DNA Ladder Plus) для того, чтобы при наличии в исследуемом образце полосы, соответствующей наработанному фрагменту, определить его длину и выявить специфичность данного фрагмента. Электрофорез проводили при напряжении 15 В/см длины геля в течении 20-25 минут.
Результаты электрофореза учитывают на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные в ПЦР фрагменты кДНК вируса ИЛТ выявляются в виде светящихся оранжевых полос соответствующей длины относительно маркера (табл. 12).
Сравнительный анализ полученных последовательностей полных геномов и представленных в GenBank
Сравнение последовательностей штамма «О» и изолятов Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643, Rus/Ck/Penza/2013/2701 с референтной последовательностью штамма Serva (HQ630064) показало, что полученные геномы содержат все 79 открытых рамок считывания (ОРС) с межгенными участками. Проведено их полное картирование и депонирование в GenBank (KU128407, MF405079, MF405080). В ходе картирования полученных нуклеотидных последовательностей полных геномов был выявлен ряд генетических особенностей (табл. 17).
В ходе анализа полученных последовательностей был выявлен ряд уникальных генетических особенностей, отличающих исследуемые штамм и изоляты от других, представленных в таблице 3. В последовательности генома штамма «О»: в позиции 18373 н. гуанин (G) меняется на аденин (А) (область гена UL50), в позициях 74684 н. и 75877 н. также G меняется на А (область гена UL43), что не приводит к изменению аминокислотного состава, при этом в генах US6 и US9, кодирующих поверхностные белки, ответственные за взаимодействие с клеточными рецепторами, выявлены значимые изменения нуклеотидной последовательности. Так в гене US6 в позиции 135992 н. замена G на А приводит к смене аминокислоты глицин (G, позиция 358 а.к.) на глутаминовую кислоту (E). В областях инвертированных повторов обнаружены нуклеотидные вставки в позициях 126719-126722 н. (IRS) и 139835-139838 н. (TRS), при этом последняя приводит к удлинению рамки считывания гена US9 вследствие смещения стоп-кодона. Кодируемая данным геном аминокислотная последовательность удлиняется на 20 а.к. (с 260 а.к. до 280 а.к.) и полностью меняет состав аминокислот в позиции 240-280 а.к. Геном штамма «О» показывает высокий уровень нуклеотидного сходства 99,97 - 99,98% с вакцинными штаммами Serva, Cover (LaryngoVac), Hudson (LT Blen), а также с Fowl laryngotracheitis.
В последовательности генома изолята Rus/Ck/Penza/2013/2701: в позиции 100285 н. G меняется на A (область гена UL8), в позиции 104787 н. T меняется на G (область гена UL5), в позиции 118832 н. С меняется на Т (область гена ICP4), что не приводит к изменению аминокислотного состава. В генах UL37 (кодирует белок отвечающий за морфогенез вирионов), UL-1 (кодирует белок LORF2) и UL47 (кодирует регулятор генов РНК-связывающий белок VP13/14, также модулирует трансактивирующий белок VP16) выявлены значимые изменения нуклеотидной последовательности. Так в последовательности гена UL37 в позиции 66730 н. замена G на А приводит к смене аминокислоты аланин (А, позиция 14 а.к.) на валин (V), в гене UL-1 в позиции 111371 н. Т меняется на С, вследствие чего серин (S, позиция 400 а.к.) меняется на глицин (G), а в UL47 в позиции 130682 н. A меняется на G приводя к тому, что аргинин (R, позиция 551 а.к.) меняется на глицин (G). Геном изолята Rus/Ck/Penza/2013/2701 показывает высокий уровень нуклеотидного сходства 99,98% с вирулентными штаммами 193435/07, 757/11 и 99,99% сходства с вирулентным штаммом 4787/80.
Генетические особенности в последовательности генома изолята Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 представлены в таблице 18. Наиболее высокий уровень нуклеотидного сходства геном изолята Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 показывает: 99,87% - с вакцинными штаммами SA2, А20 и 99,67% - с вирулентным рекомбинантным изолятом ILTVclass10. Уровень нуклеотидного сходства с остальными штаммами (табл. 6) находится в диапазоне 99,51 – 99,67%.
В ходе анализа нетранслируемых областей полученных геномов также были выявлены наиболее информативные участки, которые могут иметь практическую значимость для дифференциации полевых изолятов и штаммов вируса ИЛТ, в частности структура участка, содержащего oriS сайт, который является одним из сайтов инициации репликации ДНК данного вируса.
Последовательностям полных геномов, представленных в GenBank (длина анализируемой последовательности составляет 148969 н.)
В результате филогенетического анализа последовательностей полных геномов штаммов вируса ИЛТ (табл. 6), были определены основные филогенетические группы (учитывая топологию ветвей и время выделения анализируемых штаммов) (рис. 15).
Филогенетический анализ показал, что штамм «О» обладает высокой степенью родства с штаммами группы 1, подгруппы 1.1, и, в частности, вакцин LaringoVac, Poulvac, Nobilis, Fowl laryngo, LT Blen, TRVX (рис. 15). Изолят Rus/Ck/Penza/2013/2701 также обладает высокой степенью родства с штаммами группы 1, подгруппы 1.1, особенно с вирулентными 63140C08, 4787/80, 193435/07, 757/11. Изолят Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 показал наличие большого числа индивидуальных генетических особенностей и филогенетическое родство с вакцинными штаммами SA2 и А20 (группа 2) (рис. 15).
В результате сравнительного анализа последовательностей полных геномов был получен ряд данных об их индивидуальных генетических особенностях и филогенетических отношениях, необходимых для выявления оптимального набора генов-мишеней с целью создания системы дифференциации полевых изолятов и штаммов вируса ИЛТ.
Изучение вирулентных свойств выделенных изолятов Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 и Rus/Ck/Penza/2013/2701 вируса ИЛТ, при экспериментальном заражении цыплят 4-недельного возраста
В результате проведённого филогенетического анализа изолят Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 показал родство с вакцинными штаммами SA2 и А20 из Австралии, и был предположительно охарактеризован как вакциноподобный, при этом изолят Rus/Ck/Penza/2013/2701 показал высокую степень родства с вирулентным штаммом 4787/80 из Италии и предположительно охарактеризован как потенциально вирулентный (рис. 15, 17, 21, 22, 23, 24 и 25). Результаты филогенетического анализа по области, содержащей oriS сайт, и участкам генов sORF4/3-US2, UL27, ICP4, согласуются с данными, полученными при анализе нуклеотидных последовательностей полных геномов данных изолятов (рис. 15, 17, 21, 22, 23, 24 и 25).
В ходе эксперимента с изолятом Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 из клинических признаков у заражённых цыплят экспериментальной и контактной групп наблюдали только истечения из носовых пазух, что соответствовало одному баллу (рис. 26). У цыплят экспериментальной группы инкубационный период болезни составлял 4-6 суток, период развития болезни составлял не более 7 суток. Птицы контрольной группы оставались клинически здоровы на протяжении всего эксперимента.
Таким образом, в результате заражения цыплят изолятом Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 наблюдали проявление слабых клинических признаков и непродолжительный период развития болезни. В экспериментальной группе наблюдали протекание инфекции как в подострой, так и в латентной формах. В контактной группе преобладало латентное течение инфекции (рис. 26).
В ходе эксперимента с изолятом Rus/Ck/Penza/2013/2701 динамика развития клинических признаков у заражённых цыплят экспериментальной группы и контактной в среднем была следующей: вначале наблюдали носовые истечения (1 балл), далее опухание синусов и воспаление конъюнктивы (3 - 4 балла в сумме), после этого у цыплят регистрировали угнетенное состояние (4 – 5 баллов в сумме). Появление затруднённого дыхания и хрипов (6 – 7 баллов в сумме), в итоге приводило к гибели цыплят (рис. 27, 29). У цыплят экспериментальной группы инкубационный период болезни составлял 2-5 суток, период развития болезни – 8 и более суток. Птицы контрольной группы также оставались клинически здоровы на протяжении всего эксперимента. контакта n=9, с 10 по 17 сутки после контакта n=8) при заражении изолятом Rus/Ck/Penza/2013/2701
Таким образом, при заражении цыплят изолятом Rus/Ck/Penza/2013/2701 наблюдали клинически тяжёлое течение заболевания и длительный период развития болезни в экспериментальной и контактной группах, инфекция протекала в подострой и в острой формах (рис. 27, 29). У цыплят контактной группы, по сравнению с экспериментальной, наблюдали сокращение времени инкубационного периода, а также более быструю стадию нарастания симптомов, более продолжительный период развития болезни и относительно быстрое угасание клинических проявлений (рис. 27).
В ходе эксперимента с изолятом Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 количество клинически больных цыплят в первой подгруппе экспериментальной группы составляло - 10 (50%), в контактной – 2 (20%). Гибель цыплят не наблюдалось. Напротив, в эксперименте с изолятом Rus/Ck/Penza/2013/2701 количество клинически больных цыплят в первой подгруппе экспериментальной группы – 20 (100%), в контактной – 10 (100%) (рис. 28), при этом наблюдалась гибель цыплят.
Количество павших цыплят в первой подгруппе экспериментальной группы - 1 (на 9 сутки после заражения), во второй подгруппе экспериментальной группы - 3 (на 7, 9 и 10 сутки после заражения), что в сумме составляет 4 цыплёнка (9,5%) из 42 заражённых экспериментальной группы. В контактной группе пали 2 цыплёнка (на 7 и 10 сутки после контакта) из 10 (20%).
В ходе эксперимента с изолятом Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 при вскрытии убитых цыплят, в носовых пазухах отмечали наличие слизи и воспаления слизистой оболочки. В трахее наблюдали наличие небольшого количества экссудата, но не у всех из обследованных цыплят.
При вскрытии убитых цыплят, заражённых изолятом Rus/Ck/Penza/2013/2701, наблюдали наличие слизи и кровоизлияний в носовых пазухах, синусах и конъюнктиве. Отмечали наличие экссудата и воспаления слизистой в трахее различной степени тяжести. У отобранных цыплят на седьмые сутки после заражения было отмечено наличие экссудата и кровоизлияний в гортани и в верхней части трахеи. Образец такой трахеи был отобран для гистологического исследования (рис. 32).
При осмотре трупов погибших цыплят наблюдали наличие слизи в носовых пазухах, полное закрытие одного или обоих глаз вследствие опухания, кровоизлияния на конъюнктиве, опухание синусов с одной или с обеих сторон. При вскрытии в носовых пазухах наблюдали наличие экссудата, кровоизлияний, а также фибринозно-казеозные массы в виде пробок серо-жёлтого цвета в трахее, характерных для ИЛТ (рис. 30). Предположительно, птицы погибли вследствие асфиксии. Образцы трахей от погибших цыплят были отобраны для гистологического исследования (рис. 33), пробы решётчатой кости с синусами и трахеи от погибших цыплят были отобраны для исследований методом ПЦР-РВ (рис. 34). У цыплят контрольных групп при вскрытии патологоанатомических изменений обнаружено не было, микрофотография трахеи цыплят контрольной группы представлена на рис. 31.
В пробах трахеи, из которой был отобран образец для гистологического исследования (рис. 32, 33), методом ПЦР был выявлен геном вируса ИЛТ, а также выделен вирус на эмбрионах СПФ-кур. слизистого эпителия. Подслизистая сильно воспалена за счёт инфильтрации лимфоцитов, в просвете трахеи присутствует фибринозный экссудат
Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что изолят Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 обладает низким уровнем вирулентности, так как в результате заражения наблюдали незначительные клинические признаки болезни и патологоанатомические изменения в органах-мишенях у цыплят экспериментальной и контактной групп.
Изолят Rus/Ck/Penza/2013/2701 обладает выраженной вирулентностью, так как приводит к развитию тяжёлых патологоанатомических и клинических признаков ИЛТ и вызывает гибель цыплят (9,5-20%).
Полученные в результате экспериментального заражения данные о вирулентности указанных изолятов согласуются с результатами проведённого филогенетического анализа с использованием разработанного метода дифференциации (табл. 19).
Пробы органов, отобранные у цыплят экспериментальных групп, были исследованы методом ПЦР-РВ на выявление генома вируса ИЛТ и проведено вирусовыделение на эмбрионах СПФ-кур из проб трахеи и решётчатой кости с синусами (рис. 34).